全 文 ：第４３卷　第８期
２０１５年８月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．８
Ａｕｇ．２０１５
网络出版时间：２０１５－０６－３０　１３：４７ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１５．０８．０１２
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１５０６３０．１３４７．０１２．ｈｔｍｌ
苹果属海棠亲缘关系的ＡＦＬＰ分析
　［收稿日期］　２０１４－０１－２１
　［基金项目］　国家林业公益性行业科研专项（２０１２０４３０８）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（２０１２０２０４１２０００６）
　［作者简介］　徐　曼（１９８９－），女，河南淮滨人，在读硕士，主要从事园林植物分类研究。Ｅ－ｍａｉｌ：８４３３３８４６６＠ｑｑ．ｃｏｍ
　［通信作者］　李厚华（１９７３－），男，山东梁山人，副教授，博士，主要从事植物分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｈｏｕｈｕａ７３＠１６３．ｃｏｍ
徐　曼１，李厚华１，郭亦博２，赵　冰１，王亚杰１，高　艳１
（１西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌７１２１００；２内蒙古阿里河林业局，内蒙古 呼伦贝尔１６５４５０）
［摘　要］　 【目的】在分子水平上探究苹果属海棠野生种、栽培种及相近属植物之间的亲缘关系，为分类学研
究、海棠育种提供参考。【方法】选用４对 ＡＦＬＰ引物（Ｍ－ＣＴＣ／Ｅ－ＡＧＣ，Ｍ－ＣＴＡ／Ｅ－ＡＣＧ，Ｍ－ＣＡＴ／Ｅ－ＡＣＴ和 Ｍ－
ＣＡＡ／Ｅ－ＡＣＧ），分析苹果属海棠９个野生种、８个栽培种以及４个山楂属植物和２个梨属植物的遗传多样性。【结果】
（１）共扩增出条带１１４条，其中多态性条带１０８条，多态位点百分率达９４．７％，供试材料表现出丰富的遗传多样性。
（２）供试材料在相似系数为０．７３时被分为３组，分别为苹果属组、山楂属组和梨属组，因此ＡＦＬＰ分子标记的方法可
以将苹果属与梨属、山楂属完全区分开。（３）秦巴山区野生苹果属海棠在相似性系数为０．８０时被聚为４组，聚类结果
支持Ｒｅｈｄｅｒ将湖北海棠和垂丝海棠列入山荆子系的分类方法，不支持Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄｓ建立独立的湖北海棠系的分类方
法。【结论】基于遗传相似性系数的聚类结果与形态学分类结果基本一致，既验证了形态学分类的正确性，又解决了
各分类系统间存在的分歧。
［关键词］　海棠；ＡＦＬＰ；分子标记；亲缘关系；分类
［中图分类号］　Ｓ６８５．９９ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１５）０８－０１５９－０６
ＡＦＬＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｃｒａｂａｐｐｌｅｓ
ＸＵ　Ｍａｎ１，ＬＩ　Ｈｏｕ－ｈｕａ１，ＧＵＯ　Ｙｉ－ｂｏ２，ＺＨＡＯ　Ｂｉｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｙａ－ｊｉｅ１，ＧＡＯ　Ｙａｎ１
（１　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ；
２　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ａｌｉｈｅ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ，Ｈｕｌｕｎｂｅｉｅｒ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　１６５４５０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｃｒａｂａｐｐｌｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ｐｏｐｕ－
ｌａｒ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｇｅｎｕｓ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｆｏｒ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ
ｎｅｗ　ｃｒａｂａｐｐｌｅ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｂｙ　ａｐｐｌｙｉｎｇ　４ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｓｍ）ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｍ－ＣＴＣ／Ｅ－ＡＧＣ，Ｍ－ＣＴＡ／Ｅ－ＡＣＧ，Ｍ－ＣＡＴ／Ｅ－ＡＣＴ　ａｎｄ　Ｍ－ＣＡＡ／Ｅ－ＡＣＧ），９ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ
ｗｉｌｄ　ｃｒａｂａｐｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，８ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｃｒａｂａｐｐｌｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ａｎｄ　４　Ｃｒａｔａｅｇｕｓ　ｓａｍ－
ｐｌｅｓ，ａｎｄ　２　Ｐｙｒｕｓ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ．【Ｒｅｓｕｌｔ】（１）Ｆｏｕｒ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１１４ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，ａｍｏｎｇ　ｗｈｉｃｈ　１０８ｗｅｒｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ
９４．７％．（２）Ｗｉｔｈ　ａ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　０．７３，ｔｈｅ　２３ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｉｎｔｏ　３ｇｒｏｕｐｓ：ｇｅｎｕｓ　Ｍａｌｕｓ，Ｃｒａ－
ｔａｅｇｕｓ　ａｎｄ　Ｐｙｒｕｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ｔｏ　ｓｅｐａｒａｔｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｍａｌｕｓ，Ｃｒａｔａｅｇｕｓ　ａｎｄ
Ｐｙｒｕｓ．（３）Ｗｉｔｈ　ａ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　０．８０，ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｉｎｔｏ　４
ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔ　ｗａｓ　ｉｎ　ｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｇｒｏｕｐｅｄ　Ｍ．
ｈｕｐｅｈｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　Ｍ．ｈａｌｌｉａｎａｔｏ　Ｓｅｒｉａｌ　Ｂａｃｃａｔａｅ　Ｒｅｈｄ　ｉｎｓｔｅａｄ　ｏｆ　ａ　ｓｅｐａｒａｔｅ　Ｓｅｒ．Ｈｕｐｅｈｅｎｓｅｓ　Ｌａｎｇｅｎｆ．【Ｃｏｎ－
ｃｌｕｓｉｏｎ】Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｗａｓ　ｂａｓｉｃａｌｙ　ｉｎ　ｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉ－
ｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　ｖｅｒｉｆｉｅｄ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｃｔｎｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｂｕｔ　ａｌｓｏ　ｓｏｌｖｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔ－
ｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｒａｂａｐｐｌｅｓ；ＡＦＬＰ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ；ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ；ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　海棠是苹果属（Ｍａｌｕｓ）多种植物和木瓜属
