全 文 ：果 树 学 报 2009，26（6）: 830～835
Journal of Fruit Science
果梅 nSSR、cpSSR引物在李属
果树上的通用性分析
韩 键 1，王化坤 1，2，练春兰 3，周 杰 1，高志红 1，章 镇 1*
（1南京农业大学园艺学院，南京 210095； 2江苏省太湖常绿果树技术推广中心，江苏苏州 215107；
3东京大学亚洲自然环境科学中心，日本东京 188-0002）
摘 要: 用来自果梅的 17 对 nSSR 引物和 13 对 cpSSR 引物，对李属果树桃、李、梅、杏、樱桃 5 个树种的 24 个基因型
进行了扩增，以分析其在李属不同果树上的通用性。结果显示，有 13 对 nSSR 引物和 13 对 cpSSR 引物得到多态性扩
增，分别占所用引物的 76.5%和 100%，平均 PIC 值分别为 0.591 和 0.654。 其中，9 对 nSSR 引物和 11 对 cpSSR 引物
具有高多态性信息含量，可用于李属果树基因组学和遗传育种方面的研究，显示出果梅 SSR 引物在李属类果树中具
有很好的通用性。
关键词: 果梅； nSSR； cpSSR； 核果类； 通用性
中图分类号：S662．4 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2009)06－830－06
Analysis of the universality of using primers of nSSR and cpSSR from
Japanese apricot （Prunus mume）on Prunus fruit trees
HAN Jian1，WANG Hua-kun1，2，LIAN Chun-lan3，ZHOU Jie1，GAO Zhi-hong1，ZHANG Zhen1*
（1College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095 China； 2Taihu Lake Extension Center for Evergreen Fruit
of Jiangsu Province， Suzhou， Jiangsu 215107 China； 3Cen of Asian Nat Envir Sci， Tokyo University，Tokyo 188-0002 Japan）
Abstract: Seventeen nSSR and thirteen cpSSR primer pairs developed from Japanese apricot （Prunus mume Sieb. et Zucc.）
were employed to amplify microsatellites in 24 genotypes of peach，plum，Japanese apricot，apricot and cherry for detecting
the universality of these primers used in Prunus fruit trees. The results were as follows: polymorphic DNA bands were ampli-
fied by PCR with 13 nSSR and 13 cpSSR primer pairs which occupied 76.5 percent and 100 percent among the total screened
ones. The average polymorphism information contents （PIC） of nSSR and cpSSR markers were 0.591 and 0.654 respec-
tively. High polymorphism was displayed with 9 nSSR and 11 cpSSR primer pairs that could be applicable to study genome，
genetics and crop breeding of Prunus fruit trees. This study demonstrated that 9 nSSR and 11 cpSSR primer pairs developed
from Japanese apricot had universality in detecting DNA polymorphism in Prunus fruit trees.
Key words: Japanese apricot （Prunus mume Sieb. et Zucc.）； nSSR； cpSSR； Prunus fruit trees； Universality
核微卫星，又称为简单序列重复（nuclear simple
sequence repeat， nSSR）， 是由 1～6 个碱基为重复单
元的串联重复序列， 广泛分布于大部分真核生物的
核基因组。 由于其具有高变异性、重复性、共显性和
在真核生物中的丰富性使得 SSR 成为在亲缘关系
分析、品种鉴定、遗传连锁图谱构建和群体遗传分析
