全 文 ：基因组学与应用生物学，2011年，第 30卷，第 1期，第 62-71页
Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.1, 62-71
研究报告
A Letter
三种人参属植物的 EST-SSR信息分析及其在三七中的应用
杨维泽 1,2 金航 1,2 崔秀明 3 沈涛 1 杨美权 1 张金渝 1,2*
1云南省农业科学院药用植物研究所,昆明, 650223; 2昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明, 650091; 3文山三七科学院,文山, 663000
*通讯作者, jyzhang2008@126.com
摘 要 为了解人参属植物 EST中 SSR分布特点及其在三七 SSR标记中的应用，利用生物信息学方法，用
primer 3软件对 dbEST数据库中人参属植物人参、西洋参和三七的 EST序列进行搜索，发现人参属植物
EST-SSR出现频率为 11.54%，平均每 4.39 kb出现 1个 SSR。人参属植物单核苷酸重复基元占主导地位，其
次为三核苷酸重复基元和二核苷酸重复基元，分别占总 SSR的 54.48%、17.31%和 16.36%。人参属 EST-SSR
的优势类型为 A/T和 AT/TA，分别占 54.73%和 8.21%。根据人参属植物 EST中的 SSR设计 48对引物，在合
适的 PCR扩增体系下，用 5个三七样品的 DNA为模板进行 PCR扩增，引物有效扩增率 85.42%，其中多态
性引物占可扩增引物的 70.73%。结果表明，利用人参属 EST序列开发三七 EST-SSR标记是可行的。
关键词 人参属,三七, EST-SSR
Analysis on EST-SSR of Three Species in Genus Panax and the Application
in Panax notoginseng
YangWeize 1,2 Jin Hang 1,2 Cui Xiuming 3 Shen Tao 1 YangMeiquan 1 Zhang Jinyu 1,2*
1 Institute of Medicinal Plant, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming, 650223; 2 Faculty of Life Science and Technology, Kunming Uni-
versity Science and Technology, Kunming, 650091; 3 Wenshan Sanqi Research Institute, Wenshan, 663000
* Corresponding author, jyzhang2008@126.com
DOI: 10.3969/gab.030.000062
Abstract In order to know the peculiarity of EST-SSR in three species of genus Panax and using in Panax noto-
ginseng, with bioinformatics method, the EST sequences of Panax ginseng C. A. Mey., Panax quinque foliusm L.
and Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen were searched in dbEST database by using software primer 3. The fre-
quency of EST-SSR was 11.54%, and the average distance between SSR was 4.39 kb. Mononucleotide repeats, ac-
counting for 54.48%, was dominant in all SSR, followed by trinucleotide and dinucleotide repeats, 7.31% and
16.36% . The most abundant motifs were A/T and AT/TA, accounted for 54.73% and 8.21% . According the
EST-SSR of genus Panax to designed 48 primer pairs. Under a suitable PCR system, primers were screened against
5 DNA samples of Panax notoginseng, the effective rate of the primer amplification rate was 85.42%, and the pro-
portion of polymorphic primers was 70.71%. The results indicated that it was feasible to development EST-SSR
makers by using the EST sequences in genus Panax.
Keywords Genus Panax, Panax notoginseng, EST-SSR
基金项目：本研究由国家“十一五”科技支撑项目(2006BAI06A12-13)和云南省自然科学基金项目(2007C136M)共同资助
简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)是
由 1~6个碱基为重复单元的串联重复序列，主要以
2~3个核苷酸为重复单位，广泛分布于大多数真核生
物基因组(张增翠和侯喜林, 2004)。SSR标记具有较
高的多态性，是共显性遗传，且有技术操作简单、重
复性好和特异性强等优点(Powell et al., 1996)。表达
系列标签(expressed sequence tag, EST)是指通过来自
于 cDNA文库中随机克隆进行测序所得的 cDNA的
5或者 3端序列，一般长度为 150~500 bp (骆蒙和贾
继增, 2001)。自从 Adams等(1991)首次提出 EST概
念后，EST技术取得了飞速发展，1991年各个公共数
据库中的 EST数目不足 2000条，到 2010年 4月 2日，
NCBI 中的 dbEST 数据库已收集 1 978 种物种的
ESTs，共 65 255 769 条。大量的 EST 信息为搜索
SSR提供了有利的条件，该信息来源广、成本低且具
有很高的通用性，EST-SSR标记技术得到了推广应
用。目前 EST-SSR标记技术已成功应用于茶树(金基
强等 , 2006a)、白菜 (忻雅等 , 2006b)、丹参 (宋杰等 ,
2009)、核桃(朱艳等, 2009)、油菜(李小白等, 2007b)、人
参(杨成君等, 2008)和木薯(韦祖生等, 2008)等植物中，
并应用于其基因组学和遗传多样性的研究。
人参(Panax ginseng C. A. Mey.)、西洋参(Panax
quinque foliusm L.)和三七(Panax notoginseng (Burk) F.