（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ）几种植物 的 通 称。苹 果 属 海 棠
（ｃｒａｂａｐｐｌｅ），是指苹果属具较小果实（直径≤５ｃｍ）
的类型。苹果属海棠既可作为重要的观赏花木，又
具有食用价值和药用价值，如垂丝海棠（Ｍ．ｈａｌｌｉａｎａ
）、西府海棠（Ｍ．ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ）等具有优良的观赏性
状，常用于园林绿化；湖北海棠叶中含有丰富的黄酮
类物质，可制成保健茶等［１］。
以往对苹果属的分类，主要依据形态标记，如叶
形、果形、嫩枝绒毛、叶缘锯齿、萼片宿存与否等［２］。
由于苹果属植物具有多型性，形态特征不能充分解
决苹果属种系分类问题。因此，试验研究成为苹果
属植物分类与系统演化关系研究的重要依据［３］。对
苹果属植物分类学的研究主要包括细胞分类学、孢
粉学、植物化学分类学和分子系统学等。分子系统
学作为最新的分类手段之一，常用的分析技术有
ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ、ＩＴＳ等，其中 ＡＦＬＰ分
子标记技术是一种建立在ＰＣＲ技术基础上的ＤＮＡ
指纹分析技术，其多态性丰富，使得从基因组水平探
讨苹果属种间、组系间及与相近属间的亲缘关系成
为可能［４］。ＡＦＬＰ标记在种下水平的遗传多样性研
究中也发挥着重要作用，已被广泛用于龙眼品种
（系）、梨新品种、山东石榴品种的遗传多样性及亲缘
关系研究［５－７］。
运用分子技术对苹果属的分类研究主要有：梁
国鲁等［８］用ＡＦＬＰ技术对该属２３个种共３１个类型
的分析，印证了传统分类研究的结论，明确了佛罗伦
萨海棠等疑难种的分类地位；石胜友等［９］利用
ＡＦＬＰ标记对变叶海棠、陇东海棠、花叶海棠的亲缘
关系进行分析，结果与形态学、细胞学和同工酶的
结果一致，在分子水平上揭示了变叶海棠的杂种起
源；郭翎等［１０］通过ＡＦＬＰ技术得出亚洲原产的苹果
属植物对于苹果及观赏海棠品种的发展起重要作用
的结论，并建议将原属花楸组植物除佛罗伦萨苹果
外全部并入苹果组，取消脱萼组，将其组内的植物全
部并入苹果组。
苹果属分类系统繁多，分类系统间存在差异。
本研究运用ＡＦＬＰ分子标记技术和聚类分析方法，
探究分布于秦巴山区的野生海棠种质资源、常见海
棠栽培种及其相近属植物材料之间的亲缘关系，以
期为分类学研究提供依据，为培育海棠新品种提供
理论支持。
１　材料与方法
１．１　材　料
植物材料采集于秦巴山区、陕西杨凌西北农林
科技大学博览园、北京植物园、中国科学院植物所、
河北怀柔、陕西府谷。其中，山荆子、湖北海棠、垂丝
海棠、三叶海棠、变叶海棠、陇东海棠、河南海棠、滇
池海棠为野生种，而平邑甜茶、八棱海棠、西府海棠、
花红、楸子、海棠花、海红果为常见的栽培种［１１］。于
２０１２－０７采集无病虫害的幼嫩叶片，用变色硅胶干燥
后，保存于－２０℃冰箱内。供试材料编号及来源见
表１。
表１　供试植物材料及其来源
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｌａｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｓｏｕｒｃｅｓ
编号
Ｎｏ．
名称
Ｎａｍｅ
材料来源
Ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｍａｔｅｒｉａｌ
１ 白梨Ｐｙｒｕｓ　ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ 西北农林科技大学博览园 Ｍｕｓｅｕｍ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
２ 沙梨Ｐ．ｐｙｒｉｆｏｌｉａ 西北农林科技大学博览园 Ｍｕｓｅｕｍ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
３ 裂叶山楂Ｃｒａｔａｅｇｕｓ　ｒｅｍｏｔｉｌｏｂａｔａ 西北农林科技大学博览园 Ｍｕｓｅｕｍ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
４ 山楂Ｃ．ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ 西北农林科技大学博览园 Ｍｕｓｅｕｍ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
５ 野山楂Ｃ．ｃｕｎｅａｔａ 西北农林科技大学博览园 Ｍｕｓｅｕｍ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