等方面有用的分子工具 [1-3]。 叶绿体微卫星（cpSSR）
由于具有微卫星标记高多态性、分布广泛性等优点，
又兼顾到叶绿体基因组结构简单、相对保守、单亲遗
传等特点，近年发展很快，已经成为一种新型高效的
分子标记技术[4]。 目前，cpSSR 技术已广泛应用于植
物群体遗传结构、系统发育、基因流动、进化、物种演
化、胞质遗传特性、种群分类等方面研究[2，5-6]。 然而，
目前 nSSR 应用的瓶颈是引物数量有限， 一个主要
原因是现有 SSR 引物分离方法的效率低下 [7]。 建立
基因文库是开发微卫星引物中采用最多的方法，技
术路线成熟[8]，但工作量大，需要较多的资金投入，目
前只在少数模式植物中得到大量开发。 cpSSR 开发
方法可借鉴 nSSR 的开发方法。 但从植物中提取高
纯度高质量完整的 cpDNA 很困难，且目前绝大多数
收稿日期： 2009－05－19 接受日期: 2009－08－24
作者简介： 韩键，男，讲师，在读硕士生，研究方向为果树分子生物学。 Tel: 025-84396792，E-mail: hanjian@njau.edu.cn
觹 通讯作者。 Author for correspondence． Tel: 025-84394724，E-mail: Zhangzhen_nj@hotmail.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2009.06.015
图 1 C03 在核果类果树上的扩增图谱（样品编号同表 1）
Fig. 1 Amplification patterns with C03 in stone fruit trees
（sample code same as table 1）
6 期
植物的叶绿体 DNA 序列还是未知的，cpSSR 引物开
发方面的研究是十分困难的。 目前国内除以拟南芥
为模板开发了柑橘及其近缘植物 cpSSR[9]及王化坤[7]
以果梅为模板开发的 17 对引物外， 还没有其他报
道。
有研究表明从一个基因组中分离出来的 SSRs
可以用于同种、同属中的其他个体 [10-11]，这样就可
以大大降低 SSR 的开发成本，为 SSR 的广泛应用
创造条件。 桃、李、梅、杏、樱桃在植物学分类上属
蔷薇科李属植物，栽培学分类上属核果类 [12]，亲缘
关系较近 。 目前已有关于桃 [Prunus persica（L.）
Batsch] SSR 引物用于其他李属果树的报道， 如杏
（P. armeniaca）[13]； 甜樱桃 （P. avium）[14]； 酸樱桃（P.
cerasus）[15-16]； P. serotina[16]；中国李（P. salicina）、欧洲
李（P. domesitica）和扁桃（P. dulccis）[17]；梅（P. mume）
[18]等的报道。但果梅上目前开发的 SSR引物很少，未
见有应用到其他树种的报导。 我们将本实验室以果
梅为模板开发的 nSSR 和 cpSSR 引物[7]，在核果类果
树上进行通用性分析， 以丰富核果类果树 nSSR 和
cpSSR 引物的数量， 以较少的投入， 获得更多的信
息，应用 SSR 标记进行核果类基因组学和遗传育种
的研究。
1 材料和方法
1.1 材料
采集桃、李、梅、杏、樱桃等 5 个核果类果树共
24 个基因型（表 1）的早春幼嫩的春梢新叶，用硅胶
干燥法保存。
1.2 DNA提取
采用改进 CTAB法提取硅胶干燥叶的 DNA[19]。
1.3 PCR扩增反应体系
1.3.1 nSSR-PCR 反应体系 反应体系为: 10×PCR
buffer 2 μL；Mg2+ 1.875 mmol·L-1；dNTPs 0.125 mmol·
L-1；引物（编号见表 2，序列见参考文献[7]）各 0.375
μmol·L-1；Tap聚合酶 0.75 U；DNA模板 20 ng， 灭菌
ddH20 补足至 20 μL。
PCR 反应在美国 MJ Research 公司生产的
PTC-100TM Programable Thermal Controller PCR 仪
上进行。 反应程序和条件为: 94 ℃预变性 4 min， 然
后 94 ℃变性 45 s，退火 45 s，（退火温度根据引物序
列由 Primer5.0 软件计算确定）72 ℃延伸 1 min，共
35 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min终止反应。PCR产
物用 6%的中性 PAGE胶进行电泳检测[7]。
1.3.2 cpSSR-PCR反应体系 反应体系: DNA 模板
5 ng， 0.2 mmol·L-1 dNTP，1×NH4 reaction buffer（67
mmol·L-1 Tris-HCl， 16 mmol·L-1 （NH4）2SO4， 0.01%
Tween-20， pH 8.8；Bioline），1.35 m mol·L-1 Mg2+， 0.2
U BioTaq DNA酶 （Bioline）和 3 个引物: 0.5 μ mol·L-1
的每一个设计引物 （编号见表 3， 序列见参考文献
[7]），其中一个引物的 5’端为 U19 （5’-GGTTTTC-