H. Chen)为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)重要的药
用植物(国家药典委员会, 2010,中国医药科技出版社,
pp.20-21)。三七作为我国传统名贵中药材，有很高的药
用价值。目前对三七的研究主要集中在其化学成分和
栽培技术上，在分子方面研究较少，以 EST为基础开
发引物则属于首次，本研究以 Genebank数据库的人
参属 EST (包括人参的 7 816条,西洋参的 4 988条,三
七的 93条)进行 EST-SSR信息全面分析，建立 EST-
SSR标记，并对它们的多态性作了分析和评价，为其在
三七遗传多样性及遗传育种中的应用奠定基础。
1结果与分析
1.1三种人参属植物 EST-SSR发生频率与特点
对来自 NCBI数据库 12 267条人参属 EST，其
中人参 7 186条、西洋参 4 988条、三七 93条进行了
SSR搜索，结果 1 415条 EST中分布着 1 681条SSR，
占 EST总数的 11.54%。从发生频率来看，单核苷酸
重复基元共出现 983次，占 SSR总数的 58.48%，其
次是三核苷酸和二核苷酸，两者发生的频率基本相
近，分别出现 292次和 275次，分别占人参属 SSR总
数的 17.37%和 16.36%；其它重复类型所占比例均不
足 4.00%，四核苷酸重复基元种类出现较多，为 36种，
六核苷酸重复基元和五核苷酸重复出现频率相同都为
35次。出现频率以单碱基最多，为 7.509 kb就出现
1次，两碱基和三碱基出现的频率相差不多，分别为
26.841 kb和 25.279 kb出现 1次，五碱基和六碱基出
现的频率相同，都为 210.897 kb出现 1次(表 1)。
人参属 EST 中含有丰富的 SSR 重复基元，在
1 415条 EST中的 1 681个 SSR重复基元中，共出现
137种重复基元类型，其中 A/T、AT/TA重复基元占
绝对优势，分别出现 920次和 138次，占 SSR总数的
54.73%和 8.21%，其它碱基重复基元出现的频率都
很低(表 2)。
从重复基元的重复特性来看，人参属的 EST-SSR
重复基元可分为完全重复基元和不完全重复基元，
分别为 1 424个和 257个，所占百分比为 84.71%和
15.29%，完全重复占了绝对优势(表 3)。人参属 EST
中 SSR的平均长度约 26.83 bp，不同的 SSR长度有很
大差异，最短的为 12 bp，最长的为 177 bp。
1.2 EST-SSR引物筛选和多态性检测
以 5个三七样品的 DNA为模板，对设计的 48对
重复类型
Repeat type
单碱基
Mononucleotide
两碱基
Dinucleotide
三碱基
Trinucleotide
四碱基
Tetranucleotide
五碱基
Pentanucleotide
六碱基
Hexanucleotide
总计
Total
重复基元种数
Repeat primitives number
4
7
29
36
26
35
137
SSR数
SSR number
983
275
292
61
35
35
1 681
占全部 SSR比例(%)
Proportion by total SSR (%)
58.48
16.36
17.37
3.63
2.08
2.08
100.00
出现频率(kb)
Frequency (kb)
7.509
26.841
25.279
121.006
210.897
210.897
602.429
表 1人参属 EST中 SSR的出现的频率
Table 1 Frequency of SSRs occurred in ESTs of genus Panax
三种人参属植物的 EST-SSR信息分析及其在三七中的应用
Analysis on EST-SSR of Three Species in Genus Panax and the Application in Panax notoginseng 63
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
表 2人参属 EST中 SSR重复基元类型
Table 2 The repeat type of SSRs in ESTs of genus Panax
重复类型
Repeat type
单碱基
Mononucleotide
两碱基
Dinucleotide
三碱基
Trinucleotide
四碱基
Tetranucleotide
五碱基
Pentanucleotide
六碱基
Hexanucleotide
重复碱基
Repeat primitive
A/T
G/C
AT/TA
TC/GA
AG/CT
TG/CA, AC/GT, CG, GC
GAA/TTC
AGA/TCT
CCA/TGG
ATA/TAT
AAG/CTT
ATC/GAT
CTC/GAG
CAG/CTG, GGA/TCC, GCA/TGC, AGC/GC, AAT/ATT, TAA/TTA,
AGG/CCT, ACC/GGT, CAC/GTG, GCC/GGC, CTA/TAG, ATT,
GTA/TAC, CAA/TTG, TCA/TGA, CCG/CGG, ATG/CAT, ACT,
GAC/GTC, CGA, ACA, AAC/GTT
AAAC, AAAG/CTTT, AATA、AATT, ACAG, ACCA,
ACTC/GAGT, AGAT/ATCT, AGCT, AGTG, ATAC, ATGT, ATTT,
CAAA, CACC, CATT, CCTC, CGCC, CGTA/TACG, CTCA,
GAAA/TTTC, GACG, GGCT, GGGA, TAAT, TACA, TATG,
TCAA, TCAC, TCCC, TCTA, TCTG, TCTT, TGCA, TTCT, TTTA
AAATA, AACAA, AATCA, ACCAA, AGCAC, AGGGG, ATAAA,
CAAAA, CACCC, CACTG, CTGTC, CTTGT, GAAAA, GAGGA,
TGCCC, TGGCT, TGTTG, TTTAA, TTTCT, CCTCC, TGGTT,
GTTTG, GAAGG, CAATC, GTGGA, ATGTG
ATGGGA, ATGGGG, CAAAAT, CACCTC, CCACCT, CCACGC,
CCATAA, CCATCT, CCCCCG, CCCGGC, CCCGGT, CCGATT,
CCGTGC, CTCAAC, CTCCAC, CTCCAT, CTCCTT, CTGCCG,
GAATCA, GACCTG, GCACCT, GGAGCA, GGGAAA, GGTCAT,
GGTCTA, GGTGAG, GTGGTA, TAGCTG, TATGAT, TCATCC,
TCCCTG, TCTAAA, TGACCC, TTGATT, TTGCTG
出现数量
Occurred No.
