全 文 ：胡椒属（Piper L.）为胡椒科（Piperaceae）重要的
泛热带成分， 是基部被子植物（Basal angiosperms）
中最大的属之一， 在传统木兰亚纲（Magnoliidae）中
显得非常独特[1]。 植物学家在过去的 30年中付出大
量努力试图发展一个完整的胡椒属分类系统， 但由
于该属是一个物种分化剧烈和分类处理困难的类
群， 起源的古老性、 物种的多样性、 花果的一致
性、 叶片的两型性等都大大增加了分类复杂性 [2]，
因此早期研究仅揭示了广泛的平行演化， 难以在亚
属或物种水平提供可靠结果。 分子技术的发展应用
为胡椒属系统关系研究注入了新活力， 国内外研究
人员利用 RAPD、 片段测序等技术进行了有益尝
试， 但尚未在属下建立相对完整的分类框架[3-5]。
DNA 条形码（DNA barcoding）是利用一个或少
数几个 DNA 片段对现有物种进行识别和鉴定的方
法[6]， 具有快速、 准确、 便捷等特点， 突破了对经
验的过度依赖， 能够在较短时间内建立易于利用的
应用系统， 是近年来国际生物多样性研究的热点之
热带作物学报 2013， 34（5）： 870-874
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-02-05 修回日期 2013-04-15
基金项目 国家自然科学基金项目（No. 31201263）； 农业部南亚热作专项（No. 12RZZY-13）。
作者简介 郝朝运（1979年—）， 男， 副研究员； 研究方向： 热带作物种质资源与植物多样性。 *通讯作者： 邬华松， E-mail： 13807622912@163.com。
胡椒属植物 DNA条形码初步研究
郝朝运 1，2，3， 邬华松 1，2，3 *， 范 睿 1，2，3， 杨建峰 1，2，3
吴 刚 1，2，3， 马腾飞 4， 秦晓威 1，2，3
1 中国热带农业科学院香料饮料研究所， 海南万宁 571533
2 农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室， 海南万宁 571533
3 海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室， 海南万宁 571533
4 云南大学生命科学学院， 云南昆明 650091
摘 要 为筛选胡椒属 DNA 条形码最佳片段， 研究了 ITS、 rbcL、 psbJ-petA 和 matK 基因片段的有效使用性、
种内种间变异和 barcoding gap， 并评估了序列鉴定效率。 结果显示： ITS 和 matK 的 barcoding gap 图相对较好，
matK 物种水平鉴定成功率高， ITS 种间变异较大， 而其他 2 个候选序列不能进行有效鉴定。 为此， 推荐 matK 和
ITS 作为胡椒属植物潜在的 DNA 条形码序列， 并依此探索建立该属的 DNA 条形码鉴定方法。
关键词 胡椒属； DNA 条形码； ITS； psbJ-petA； matK； rbcL
中图分类号 Q949.732.3 文献标识码 A
DNA Barcoding in Genus Piper
HAO Chaoyun1,2,3, WU Huasong1,2,3, FAN Rui1,2,3, YANG Jianfeng1,2,3
WU Gang1,2,3, MA Tengfei4, QIN Xiaowei1,2,3
1 Spice and Beverage Research Institute, CATAS, Wanning, Hainan 571533, China
2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops,
Ministry of Agriculture, Wanning, Hainan 571533, China
3 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulatioin for
Tropical Spice and Beverage Crops, Wanning, Hainan 571533, China
4 School of Life Sciences, Yunnan University, Kunming, Yunnan 650091, China
Abstract In order to screen right DNA regions in Piper, four candidate DNA barcodes with three (rbcL, psbJ-
petA, matk) from chloroplast genome and one (ITS) from the nuclear genome, were evaluated in view of 35 self-
testing accessions and 282 ones from NCBI. Capability of the four candidate DNA barcodes was evaluated by
effectiveness, intra-and inter-specific divergence and barcoding gap analysis, and the identification efficiency was
also assessed using Neighbour-Joining method. The results showed that ITS and matK candidate barcodes had
clear barcoding gap. At the same time, matK had high species identification reliability, and ITS had high
significant divergence at species level. The other two candidate barcodes had no clear barcoding gap. matK and
ITS might be the potential DNA barcoding for the identification of Piper plants, thus making the establishment of
new identification methods for this genus possible.