CCAGTCACGACG-3’）的尾巴和 U19 荧光引物 （0.5
μmol·L-1），灭菌 ddH20 补足至 5 μL。
PCR 反应在 Gene Amp PCR system 9700 （Ap-
plied Biosystems） PCR仪上进行扩增。PCR的程序和
条件如下: 94 ℃预变性 1 min，然后 94 ℃ 30 s，退火
30 s，72 ℃ 1 min， 共 35 个循环； 最后 72 ℃延伸 5
min终止反应。 PCR产物在 95 ℃变性 5 min，然后在
6% Long Ranger 测序凝胶 （FMC BioProducts Co.，
ME， USA） 上电泳， 电泳在 SQ-5500E 测序仪上进
行。 用 FRAGLYS version 3 （Hitachi Co.， Japan）软件
分析等位基因的长度， 以 50～500 DNA Marker （Hi-
tachi Co.， Japan）作等位基因长度的对照标准。
1.4 数据分析
电泳后，统计每一样品扩增的 DNA 条带数及其
多态性，在同一电泳迁移位置上，有 DNA 扩增条带
记为“1”，无条带记为“0”，采用 Weir[20]的方法按下列
公式计算标记位点的多态性信息量（polymorphism
information content， PIC）。 PIC=1-∑Pi2，其中 Pi为第
i个等位基因在群体中的频率。
2 结果与分析
2.1 果梅 nSSR引物在核果类果树上的扩增
利用 17 对果梅 nSSR 对桃、李、梅、杏、樱桃等 5
个核果类果树的 24 个基因型进行了扩增和多态性
筛选， 有 13 对 nSSR 在这 24 个基因型中扩增出了
产物， 并表现出了多态性， 约占设计引物总数的
76.5%。 13 对表现出多态性的 nSSR引物（表 4）共有
50 个等位基因， 每对引物产生的等位基因数在 2～7
个，平均数为 3.85 个。其中引物 C03 在 24 个基因型
上的扩增结果如图 1所示。
PIC 值是衡量引物合适程度的重要指标， 反映
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
190 bp
韩 键等: 果梅 nSSR、cpSSR 引物在李属果树上的通用性分析 831
果 树 学 报 26 卷
表 1 试验材料
Table 1 Plant materials in this study
组
Groups
序号
Index
基因型
Genotype
采集地
Sample location
桃
Peach
李
Plum
梅
Mume
杏
Apricot
樱桃
Cherry
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
华光桃
Prunus persica var. nucipersica
喀什李光桃
P. persica ssp. ferganensis
山桃
P. davidiana
甘肃桃
P. kansuensis
陕甘山桃
P. potaninii
绥棱香蕉李
P. ussuriensis
小黄李
P. salicina
女神
P. domestica
牛心李
P. americana
美晚生
P. nigra
刺梅 1
P. mume var. pallescens
甲州小梅
P. mume
品字梅
P. mume var. pleiocarpa
四川黄梅
P. mume
长农 17
P. mume
藏杏
P. holosericea
骆驼黄杏
P. vulgaris
李光杏
P. vulgaris var. glabra
西伯利亚杏
P. sibirica
辽杏
P. mandshurica
红灯
P. avium
毛把酸
P. cerasus
中国樱桃
P. pseudocerasus
马哈利
P. mahaleb
江苏省农业科学院
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
江苏省农业科学院
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
江苏省农业科学院
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
江苏省农业科学院
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江苏省农业科学院
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辽宁果树研究所
Liaoning Pomology Institute
辽宁果树研究所
Liaoning Pomology Institute
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南京农业大学
Nanjing Agricultural University
南京农业大学
Nanjing Agricultural University
南京农业大学
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辽宁果树研究所
Liaoning Pomology Institute