６ 湖北海棠 Ｍａｌｕｓ　ｈｕｐｅｈｅｎｓｉｓ 陕西秦岭Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｓｈａａｎｘｉ
７ 平邑甜茶 Ｍ．ｈｕｐｅｈｅｎｓｉｓ．ｖａｒ．ｐｉｎｙｉｅｎｓｉｓ 北京植物园Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｇａｒｄｅｎ
８ 变叶海棠 Ｍ．ｔｏｒｉｎｇｏｉｄｅｓ 陕西秦岭Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｓｈａａｎｘｉ
９ 垂丝海棠 Ｍ．ｈａｌｌｉａｎａ 陕西秦岭Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｓｈａａｎｘｉ
１０ 河南海棠 Ｍ．ｈｏｎａｎｅｎｓｉｓ 陕西秦岭Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｓｈａａｎｘｉ
１１ 八棱海棠 Ｍ．ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ 河北怀柔 Ｈｕａｉｒｏｕ，Ｈｅｂｅｉ
１２
西府海棠（黄果皮）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ（ｙｅｌｏｗ　ｐｅｅｌ）
西北农林科技大学博览园 Ｍｕｓｅｕｍ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
１３
西府海棠（红果皮）
Ｍ．ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ（ｒｅｄ　ｐｅｅｌ）
北京中国科学院植物所Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｃａｄｅｍｙ
０６１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
续表１　Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ　ｔａｂｌｅ　１
编号
Ｎｏ．
名称
Ｎａｍｅ
材料来源
Ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｍａｔｅｒｉａｌ
１４ 山荆子 Ｍ．ｂａｃｃａｔａ 陕西秦岭Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｓｈａａｎｘｉ
１５ 花红 Ｍ．ａｓｉａｔｉｃａ 西北农林科技大学博览园 Ｍｕｓｅｕｍ　Ｇａｒｄｅｎ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
１６ 陇东海棠 Ｍ．ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ 陕西秦岭Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｓｈａａｎｘｉ
１７ 陇东海棠 Ｍ．ｋａｎｓｕｅｎｓｉｓ 北京植物园Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｇａｒｄｅｎ
１８ 滇池海棠 Ｍ．ｙｕｎｎａｅｎｓｉｓ 陕西巴山Ｂａｓｈａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ
１９ 楸子 Ｍ．ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ 陕西秦岭 Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｓｈａａｎｘｉ
２０ 海棠花 Ｍ．ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ 北京植物园Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｇａｒｄｅｎ
２１ 辽宁山楂Ｃ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ 陕西巴山Ｂａｓｈａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ
２２ 三叶海棠 Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ 陕西秦岭 Ｑｉｎｌｉｎｇ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ，Ｓｈａａｎｘｉ