Key words Piper; DNA barcoding; ITS; rbcL; psbJ-petA; matK
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.05.013
第 5 期 郝朝运等： 胡椒属植物 DNA条形码初步研究
表 1 不同 DNA 序列扩增获得的有效序列比例
候选序列 扩增成功率/％ 测序成功率/％ 序列有效使用率/％
ITS 100 96.6 96.6
rbcL 100 93.1 93.1
psbJ-petA 100 82.8 82.8
matK 100 93.1 93.1
一。 单靠一个片段很难对所有物种进行准确鉴定，
研究者相继提出了不同的片段组合方案 [7-8]， 而同
一个组合方案未必适用于所有植物分类群 [9-10]。 因
此， 针对不同植物分类群， 有必要开展 DNA 条形
码片段筛选研究。
本研究选取重点推荐的 ITS、 rbcL、 psbJ-petA
以及 matK 共 4 个候选序列， 比较其对胡椒属植物
的鉴别能力， 考察作为通用序列的适用性， 以期为
DNA 条形码技术在胡椒属植物鉴定和分子系统分
类学研究中的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料为胡椒属 12 种、 35 份样本， 来源于
农业部万宁胡椒种质资源圃。 其他数据由 NCBI 数
据库下载， 包括该属 47 种、 282 份样本， 其中 ITS
序列 32 种 、 105 份 ， rbcL 序列 16 种 、 84 份 ，
psbJ-petA序列 19种、 42份， matK序列 12种、 51份。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取、 扩增与测序 取约 100 mg 幼
嫩叶片， 利用基因组 DNA 提取试剂盒（天根生化科
技有限公司）提取总 DNA。 UV-2102 型紫外可见分
光光度计测定浓度和纯度， 琼脂糖凝胶电泳法检测
DNA 质量， 浓度稀释为 50 ng/μL 备用。 候选序列
ITS 和 psbJ-petA 通用引物与 PCR 反应条件见参考
文献 [11]， rbcL 通用引物和反应条件见参考文献 [12]，
matK 引物序列来自韩国 Ki-Joong Kim 研究员。 琼
脂糖凝胶回收纯化扩增产物， ABI 3730XL 测序仪
（Applied Biosystems Co., USA）测序。
1.2.2 数据处理 峰图经 CodonCode Aligner 2.06
校对拼接后， 用 CLUSTALX 1.83比对。 MEGA 4.0[13]
计算各 DNA 片段 Kimura-2-parameter（K2P）遗传距
离， 比较不同序列种内种间变异大小， Kolmogorov-
Smirnov 法[14]检验计算结果， 同时利用 TAXON DNA
软件 [15]制作 Barcoding Gap 图。 参考 Hollingsworth
等[16]同类物种 “grouping together” 原则， 每个种所
有个体聚为一个单系分支则认为鉴定正确。 以草胡
椒（Peperomia pellucida）为外类群构建系统发生树，
分析不同候选序列对胡椒属植物的鉴定有效性[17]。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增效率与测序成功率
本研究对候选序列的 PCR 扩增效率（出现明显
PCR 条带即判定为成功）、 测序成功率（测序后成
功获得高质量序列即判定为成功）及序列有效使用
率（序列有效使用率=PCR 扩增效率×测序成功率）
进行统计（表 1）。 4 个候选序列的扩增成功率均达
100％， 仅测序成功率存在差异， 但差异不明显。
可见， 候选序列均获得较高的有效使用率， 扩增通
用性较好， 可用于进一步研究。
2.2 不同候选序列种内种间差异分析
理想的 DNA 条形码序列应当具有明显的种间
变异， 同时种内变异足够小。 在原有 DNA 条形码
序列变异分析方法 [17]基础上， 引入 “种间最小变
异” 来应对种内最大变异。 由表 2 可见， ITS 序列
的种间变异最大， psbJ-petA 和 matK 次之， rbcL
最小。 各序列种内变异则以 psbJ-petA 最大， rbcL
和 ITS次之， matK最小。 ITS和 matK的种间最小变
异明显大于其种内最大变异， 有利于物种鉴别， 而 rbcL
和 psbJ-petA则相反。 利用 Kolmogorov-Smirnov检验
比较两两序列种间和种内变异的差异情况（表 3、 4），
结果显示， 不论种间还是种内变异， 序列间差异均
达到显著性水平（p<0.05）。
项目 ITS rbcL psbJ-petA matK
种间遗传变异 0.123 9±0.002 9 0.013 9±0.001 3 0.047 4±0.001 6 0.021 7±0.001 0
种内遗传变异 0.004 3±0.000 7 0.007 7±0.001 8 0.018 7±0.003 3 0.000 7±0.000 2
种间最小变异 0.037 7±0.005 8 0.005 9±0.002 5 0.021 8±0.003 1 0.010 8±0.002 3
种内最大变异 0.008 4±0.003 3 0.026 5±0.019 6 0.038 2±0.011 3 0.002 1±0.001 1
表 2 候选序列的种间及种内差异
871- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
A. ITS； B. rbcL； C. psbJ-petA； D. matK
K2P genetic distance
Inter-specific
Intra-specific
0～0.03 0.03～ 0.06～ 0.09～ 0.12～ 0.15～ 0.18～ 0.21～ 0.24～ 0.27～
0.06 0.09 0.12 0.15 0.18 0.21 0.24 0.27 0.30
Di
str
ib
ut
io
n
fo
r
va
ria
tio
n/
％
120
100
80
60
40
20
0
K2P genetic distance
Di
str
ib
ut
io
n
fo
r
va
ria
tio
n/
％
0～0.005 0.005～ 0.010～ 0.015～ 0.020～ 0.025～ 0.030～ 0.035～ 0.040～ 0.045～ 0.050～ 0.055～