920
63
138
67
51
19
28
22
18
17
17
16
15
149
61
35
35
发生频率(%)
Frequency (%)
7.50
0.51
1.12
0.55
0.42
0.15
0.23
0.18
0.15
0.14
0.14
0.13
0.12
1.21
0.50
0.29
0.29
比例(%)
Proportion (%)
54.73
3.75
8.21
3.99
3.03
1.13
1.67
1.31
1.07
1.01
1.01
0.95
0.89
8.86
3.63
2.08
2.08
表 3人参属 EST中 SSR重复长度和性质
Table 3 The repeat length and attribute of SSRs in ESTs of genus Panax
重复类型
Repeat type
单核苷酸
Mononucleotide
两核苷酸
Dinucleotide
三核苷酸
Trinucleotide
四核苷酸
Tetranucleotide
五核苷酸
Pentanucleotide
六核苷酸
Hexanucleotide
合计
Total
变化范围
Variation
18~177
14~170
12~107
16~70
20~38
20~69
12~177
平均长度
Average length
38.28
23.16
19.73
21.93
24.69
33.20
26.83
完全重复
Complete repeat
794
257
266
54
24
29
1 424
不完全重复
Incomplete repeat
189
18
26
7
11
6
257
总计
Total
983
275
292
61
35
35
1 681
长度(bp)
Length (bp)
重复性质
Repeat attribute
64
三种人参属植物的 EST-SSR信息分析及其在三七中的应用
Analysis on EST-SSR of Three Species in Genus Panax and the Application in Panax notoginseng
引物进行扩增，有 41对能扩增出有效产物，占所设
计引物的 85.42%。由表 4可以看出人参属 EST-SSR
引物在三七中具有较高的多态性。
为明确所设计引物在三七中的可用性，本研究用
丘北县树皮乡(QBA)、文山县柳井乡(WSA)的样品各
10个材料，文山县马塘镇(WSB)的 5个材料进行测
试，发现有 29对引物具有多态性，占有效扩增引物的
70.73%。图 1为 RS7在同一居群和不同居群间的多
态性扩增情况，从图上可看出利用以数据库中 EST
为基础的 SSR标记，不仅可区分不同居群，而且可以
有效标记出居群间的多态性。由此可看出，利用 EST
数据库建立多态性 EST-SSR标记是有效可行的。
2讨论
本试验对 3种人参属植物的 EST进行分析，发现
含有 SSR的 EST占 EST序列总数的13.70%，与其它
植物相比，人参属 EST-SSR出现的频率处于较高水
平，目前报道的物种中，最高的为烟草(61.23%) (张俊
娥等, 2007)、茶树(17.68%) (金基强等, 2006b)和丹参
(18.35%) (宋杰等, 2009)，这些物种的高于人参属的，
但大多数植物的 EST-SSR出现的频率低于人参属，
如甜瓜(8.16%) (胡建斌等, 2009)、香菇(4.21%) (林范
学等 , 2007)、橡胶 (9.01%) (华玉伟等 , 2008)、玉米
(7.25%) (赵美琼等, 2008)、黄瓜(12.08%) (胡建斌和
李建吾, 2008)、木薯(11.02%) (彭丁文等, 2008)和白菜
(10.34%) (忻雅等, 2006a)等等，杨成君等(2008)利用软
件 SSRIT搜索人参 SSR，出现频率为 11.21%，略低于
软件 primer 3搜索的，说明不同软件搜索的结果会有
一定的差异，但差异不大。不同物种间 EST-SSR出现
频率的差异可能是物种间 SSR信息表达的差异或是
不同软件及其所设置参数的不同所致。
注: A:预期大小片段; B:为无预期大小片段,但有扩增; AB:同时出现预期大小片段和非预期大小片段; P:有多态性; NP:无多态性
Note: A: Fragments size expected; B: Fragments size not expected, but amplification; AB: Fragments size expected and not expected;
P: Polymorphism; NP: No polymorphism
表 4 48对人参属 EST-SSR引物在 5个三七材料中的扩增情况及多态性
Table 4 The amplifications and polymorphisms of 48 EST-SSR primers in 5 different samples of P. notoginseng
引物
Primer
RS1
RS2
RS3
RS4
RS5
RS6
RS7
RS8
RS9
RS10
RS11
RS12
RS13
RS14
RS15
RS16
扩增情况
Amplification
AB
AB
AB
AB
AB
AB
A
AB
AB
A
N
AB
AB
AB
A
AB
多态性
Polymorphism
P
NP
P
NP
P
P
NP
P
P
P
NP
P
P
P
NP
NP
引物
Primer
RS17
RS18
RS19
RS20
RS21
RS22
RS23
RS24
RS25
RS26
RS27
RS28
RS29
RS30
RS31
RS32
扩增情况
Amplification
AB
AB
AB
A
AB
AB
AB
AB
AB
AB
B
AB
N
N
N
AB
多态性
Polymorphism
P
P
NP
NP
NP
NP
NP
NP
P
NP
P
P
NP
NP
NP
P
引物
Primer
RS33
RS34
RS35
RS36
SQ1
SQ6
SQ2
SQ4
SQ5
XS1
XS2
XS3
XS4
XS5
XS6
XS7
扩增情况
Amplification
AB
N
N
AB
N
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
AB
多态性
Polymorphism
P
NP
NP
P
NP
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
图 1 EST-SSR引物 RS7在不同三七居群间多态性扩增结果
注:从左至右: 1~10为 QBA; 11~20为WSA; 21~25为WSB
Figure 1 The amplication of EST-SSR primer RS7 in different
populations of P. notoginseng
Note: From left to right: 1~10 are QBA; 11~20 are WSA; 21~25
are WSB
65
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
3种人参属植物的 EST-SSR重复基元丰富，共
出现 137种重复基元类型，大多数植物的 EST-SSR
主要为二、三核苷酸重复类型，甜瓜的二核苷酸和三
核苷酸的发生频率为 20.72%和 47.14% (胡建斌等,
2009)，油菜为 7.24%和 6.63% (李小白等, 2007a)，花
生为 32.83%和 49.23% (柳展基等, 2008)，由此可以