２３ 海红果 Ｍ．ｍｉｃｒｏｍａｌｕｓ 陕西府谷Ｆｕｇｕ，Ｓｈａａｎｘｉ
１．２　方　法
１．２．１　ＤＮＡ提取　采用植物基因组ＤＮＡ试剂盒
（天根，北京）提取各试验材料的基因组ＤＮＡ。将提
取的ＤＮＡ用１．５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶检测纯度。采用
紫外分光光度计（六一，北京），选ＤＬ２０００ＤＮＡ作
为对照来估计ＤＮＡ浓度。之后稀释每个样品至５０
ｎｇ／μＬ，－２０℃保存。
１．２．２　ＡＦＬＰ分析　采用Ｖｏｓ等［１２］的方法并稍作
改动对样品进行ＡＦＬＰ分析。反应程序如下：从２３
个样品的基因组ＤＮＡ中分别取５μＬ于３７℃ 酶切
连接３ｈ（内切酶采用ＥｃｏＲⅠ和ＭｓｅⅠ），将得到的
ＤＮＡ 模板用于预扩增。预扩增采用 ＭｓｅⅠ ＋
Ｃ／ＥｃｏＲⅠ＋Ａ引物组合，预扩增程序为：９４℃变性
３０ｓ，５６℃复性３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，进行２４个循
环。对预扩增的ＰＣＲ产物进行１０倍稀释，采用能
产生清晰条带的４种引物组合对稀释的ＰＣＲ产物
进行选择性扩增。选择性扩增采用＋３／＋３引物组
合，程序的第１步为１３个循环（第１个循环９４℃变
性３０ｓ，６５℃复性３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，接下来的
１２个循环，退火温度每循环减少０．７℃），第２步为
２４个循环（９４℃变性３０ｓ，５６℃复性３０ｓ，７２℃延
伸１ｍｉｎ）。反应结束后在２０μＬ反应体系中加入５
μＬ加样缓冲液，９５℃变性８ｍｉｎ后迅速将ＰＣＲ管
放于冰上以防止复性，然后将样品置于－２０℃冰箱
保存用于电泳检测。本试验采用聚丙烯酰胺凝胶电
泳和银染的方法进行检测。银染后的板晾干后在 Ｘ
线胶片观察灯下观察。
１．２．３　聚类分析　对扩增产物的电泳结果采用“０－
１”系统记录谱带位置，观察电泳图谱中同一位置上
ＤＮＡ条带的有无，有记为１，无记为０，形成０／１矩
阵图输入计算机。采用多变量分析系统 （ＮＴ－
ＳＹＳ２ｐｃ，２．１０版）软件中的ＤＩＣＥ法计算遗传相似
系数，然后根据相似系数用ＳＡＨＮ　Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ和非
加权组平均法（ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析。
２　结果与分析
２．１　ＡＦＬＰ扩增片段的多态性
从选择性引物组合中，筛选出扩增条带丰富、分
辨能力强的引物对，分别为 Ｍ－ＣＴＣ／Ｅ－ＡＧＣ、Ｍ－
ＣＴＡ／Ｅ－ＡＣＧ、Ｍ－ＣＡＴ／Ｅ－ＡＣＴ、Ｍ－ＣＡＡ／Ｅ－ＡＣＧ。
引物 Ｍ－ＣＡＡ／Ｅ－ＡＣＧ组合对供试样本的ＡＦＬＰ扩
增图谱见图１。
图１　引物 Ｍ－ＣＡＡ／Ｅ－ＡＣＧ组合对供试植物样本的ＡＦＬＰ扩增图谱
Ｍ．Ｔａｋａｒａ　ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～２３．材料编号同表１
Ｆｉｇ．１　ＡＦＬＰ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｍ－ＣＡＡ／Ｅ－ＡＣＧ
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ（Ｔａｋａｒａ）；１－２３．Ｔｈｅ　ｓｅｒｉａｌ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　Ｔａｂｌｅ　１
１６１第８期 徐　曼，等：苹果属海棠亲缘关系的ＡＦＬＰ分析
　　用这４对引物对供试材料的基因组进行扩增，
共扩增出条带１１４条，其中多态性条带１０８条。平
均每对引物扩增出条带２８．５条，多态性条带平均为
２７条，多态位点百分率达９４．７％（表２）。可见，供
试材料间在分子水平上酶切位点的分布具有广泛的
差异，其遗传多样性极为丰富。
表２　４对ＡＦＬＰ选择性扩增引物产生的条带多态性
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｆ　ＡＦＬＰ　ｂａｎｄｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　４ｐｒｉｍｅｒ　ｐａｉｒｓ
引物对
Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ
选择性序列
Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｎｕｃｌ．
扩增位点数
Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｓｉｔｅｓ
多态性位点
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｓｉｔｅｓ
多态位点百分率／％
Ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｓｉｔｅｓ
Ｍ７－Ｅ７ Ｍ－ＣＴＣ／Ｅ－ＡＧＣ　 ２２　 ２２　 １００．０
Ｍ５－Ｅ２ Ｍ－ＣＴＡ／Ｅ－ＡＣＧ　 １９　 １６　 ８４．１
Ｍ４－Ｅ４ Ｍ－ＣＡＴ／Ｅ－ＡＣＴ　 ２７　 ２６　 ９６．３
Ｍ１－Ｅ６ Ｍ－ＣＡＡ／Ｅ－ＡＣＧ　 ４６　 ４４　 ９５．７
合计 Ｔｏｔａｌ　 １１４　 １０８　 ３７６．１
平均 Ａｖｅｒａｇｅ　 ２８．５　 ２７　 ９４．７
２．２　遗传多样性聚类分析
在用于ＡＦＬＰ分析的引物组合中，根据选择性
扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳所得的大量清晰条
带，从中选取１０８条多态性条带，进行遗传相似系数
计算后，再经过聚类分析，构建了２３份供试材料的
亲缘关系树状图（图２）。这２３份材料的相似系数
介于０．６８～０．９４，根据相似性关系，在相似系数为
０．７３时，可以将这些材料分为３个组：Ⅰ．梨属组，
包括白梨和沙梨；Ⅱ．山楂属组，包括裂叶山楂、山
楂、辽宁山楂、野山楂；Ⅲ．苹果属组，包括所有的苹
果属野生种以及栽培种（图２）。
图２　２３个供试植物样本ＡＦＬＰ分析亲缘关系树状图
Ｆｉｇ．２　Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　２３ｓａｍｐｌｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＡＦＬＰ　ｄａｔａ
　　选取海棠野生种样本的相似性系数进行聚类分
析，得到野生种亲缘关系树状图（图３）。在相似性
系数为０．８０处，可将这些采自秦巴山区的野生苹果
属海棠聚为４组：Ⅰ组为山荆子系，包括湖北海棠、
垂丝海棠和山荆子；Ⅱ组为三叶海棠系，包括三叶海
棠；Ⅲ组为陇东海棠系，包括变叶海棠、陇东海棠；Ⅳ
组为滇池海棠系，包括滇池海棠和河南海棠（图３）。
　　试验中的栽培种包括平邑甜茶、八棱海棠、西府
海棠、花红、楸子、海棠花、海红果等，这些栽培种没
有野生种的自然分布区，尽管存在着一些栽培种的
亲本记载，但其亲本尚存在不确定性。试验表明，这
些栽培种均可以与中国的野生海棠聚类在一起（图
２）。
２６１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
图３　海棠野生种ＡＦＬＰ分析亲缘关系树状图
Ｆｉｇ．３　Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｃｒａｂａｐｐｌｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＡＦＬＰ　ｄａｔａ
３　讨　论
３．１　苹果属与梨属、山楂属的亲缘关系
苹果最早归梨属，英国植物学家 Ｍｉｌｅｒ将Ｌｉｎ－
ｎａｅｕｓ［１３］定名的苹果从梨属中独立出来［１４］，成立了
苹果属。德国学者Ｂｏｒｋｈａｕｓｅｎ将原已定入梨属中
的４个种纳入苹果属，改名为 Ｍ．ｂａｃｃａｔａ （Ｌ．）
Ｂｏｒｋｈ（山荆子）、Ｍ．ｐｒａｅｃｏｘ（Ｐａｌ．）Ｂｏｒｋｈ（道生苹
果）、Ｍ．ｐｒｕｎｉｆｏｌｉａ （Ｗｉｌｄ．）Ｂｏｒｋｈ（楸子）、Ｍ．
ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ（Ａｉｒ．）Ｂｏｒｋｈ（海棠花）［１５］。然而，根据
苹果属与梨属和山楂属形态特征存在的相似性及其
在全球范围分布带的多相重复性，可以推断出苹果
属与梨属和山楂属存在着共祖关系［１５］。目前苹果
属植物出现中间杂种的事实也反映了他们之间有较
近的亲缘关系。
本试验采用 ＡＦＬＰ技术，从ＤＮＡ角度对３个
属的亲缘关系进行了分析，结果发现，苹果属、山楂
属（裂叶山楂、山楂、辽宁山楂、野山楂）、梨属（白梨
和沙梨）材料在相似性系数为０．７３处被聚类在３个
不同的组，表明虽然苹果属与梨属和山楂属亲缘关
系较近，但用分子标记的方法可以将苹果属与梨属、
山楂属完全区分开，支持了前人依据形态学特征对
苹果属、梨属、山楂属分类的科学性，也进一步证明
了将ＡＦＬＰ分子标记用于植物分类的可行性。
３．２　海棠野生种的亲缘关系
秦巴山区作为我国重要的植物种质资源分布中
心，其海棠资源主要有以下几种：山荆子、湖北海棠、
垂丝海棠、三叶海棠、变叶海棠、陇东海棠、河南海
棠、滇池海棠［１６］。根据 Ｒｅｈｄｅｒ［１７］对苹果属植物的
分类，这些野生种可被分为４个系：山荆子系（山荆