0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 0.045 0.050 0.055 0.060
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Inter-specific
Intra-specific
A B
Inter-specific
Intra-specific
Inter-specific
Intra-specific
K2P genetic distance
Di
str
ib
ut
io
n
fo
r
va
ria
tio
n/
％
K2P genetic distance
Di
str
ib
ut
io
n
fo
r
va
ria
tio
n/
％
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0～ 0.01～ 0.02～ 0.03～ 0.04～ 0.05～ 0.06～ 0.07～ 0.08～ 0.09～
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10
0～ 0.004～ 0.008～ 0.012～ 0.016～ 0.020～ 0.024～ 0.028～ 0.032～ 0.036～
0.004 0.008 0.012 0.016 0.020 0.024 0.028 0.032 0.036 0.040
C D
图 1 4 个候选序列的 barcoding gap 图
2.3 不同序列 barcoding gap图分析
衡量 DNA条形码的重要指标是 “barcoding gap”
是否存在， 即种内变异足够小而种间变异足够大，
从而在种间形成一个明显间隔区 [17]。 理想状态下，
种内变异在柱形图上集中在数值较小的左侧， 而种
间变异集中在数值较大的右侧。 本研究利用 TAXON
DNA软件对候选序列进行分析， 由图 1可见， rbcL
和 psbJ-petA 的种内和种间遗传变异重叠比例大，
没有明显的 barcoding gap， 而 ITS和 matK的种内变
异幅度和变异样本比例较小， 且其 barcoding gap
图分别仅在 0～0.06 和 0～0.008 处稍有重叠， 遗传
变异重叠较小。
K+ K- 最大差分 柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫值 结果
ITS rbcL 0.847 7.842 ITS>rbcL， p<0.05
ITS psbJ-petA 0.700 7.182 ITS>psbJ-petA， p<0.05
ITS matK 0.854 6.491 ITS>matK， p<0.05
rbcL psbJ-petA 0.828 6.372 rbcL
表 3 候选序列种间差异的 Kolmogorov-Smirnov 检验
K+ K- 最大差分 柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫值 结果
ITS rbcL 0.155 1.553 ITS
rbcL psbJ-petA 0.580 3.053 rbcL
psbJ-petA matK 0.754 3.674 psbJ-petA>matK， p<0.05
表 4 候选序列种内差异的 Kolmogorov-Smirnov 检验
872- -
第 5 期
2.4 候选序列鉴定效率评估
鉴定能力是评价条形码序列优劣的标准之一。
利用邻接法（Neighbour-Joining）对候选序列系统树
单系性进行比较， 由图 2 可见， matK 鉴定能力最
高， 达到 100％， ITS 和 psbJ-petA 的正确率接近，
处于中等水平， rbcL 最低， 4 个候选片段鉴定效率
均高于 60％。
3 讨论与结论
胡椒属植物分化时间过短 [18]， 种间形态变异水
平较低， 许多种类外形特征极为相似， 如变叶胡椒
和山蒟[19]、 P. wichmannii 和卡瓦胡椒[20]等， DNA 分
子标记可以从根本上揭示植物内在基因差异， 可为
该属植物准确鉴定和系统学研究提供重要依据。 本
研究选用的 4 个候选片段通用性均比较好 ， 仅
psbJ-petA 有效使用率低于 90％。 相对而言， ITS
和 matK 种内变异幅度和变异样本比例明显较小，
遗传变异重叠较小， barcoding gap图相对较好， 有
利于物种鉴定 [17，21]； 而 rbcL 和 psbJ-petA 的种内和
种间变异重合过多， 难以有效区分。
单一片段很难对所有植物进行准确鉴定， 研究
者针对性提出了不同片段组合方案。 从本研究结果
看， matK 序列有效使用率和物种鉴定效率均比较
高， barcoding gap图相对较好， 但该序列种间变异
偏小， 原产于不同国家的 24 种胡椒属植物平均种
间变异仅为 0.021 7±0.001 0。 同时， ITS 序列鉴定
效率偏低， 但其具有长度保守性和核苷酸高度变异
性等特点[9, 21-23]， 种间变异高达 0.123 9±0.002 9， 对
于地理分布范围广、 物种资源丰富的胡椒属非常必
要。 因此， 笔者推荐 matK+ITS 作为胡椒属植物潜
在的 DNA 条形码片段组合， 并依此探索建立该属
的 DNA条形码鉴定方法
由于已公布的胡椒属片段序列有限， 本研究获
得的样本数量偏小， 该结果还需更多研究验证。 同
时， 为避免因采用不同植株序列进行组合而造成分
析误差， 本研究未进行不同片段组合分析， 下一步
有必要对胡椒属植物不同物种和相同物种不同植株
的候选序列片段进行克隆， 以分析不同片段组合在
该属种水平的鉴定有效性。
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ITS rbcL psbJ-petA matK
120
100
80
60
40
20
0
Id
en
tif
ic
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％
Candidate sequences
图 2 胡椒属植物 Neighbour-Joining 树单系分支百分比
郝朝运等： 胡椒属植物 DNA条形码初步研究 873- -
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