看出，不同的植物的主导重复基元的类型有所差异，
水稻(Kantety et al., 2002)、高粱、丹草(卢杰等, 2009)、
葡萄(Cordeiro et al., 2001)和百合(杨素丽等, 2008)等
以三核苷酸重复基元为主，辣椒(李晶晶等, 2008)和
白桦(王艳敏等, 2008)等以两核苷酸重复基元为主导，
但也有以单核苷酸为主导的：柑橘(Jiang et al., 2006)、
大豆(Gao et al., 2003)、拟南芥(Cardle et al., 2000)等。
经过分析，人参属以单核苷酸重复基元为主 ,占
58.48%，其次是三核苷酸和二核苷酸重复基元，分别
占 17.37%和 16.36%，四核苷酸、五核苷酸和六核苷
酸重复基元的出现频率都很低。若 EST-SSR数目足
够大且无偏倚性，4种不同的碱基随机组合可分别产
生 2 种、4 种、10 种、33 种、102 种和 350 种单核苷
酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核
苷酸重复基元类型(Kantety et al., 2002)。人参属单核
苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六
核苷酸重复基元的类型依次为 2、7、29、36、26和 35，
表现出较大偏倚性。
植物的 EST-SSR 引物在同属植物间及不同种
属间的通用性已有报道，白菜 (忻雅等 , 2006b)的
EST-SSR 引物在油菜中的通用性引物为 93.3%，杨
树(杨彦伶等, 2008)EST-SSR引物在柳树中的应用，
通用性引物仅为 54.2%，3种人参属植物的 EST-SSR
引物在三七中有扩增的引物占总数的 85.42%，具有
多态性的引物占扩增引物的 70.73%，人参属植物引
物的通用性介于上述植物中间，表明人参属 EST-SSR
引物具有较高的通用性。
EST-SSR标记与其它标记相比，有着独特的优
点：可以从 EST数据库中开发，成本相对较低，可以
检测基因组表达区域的多态性，具有较高的通用性
(Cordeiro et al., 2001)。可以有效地应用于遗传作图、
资源多样性、物种起源与进化、功能基因的发现与定
位和比较基因组学等方面(Li et al., 2004; 李勇强
等, 2004; Varshney et al., 2005)。目前，在三七中还没
有人作过 SSR标记的报道，本试验利用现有的人参
属的 EST资源，设计 SSR引物，建立 EST-SSR标记，
试验结果表明 29对引物具有多态性，占所设计引物
的 60.42%，而引物扩增显示多态性以及多态水平的高
低，是评价遗传标记的重要指标(Harry et al., 1998)，由
此试验显示利用人参属 EST 数据库资源建立三七
SSR标记是有效可行的。为今后其它植物在同属，甚
至是同科植物 EST-SSR标记提供借鉴。
3材料与方法
3.1材料和模板 DNA的提取
试验材料为 2008年 12月采自云南省文山三七
主产区的 5个不同产地的三七新鲜健康的叶片，材
料来源见表 5。所采集的材料用变色硅胶干燥保存于
封口袋内，采用邹喻苹等(2001,科学出版社, pp.16)的
CTAB法提取三七的总 DNA，稍有改动，在加 CTAB
前用提取缓冲液 (100 mL/L Tris-HCl, 50 mmoL/L
EDTA, 750 mmoL/L NaCl)，洗去多糖和次生代谢物。
电泳检测其浓度并标定DNA浓度为 20mg/L，备用。
3.2人参属 EST来源
本研究所用人参属植物的 EST共计 12 267条，
编号
Number
QBA
YSB
WSA
WSB
WSC
采集地点
Sample location
丘北县树皮乡
Qiubeixian Shupixiang
砚山县马鞍山
Yanshanxian Maanshan
文山县杨柳井乡
Wenshanxian Yangliujingxiang
文山县马塘镇
Wenshanxian Matangzhen
文山县东山乡
Wenshanxian Dongshanxiang
海拔(m)
Altitude (m)
1 684
1 592
1 510
1 376
1 625
经度(°)
Longitude (°)
103. 87
104.28
104.45
104.63
104.52
纬度(°)
Latitude (°)
23.54
23.57
23.28
23.07
23.14
表 5材料来源
Table 5 The source of sample
66
三种人参属植物的 EST-SSR信息分析及其在三七中的应用
Analysis on EST-SSR of Three Species in Genus Panax and the Application in Panax notoginseng
来源于 NCBI 数据库中的 dbEST (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/projects/dbEST)于 2010年 3月 10日前所
登记的人参、西洋参和三七的根、茎、叶和花等部位
的 EST。
3.3人参属 EST中 SSR信息分析
采用 EST-trimmer软件(http://www.pgrc.ipk-gater
sleben.de/misa/download/est -trimmer.pl)去除 5 端或
3端 50 bp的 PolyT或 PolyA以及长度小于 100 bp的
EST序列，长度大于 1 000 bp的 EST则保留其 5端
1 000 bp。用软件 CAP3 (Huang and Madan, 1999)进
行片段重叠群分析和聚类，拼接时设定的初始装配
参数为默认值。
用 primer3 (http://edb.nepgr.cn/modules/redbotoo
ls/primer3.php)软件对 CAP3处理后的 EST进行 SSR
搜索，筛选条件为：单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、
五碱基和六碱基重复系列重复数分别不小于：18次、
7次、5次、5次、4次和 4次。有完全重复和不完全重
复 2种重基元，对所搜索出的 SSR的频度和长度进
行统计。
3.4人参属 EST-SSR引物的设计与合成
用 primer3 软件对 CAP3 处理后的 EST 进行
SSR搜索，筛选条件为：单碱基、二碱基、三碱基、四
碱基、五碱基和六碱基重复系列重复数分别不小于
18次、7次、4次、4次、4次和 4次。GC含量为 20%~
80%，Tm值为 57~63℃，预计扩增产物片段大小为
100~500 bp。根据 SSR长度为 2~3个碱基重复，重复
次数≥6次，扩增产物长度为 100~400 bp，Tm值为
50~65℃，GC%为 40%~80%等参数共设计了 48对引
物，其中人参的 36对、三七 5对、西洋参 7对，由上
海生工生物技术公司合成(表 6)。
表 6 48对 EST-SSR引物信息
Table 6 Information of 48 EST-SSR primers pairs
编号
No.
RS1
RS2
RS3
RS4
RS5
RS6
RS7
RS8
RS9
RS10
RS11
RS12
RS13
来源
Source
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
anax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
重复碱基数
Repeat base No.