子、湖北海棠和垂丝海棠）、三叶海棠系（三叶海棠）、
陇东海棠系（变叶海棠、陇东海棠）和滇池海棠系（河
南海棠、滇池海棠）。
Ｒｅｈｄｅｒ分类系统将山荆子、湖北海棠、垂丝海
棠都列在山荆子系（Ｓｅｒ．Ｂａｃｃａｔａｅ），而之后Ｌａｎｇｅｎ－
ｆｅｌｄｓ［１８］的分类系统主张将多型性发达的湖北海棠
种提升为湖北海棠系（Ｓｅｒ．Ｈｕｐｅｈｅｎｓｅｓ）。李育
农［１１］支持Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄｓ的主张，新建了湖北海棠系，
包含湖北海棠和垂丝海棠２个种。
本研究结果表明，湖北海棠首先与山荆子聚在
一起，然后二者再与垂丝海棠聚在一组，因此，根据
亲缘关系远近不能将湖北海棠系（湖北海棠、垂丝海
棠）与山荆子系分开。本研究结果支持Ｒｅｈｄｅｒ将湖
北海棠和垂丝海棠列在山荆子系的分类方法，不支
持Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄｓ建立独立的湖北海棠系的分类方
法。
本研究根据 ＡＦＬＰ分子标记对上述野生种的
聚类分析结果与Ｒｅｈｄｅｒ的形态学分类基本一致，仅
滇池海棠的聚类存在差异，滇池海棠没有与河南海
棠聚在一起，反而与陇东海棠和变叶海棠聚在一起，
与 Ｒｅｈｄｅｒ的形态学分类结果有所差别。但是与
Ｈｕｃｋｉｎｓ［１９］在Ｒｅｈｄｅｒ分类系统上进行调整的结果
一致，Ｈｕｃｋｉｎｓ将陇东海棠系（Ｓｅｒ．Ｋａｎｓｕｅｎｓｅｓ）与
滇池海棠系（Ｓｅｒ．Ｙｕｎｎａｎｅｎｓｅｓ）合并。
３．３　海棠栽培种的亲缘关系
Ｒｅｈｄｅｒ［１７］根据形态学特征推断，西府海棠可能
是由山荆子和海棠花杂交而成。由本次聚类结果可
以看出，西府海棠与山荆子和花红聚类在一起，而与
海棠花的亲缘关系较远，因此推断西府海棠可能是
由山荆子和花红杂交而成。从地理起源方面看，西
３６１第８期 徐　曼，等：苹果属海棠亲缘关系的ＡＦＬＰ分析
府海棠起源于西府，在历史上位于陕西的宝鸡市被
称作西府，而花红同样起源于西北地区，在宝鸡周围
的秦岭山区有大片分布区，因此花红作为西府海棠
亲本的可能更大。
在苹果属植物中，常存在同名异物和同物异名
的现象，容易引起混淆，还需要进一步研究统一。根
据中国植物志记载，西府海棠果皮红色［２］，而陕西西
府海棠果皮黄色，通过对中国科学院植物所西府海
棠（中国植物志所用样本）和陕西西府海棠亲缘关系
的研究发现，二者相似性系数接近于１，应为同一个
栽培种。因此，建议将果皮黄色纳入西府海棠的描
述中。
综上所述，利用ＡＦＬＰ分子标记方法进行野生
植物的亲缘关系研究，补充了传统形态学分类方法
的不足，得出以下结论：１）本研究可以将苹果属与梨
属、山楂属完全区分开，也证明了前人依据形态学特
征对苹果属、梨属、山楂属分类的科学性；２）苹果属
内的聚类结果与传统的形态学分类基本一致，并且
能解决不同形态学分类系统间存在差异的问题，如
聚类结果支持Ｒｅｈｄｅｒ将湖北海棠和垂丝海棠列入
山荆子系的分类方法，不支持Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄｓ建立独
立的湖北海棠系的分类方法；３）海棠栽培种和野生
种聚类分析结果表明，秦巴山区野生海棠种质资源
在海棠品种的培育中发挥着重要作用。另外，
ＡＦＬＰ标记为遗传背景不清楚材料的父母本鉴定提
供了一种可行的方法，它可以为新品种的开发和利
用提供理论依据。
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
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（上接第１６４页）
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（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
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Ｙｏｒｋ：Ｍａｃｍｉｌａｎ　Ｃｏ，１９４０：３８９－３９９．
［１８］　Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄｓ　Ｖ．Ａｐｐｌｅｔｒｅｅ　ｓｙｓｔｅｍａ　ｔｉｃｓ［Ｍ］．Ｒｉｊａ：Ｚｉｎａｔｎｅ，１９９１：
１１９－１９５．
［１９］　Ｈｕｃｋｉｎｓ　Ｃ　Ａ．Ａ　ｒｅｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｍａｌｕｓ
Ｍｉｌｅｒ［Ｊ］．Ｄｉｓｓ　Ａｂｓｔｒ　Ｉｎｔ，１９７２，３３（３）：１０３１．
３７１第８期 马金慧，等：盐渍化灌区水盐田间尺度时空分布及关联分析