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
重复基元
Repeat motif
TA
TA
TA
TA
CA/AT
AC
AAT
GTA/CAG
AAG/CAG
AGC
AGC
ATC
GCT
引物系列
Primer sequence
ACTACCGGAGTCAAGCCTCA
ACGGCCATCATTAATCCAAA
GAAGACCCGGATAGATGCAA
AAGCACCACACAGGTGACAG
ACTGCCGTTATAGGTGCTGC
ACGGCCATCATTAATCCAAA
AGCAAGCTTCTGATTCTGTGG
ATGCACCTGACTCGTAGGCT
TTCCTTTCTCCCTCCCTCTC
GATGATGGTGTGACGACGAC
AGTGCCAGAGAAGCAACCAT
ATGTTCACCACACCACTGGA
ATTGAGGCATCAGGATCAGG
CGACTAACCTTGTACCCGGA
GGGCAAATCAAATAAAGGAG
GAGTGATTGCAGAGCAGGGT
TAGTAGCGACGATCACCACG
AATAATGCTCCGGTCTCCCT
CAACGTGCCTTGTGTTGGTA
CGTCCTCTTGCTCTTTCCAC
AGGGATGCTAGTGCGTCAAT
CCATGGGTATGGGTGTCACT
CGCACAGTGAGGAAGAAGAA
CCATAATCTCCGCTTGTGGT
AAAGCAGGGTGTGCTCACTT
AGGGAGACCGGAGCATTATT
产物大小(bp)
Product size (bp)
209
367
261
250
224
219
352
146
330
158
238
182
198
Tm值(℃)
Tm value (℃)
59.85
53.70
57.80
59.85
59.85
53.70
58.01
59.85
59.85
59.85
57.80
57.80
57.80
59.85
53.70
59.85
59.85
57.80
57.80
59.85
57.80
59.85
57.80
57.80
57.80
57.80
GC (%)
55.00
40.00
50.00
55.00
55.00
40.00
47.62
55.00
55.00
55.00
50.00
50.00
50.00
55.00
40.00
55.00
55.00
50.00
50.00
55.00
50.00
55.00
50.00
50.00
50.00
50.00
67
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
编号
No.
RS14
RS15
RS16
RS17
RS18
RS19
RS20
RS21
RS22
RS23
RS24
RS25
RS26
RS27
RS28
RS29
RS30
RS31
RS32
RS33
RS34
RS35
来源
Source
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
人参
Panax ginseng
重复碱基数
Repeat base No.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
3
4
3
3
4
2
重复基元
Repeat motif
TAA
TGC
TTA
ATC
CGA
CTA
CAG
GGA
AAG
CTT
AGA
TTC
CTC
GA
CGA
TCA
CAG
AGAC
GAA
GAA
ACAG
GA
引物系列
Primer sequence
AAAGCAGGGTGTGCTCACTT
AAGGACAAGAAGAAGCACGG
ACAACTGCCAACCATGTTCA
GCACAAGGTTGTCATCTCCC
GTCTCATGCAAACGAGCCTT
GAATTGGCCAAGTGAGCTTC
CGCACAGTGAGGAAGAAGAA
CGTTCTTAGCCTTGATTGCC
TGCGCAGATACCTACTCGTG
TCCACGGTCTCAAATCCTTC
CATGGATCACCACCACAAGA
CGTAATCTCTTCCGCGTTTG
TGGCTATACCTCAGCACCAG
CACATGAAAGGGAGGGATGT
ATGGCAGCTGAAAGCTTGTT
GGCAATTCAAGAAAGCCAAA
TACCTAATTGCCAGCGGTTC
TGGGAAGTTGGAGAGGATTG
TTCTGATCGAATTCTACACCTG
AGTTCCTGCACTCGCTTGAT
CTAGGCCTACCCTCGGTATCT
CAGGGCTATTGAGCTCCTTG
AGAATCTGCTGTATTCGCCG
AATAACGGGATCGGTAAGGC
TGAACCTCACCTTCCTAACCTC
CAATAGCAGCCACATCATGG
ACCCCGGGAAATTCGGCCAT
TGGTACGTCGCCGACCTGGA
TGGGCGGAGACAGTGGTTGC
ATTCCGCTCACCGCCGCTTC
ACCCCGGGAAATTCGGCCAT
CCGTGTGTGGTTCGTCGCCA
TTTACGGGGAAAGCGCGCCA
CGGCGGAGAAATCTGCCCGT
GGCAAAGCGCGCCATTGTGT
ATCCCTGCCGGTGACGTGGT
CGGCAAGCGTGCCATTGTGT
TGGTACGTCGCCGACCTGGA
ATAGGGCAGCGCGCCTTGTG
TGGTACGTCGCCGACCTGGA
TCGGCAAGCGTGCCTTGTGT
ATCCCTGCCGGTGACGTGGT
TTTACACGCAAAGCGCGCCA
TGTGCCGTCCGGCCATGTCT
产物大小(bp)
Product size (bp)
328
337
337
202
207
400
176
311
242
326
132
355
394
211
221
208
210
217
222
223
228
237
Tm值 (℃)
Tm value (℃)
57.80
57.80
55.75
59.85
57.80
57.80
57.80
57.80
59.85
57.80
57.80
57.80
59.85
57.80
55.75
53.70
57.80
57.80
56.35
57.80
61.92
59.85
57.80
57.80
60.07
57.80
61.90
63.95
63.95
63.95
61.90
63.95
61.90
63.95
61.09
63.95
61.90
63.95
63.95
63.95
61.90
63.95
59.85
63.95
GC (%)
50.00
50.00
45.00
55.00
50.00
50.00
50.00
50.00
55.00
50.00
50.00
50.00
55.00
50.00
45.00
40.00
50.00
50.00
40.91
50.00
57.14
55.00
50.00
50.00
50.00
50.00
60.00
65.00
65.00
65.00
60.00
65.00
60.00
65.00
60.00
65.00
60.00
65.00
65.00
65.00
60.00
65.00
55.00
65.00
续表 6
Continuing table 6
68
3.5三七 PCR体系的建立
PCR 反应体系(25 μL)包括：PCR 缓冲液 10×
Buffer缓冲液 2.5μL，25mmol/L的MgCl2 (1μL、2μL、
4 μL、6 μL)，0.1 U的 Taq DNA聚合酶(1 μL、2 μL、
4 μL、6 μL)，0.1 μmol/的 dNTPs (1 μL、2 μL、3 μL、
64 μL)，上下游引物各 0.1 μmol/L的 1 μL，含 20 ng左
右的三七 DNA模板 1 μL，无菌扩增水补足 25 μL，
考察最适反应体系，确定的反应体系为 10×Buffer缓
冲液 2.5 μL，25 mmol/L的 MgCl2 4 μL，0.1 U的 Taq
DNA聚合酶 4μL，0.1μmol/L的 dNTPs 2 μL，上下游
引物各 0.1 μmol/L的 1 μL，20 ng左右的三七 DNA
模板 1 μL。所用的试剂均由上海生工生物技术公司
提供。整个反应在伯乐 BIO-RAD iCycler PCR 仪器
上来进行，对退火温度进行最适温度筛选，筛选温度
三种人参属植物的 EST-SSR信息分析及其在三七中的应用
Analysis on EST-SSR of Three Species in Genus Panax and the Application in Panax notoginseng
GC
(%)
65.00
65.00
63.64
65.00
61.90
56.52
60.87
65.00
65.00
70.00
59.09
65.00
60.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
65.00
编号
No.
RS36
SQ1
SQ6
SQ2
SQ4
SQ5
XS1
XS2
XS3
XS4
XS5
XS6
XS7
来源
Source
人参
Panax ginseng
三七
Panax notoginseng
三七
Panax notoginseng
三七
Panax notoginseng
三七
Panax notoginseng
三七
Panax notoginseng
西洋参
Panax quinquefolius
西洋参
Panax quinquefolius
西洋参
Panax quinquefolius
西洋参
Panax quinquefolius
西洋参
Panax quinquefolius
西洋参
Panax quinquefolius
西洋参
Panax quinquefolius
重复碱
基数
Repeat
base No.
3
3
3
3
3
3
2
3
3
3
3
3
5
重复基元
Repeat motif
ATC
CCT
CAA
TCT
GCA
CTC
AG
GAG
CTC
CCA
CGC
CTA
CACTT
引物系列
Primer sequence
GGGCCGCACAGTGAGGAAGA
GCCGGCTTCTTGTCGTGCCT
CCCGACGTACACTTTCCTGCCC
CCGTTTGCCATCCCGCCGAA
ACCGCCCAACTCACTCCTCCT
AGGTCATGACGTGGCCATGAGAG
CGGCACAGAGGTGTCCTCTTCCT
TTCGGAGCCCGAGCCCAAGT
CTCGGAACTTGGGCTCGGCT
CGCGGGGATTTCTTGGGGGC
TCTATCTGTTGCGGGTCGAGGG
TGGTGGGATCCTCGCGGACA
GCGGGGATCCGTGAAACCAA
CGGGGAGTGCGATGCCGAAA
GGCCGAGGTACGCTGCCAAA
TGGGGGTCTCGGCGGAAGAA
TCCAGAGGCGGAGGACGGTT
GGCCACCGGGCAAGTCACAA
GGGCAGGTACGCGGGACAAA
TGGTGGTGGGAAGTGCACCG
CCTCGCCCAACGCACCAACA
AGCGGAAGAGCGGACCTCGT
ATTGGAAGGCAGGCAGCCCC
GGTCGCGGCCGAGGTACTTT
TGCTGCCACCTCCTAGCCGA
GCCGTGCTGCTGCAGTGCTA
产物
大小(bp)
Product
size (bp)
240
215
216
211
150
208
249
223
231
220
231
171
199
Tm值(℃)
Tm value (℃)
63.95
63.95
65.66
63.95
63.87
63.73
65.52
63.85
58.79
60.39
57.88
59.61
61.90
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
63.95
续表 6
Continuing table 6
为 49℃、51℃、53℃、55℃和 57℃，循环条件为：94℃
预变性 5 min，94℃变性 45 s，72℃延伸 90 min，扩
增 36个循环，最后 72℃延伸 7 min，以确定最适退
火温度。
3.6聚丙烯酰胺凝胶电泳与染色
扩增后产物 25 μL加 2 μL溴酚蓝上样缓冲液混
匀，用 6.0%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离扩增产物，检
测所设计引物可用性和多态性。电泳液为 1×TBE缓
冲液，电压 200 V，电泳时间 2.5 h，以硝酸银法显色，检
测扩增产物，用扫描仪扫描图板、拍照并保存图片。
致谢
感谢云南省农科院质量标准与检测技术研究所的
69
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
管俊娇老师在数据分析与处理时给予的帮助与指导。
参考文献
Adams M.D ., K elley J.M., Gocayne J.D., Dubnick M., Poly-
meropoulos M.H., Xiao H., Merril C.R., Wu A., Olde B.,
Moreno R.F., Kerlavage A.R., McCombie W.R., and Venter
J.C., 1991, Complementary DNA sequencing: expressed se-
quence tags and human genome project, Science, 252
(5013): 1651-1656
Cordeiro G.M., Casu R., Mclntyre C.L., Manners J.M., and Hen-
ry R.J., 2001, Microsatellite marhers from sugarcane (Sacch-
arum spp.) ESTs cross transferable to erianthus and sorghum,
Plant Sci., 160(6): 1115-1123
Cardle L., Ramsay L., Milbourne D., Macaulay M., Marshall D.,
and Waugh R., 2000, Computational and experimental char-
acterization of physically clustered simple sequence repeats
in plants, Genetics, 156(2): 847-854
Gao L.F., Tang J.F., Li H.W., and Jia J.Z., 2003, Analysis of mi-
crosatellites in major crops assessed by computational and
experimental approaches, Mol. Breed , 12: 245-261
Harry D.E., Temesgen B., and Nealeb D.B., 1998, Codominant
PCR-based markers for Pinus taeda developed from mapped
cDNA clones, Theor. Appl. Genet., 97(3): 327-336
Huang X., and Madan A., 1999, CAP3: A DNA sequence assem-
bly program, Genome Res., 9(9): 868-877
Hu J.B., Liu Y., Wang L.J., and Li J.W., 2009, Characteristics of
microsatellites in melon (Cucumis melo L.) EST sequences,
Zhiwu Shenglixue Tongxun (Plant Physiology Communica-
tions), 45(3): 258-262 (胡建斌,刘颖,王兰菊,李建吾, 2009,
甜瓜 EST序列中微卫星的分布特征,植物生理学通讯, 45
(3): 258-262)
Hu J.B., and Li J.W., 2008, Information of EST-SSR loci in cu-
cumber, Jiangxi Nongye Xuebao (Acta Agriculturae Jiangxi),
20(11): 58-60, 68 (胡建斌,李建吾, 2008,黄瓜 EST - SSR
位点信息,江西农业学报, 20(11): 58-60, 68)
Hua Y.W., Lu Y., Long Q.Y., Zeng X., Hu Y.S., and Huang H.S.,
2008, Development of EST-SSRs using public ESTs in He-
vea , Redai Zuowu Xuebao (Chinese Journal of Tropical
Crops), 29(5): 583-588 (华玉伟,卢轶,龙青姨,曾霞,胡彦
师,黄华孙, 2008,橡胶树 EST-SSRs发掘研究,热带作物
学报, 29(5): 583-588)
Jiang D., Zhong G.Y., and Hong Q.B., 2006, Analysis of mi-
crosatellites in citrus unigenes, Acta Genetica Sinica, 33(4):
345-353
Jin J.Q., Cui H.R., Chen W.Y., Lu M.Z., Yao Y.L., Xin Y., and
Gong X.C., 2006a, Data mining for SSRs in ESTs and de-
velopment of EST-SSR marker in tea plant (Camellia sinen-
sis), Chaye Kexue (Journal of tea science), 26(1): 17-23 (金
基强 , 崔海瑞 , 陈文岳 , 卢美贞 , 姚艳玲 , 忻雅 , 龚晓春 ,
2006a,茶树 EST-SSR的信息分析与标记建立,茶叶科学,
26(1): 17-23)
Jin J.Q., Li S.F., Gong X.C., Lu M.Z., Yao Y.L., Xin Y., and Cui
H.R., 2006b, Analysis of SSR information in EST resource
of tea plants (Camellia sinensis), Keji Tongbao (Bulletin of
Science and Technology), 22(4): 471-476 (金基强,李素芳,
龚晓春,卢美贞,姚艳玲,忻雅,崔海瑞, 2006b,茶树 EST
资源中 SSR的信息分析,科技通报, 22(4): 471-476)
Kantety R.V., La Rota M.L., Matthews D.E., and Sorrells M.E.,
2002, Data mining for simple sequence repeats in expressed
sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat,
Plant Mol. Biol., 48(5-6): 501-510
Lin F.X., Cheng S.M., Li A.Z., and Lin F.C., 2007, Compose and
distribution of EST-SSR in genomes of Lentinula edodes,
Weishengwuxue Tongbao (Microbiology), 34 (3): 438-442
(林范学, 程水明, 李安政, 林芳灿, 2007, 香菇基因组中
EST-SSR的构成和分布,微生物学通报, 34(3): 438-442)
Li Y.Q., Li H.W., Gao L.F., and He B.R., 2004, Progass of sim-
ple sequence repeats derived from expressed sequence tags,
Journal of Plant Genetic Resources, 5(1): 91-95
Li Y.Q., Li H.W., Gao L.F., and He B.R., 2004, Prograss of sim-
ple sequence repeats dderived from expressed sequence tags,
Zhiwu Yichuan Xuebao (Journal of Plant Genetic Resour-
ces), 5(1): 91-95 (李永强,李宏伟,高丽峰,何蓓如, 2004,
基于表达序列标签的微卫星标记(EST-SSR)研究进展,植
物遗传学报, 5(1): 91-95)
Li J.J., Wang S.B., Liu J.B., Pan B.G., and Chen J.F., 2008, De-
velopment of pepper EST-SSRmarker, Fenzi ZhiwuYuzhong
(Molecular Plant Breeding), 6(6): 1219-1222 (李晶晶,王述
彬,刘金兵,潘宝贵,陈劲枫, 2008,辣椒 EST-SSR标记的
开发,分子植物育种, 6(6): 1219-1222)
Lu J., Zhan Q.W., Lu J.B., Li J.Q., and Wang M., 2009, Develop-
ment of EST-SSR marker in sorghum and sudangrass,
Jiguang Shengwu Xuebao (Acta Laser Biology Sinica), 18
(3): 389-394, 400 (卢杰, 詹秋文, 陆景标, 李杰勤, 王敏,
2009,高梁与苏丹草 EST-SSR 标记的开发, 激光生物学
报, 18(3): 389-394, 400)
Luo M., and Jia J.Z., 2001, Progress in expressed sequence tags
(EST) project of plant genome, Shengwuhuaxue Yu Sheng-
wuwuli Yanjiu Jinzhan (Progress in Biochemistry and Bio-
physics), 28(4): 494-497 (骆蒙,贾继增, 2001,植物基因组
表达序列标签(EST)计划研究进展,生物化学与生物物理
进展, 28(4): 494-497)
Li X.B., Zhang M.L., and Cui H.R., 2007a, Data mining for SSRs
in ESTs and delelopment of EST-SSR marker in Oilseed
rappe, Fenzi Xibao Shengwu Xuebao (Journal of Molecular
Cell Biology), 40(2): 137-144 (李小白 , 张明龙 , 崔海瑞 ,
2007a, 油菜 EST-SSR 标记的建立, 分子细胞生物学报 ,
70
三种人参属植物的 EST-SSR信息分析及其在三七中的应用
Analysis on EST-SSR of Three Species in Genus Panax and the Application in Panax notoginseng
40(2): 137-144)
Li X.B., Zhang M.L., and Cui H.R., 2007b, Analysis of SSR in-
formation in EST resource of oilseed rape, Zhongguo You-
liangzuowu Xuebao (Chinese Journal of Oil Crop Sciences),
29(1): 20-25 (李小白,张明龙,崔海瑞, 2007b,油菜 EST资
源的 SSR信息分析,中国油料作物学报, 29(1): 20-25)
Liu Z.J., Sun P., and Bu X., 2008, Analysis of SSR information in
EST resource of peanut, HuashengXuebao (Journal of Peanut
Science), 37(4): 6-11 (柳展基,孙萍,步迅, 2008,花生 EST
资源的 SSR信息分析,花生学报, 37(4): 6-11)
Powel W., Machray G.C., and Provan J., 1996, Polymorphism re-
vealed by simple sequence repeats, Trends in Plant Science,
1(7): 215-222
Peng D.W., Zheng L.C., and Zhu H.B., 2008, Analysis of SSR in-
formation in EST resource of cassava, Zhongguo Nongxue
Tongbao (Chinese Agricultural Science Bulletin), 24 (2):
433-436 (彭丁文,郑柳城,朱宏波, 2008,木薯 EST资源的
SSR信息分析,中国农学通报, 24(2): 433-436)
Song J., Yan Z.Y., Ma Y.T., Chen X., Zhang Q., Wang J., Yang
X.J., and Wan D.G., 2009, Analysis of SSR information in
EST resource of Salvia miltiorrhiza and associated EST-SSR
markers, Shijie Kexue Jishu (Zhongyiyao Xiandaihua) (World
Science and Technology (Modernization of Traditional Chi-
nese Medicine and Materia Medica)), 11(1): 58-63) (宋杰 ,
严铸云,马云桐,陈新,张琦,王菁,杨新杰,万德光, 2009,
丹参 EST序列中 SSR信息的分析及分子标记的建立,世
界科学技术(中医药现代化), 11(1): 58-63)
Varshney R.K., GranerA., and Sorrells M.E., 2005, Genic mi-
cro-satellite markers in plants: Features and applications,
Trends in Biotechnology, 23(1): 48-55
Wei Z.S., Xia Z.Q., Li K.M., and Wang W.Q., 2008, Analysis of
genetic diversity of cassava genepool by EST-SSR markers,
Redai Zuowu Xuebao (Chinese Journal of Tropical Crops),
29(3): 304-309 (韦祖生,夏志强,李开绵,王文泉, 2008,木
薯种质库遗传多样性的 EST-SSR 标记, 热带作物学报,
29(3): 304-309)
Wang Y.M., Wei Z.G., and Yang C.P., 2008, Data mining for
SSRs in ESTs and EST-SSR marker development in Betula
platyphylla, Linye Kexue (Scientia Silvae Sinicae), 44(2):
78-84 (王艳敏,魏志刚,杨传平, 2008,白桦 EST-SSR信
息分析与标记的开发,林业科学, 44(2): 78-84)
Xin Y., Cui H.R., Lu M.Z., Yao Y.L., Jin J.Q., Lin R.S., and Cui
S.L., 2006a, Data mining for SSRs in ESTs and EST-SSR
marker development in chinese cabbage, Yuanyi Xuebao
(Acta Horticulturae Sinica), 33(3): 549-554 (忻雅,崔海瑞,
卢美贞 , 姚艳玲 , 金基强 , 林容杓 , 崔水莲 , 2006a, 白菜
EST-SSR 信息分析与标记的建立 , 园艺学报 , 33 (3):
549-554)
Xin Y., Cui H.R., Zhang M.L.,Yao Y.L., Lu M.Z., Jin J.Q., Lin
R.S., and Cui S.P., 2006b, The transferability of chinese
cabbage EST-SSR markers, Xibao Shengwuxue Zazhi (Chi-
nese Journal of Cell Biology), (2): 248-252 (忻雅, 崔海瑞,
张明龙 , 姚艳玲 , 卢美贞 , 金基强 , 林容杓 , 崔水蓬 ,
2006b, 白菜 EST-SSR 标记的通用性, 细胞生物学杂志,
(2): 248-252)
Yang C.J., Wang J., Mu L.Q., Li S.C., Liu G.J., and Hu C.Q.,
2008, Development of EST-SSR marker in Panax ginseng,
Nongye Shengwu Jishu Xuebao (Journal of Agricultural
Biotechnology), 16(1): 114-120 (杨成君,王军,穆立蔷,李
绍臣,刘关君,胡长群, 2008,人参 EST-SSR标记的建立,
农业生物技术学报, 16(1): 114-120)
Yang Y.L., Zhang Y.D., and Zhang X.Y., 2008, Transferability
analysis of populus SSR markers in salix, Fenzi Zhiwu
Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 6(6): 1134-1138 (杨
彦伶,张亚东,张新叶, 2008,杨树 SSR标记在柳树中的
通用性分析,分子植物育种, 6(6): 1134-1138)
Yang S.L., Ming J., Liu C., Mu D., and Li M.Y., 2008, Data min-
ing for simple sequence repeats marker development in ex-
pressed sequencetags from Lilium L., Yuanyi Xuebao (Acta
Horticulturae Sinica), 35(7): 1069-1074 (杨素丽, 明军, 刘
春,穆鼎,李名扬, 2008,基于 EST信息的百合 SSR标记
的建立,园艺学报, 35(7): 1069-1074)
Zhang Z.C., and Hou X.L., 2004, Strategies for development of
SSR molecular markers, Yichuan (Hereditas), 26(5): 763-768
(张增翠,侯喜林, 2004, SSR 分子标记开发策略及评价,
遗传, 26(5): 763-768)
Zhu Y., Hao Y.B., Wang K.J., Wu C.L., Wang W.X., Qi J.X.,
and Zhou J., 2009, Analysis of SSRs information and devel-
opment of SSR markers from walnut ESTs , Guoshu Xuebao
(Journal of Fruit Science), 26(3): 394-398 (朱艳,郝艳宾,王
克建,吴春林,王维霞,齐建勋,周军, 2009,核桃 EST-SSR
信息分析与标记的初步建立,果树学报, 26(3): 394-398)
Zhang J.E., Li F., and Sun M.X., 2007, Analysis of EST-SSR loci
in tobacco (Nicotiana tabacum L.), Wuhan Zhiwu Yanjiu
(Journal of Wuhan Botanical Research), 25(5): 427-431 (张
俊娥,李芬,孙蒙祥, 2007,烟草 EST-SSR位点分析,武汉
植物学研究, 25(5): 427-431) (Chinese Journal in English)
Zhao M.Q., Song Y., Fan J.H., Ji Y.Z., Luo Q., Zhu Y.Y., and Li
C.Y., 2008, Frequency and distribution of different simple
sequence repeats (SSRs) in the maize ESTs, Yunnan Nongye
Daxue Xuebao (Journal of Yunnan Agricultural Universi-
ty), 23(5): 585-589 (赵美琼,宋燕,范静华,纪韵祚,罗琼,朱
有勇,李成云, 2008,玉米 EST序列中微卫星的频率和分
布,云南农业大学学报, 23(5): 585-589)
71