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山东果树研究所
Shandong Pomology Institute
山东果树研究所
Shandong Pomology Institute
山东果树研究所
Shandong Pomology Institute
山东果树研究所
Shandong Pomology Institute
引物揭示信息量的多少， 越高包含的信息量越大。
PIC 值主要取决于等位基因的数目和等位基因的频
率。 Botstein 等[21]首先提出了衡量基因变异程度高低
的多态性信息量指标，当 PIC>0.5 时，该引物为高
度多态性信息引物，当 0.25
物 [21]。 由表 4 可知，在 13 对表现出多态性的果梅
nSSR 材料中，除 B12，D10，AFC-26，AFC-13 等 4 对
引物 PIC 值在 0.25～0.5，为中度多态性信息引物外，
其余 9 对引物 PIC 值均大于 0.5。 13 对引物的多态
信息含量 （PIC） 幅度在 0.292~0.825， 平均值为
0.591，表明所选用引物能较高信息量地反映核果类
果树的基因多样性水平， 可作为核果类基因组学和
遗传育种研究的有效分子标记。 其中有 9 对具有高
多态性信息，可以直接在桃、李、梅、杏和樱桃上通
用。
2.2 果梅 cpSSR引物在核果类果树上的扩增
利用 13 对果梅 cpSSR 引物对桃、李、梅、杏、樱
832
6 期
表 2 nSSR 引物编号
Table 2 Primer sequences of nSSR
表 3 cpSSR 引物编号
Table 3 Primer sequences of cpSSR
表 4 13 对 nSSR 引物在核果类果树上的扩增结果
Table 4 The amplification results of 13 pairs of nSSR primers in stone fruit trees
表 5 15 对 cpSSR 引物在核果类果树上的扩增结果
Table 5 The amplification results of 15 pairs of cpSSR primers in stone fruit trees
序号
Number
编号
Index
序号
Number
编号
Index
1
2
3
4
5
6
7
8
9
AFC-26
AFC-27
AFC-13
AFC4-6-13
AFC4-6-16
C03
AFC-53
AFC-58
D010
10
11
12
13
14
15
16
17
AFC-93
AFC4-6-5
AFC-18
B12
C02
C05
D07
D08
序号
Number
编号
Index
序号
Number
编号
Index
1
2
3
4
5
6
7
Pmcp01
Pmcp02
Pmcp03
Pmcp04
Pmcp05
Pmcp06
Pmcp07
8
9
10
11
12
13
Pmcp08
Pmcp09
Pmcp010
Pmcp013
Pmcp014
Pmcp015
引物
Primers
重复类型
Repeat type
退火温度
Annealing tempeature/℃
B12
C02
C03
C05
D07
D08
D10
AFC-26
AFC-13
AFC 4-6-13
AFC-18
AFC-58
AFC-53
（GT）5TC（GT）2
（TG）3G3T3G T2（GT）4
（CA）10
（TC）6
（GA）5A（AG）3
（GA）6 （CG）3 G5 （GA）5
（GT）4GCC（TG）2
（AC）6AGAT（AC）4
（TA）5（TG）7
（CT）16（CA）14
（TG）16TA（TG）15
（TG）24C（GT）38
（TG）29
55
53
52
55
50
55
50
48
53
44
53
48
43
等位基因数
Number of allele
2
3
6
7
5
4
2
2
2
5
5
3
4
多态信息指数（PIC）
Polymorphism information content
0.374
0.579
0.781
0.825
0.731
0.657
0.374
0.292
0.346
0.764
0.717
0.577
0.665
引物
Primers
退火温度
Annealing tempeature/℃
片段长度
Size range/bp
Pmcp01
Pmcp02
Pmcp03
Pmcp04
Pmcp05
Pmcp06
Pmcp07
Pmcp08
Pmcp09
Pmcp10
Pmcp13
Pmcp14
Pmcp15
52
52
52
52
52
52
52
52
50
52
50
52
50
168～176
179～188
206～244
206～265
287～317
309～320
247～248
182～196
278～282
157～164
241～271
188～196
209～247
等位基因数
Number of allele
5
3
7
8
9
7
2
2
4
7
11
5
6
多态信息指数（PIC）
Polymorphism information content
0.660
0.635
0.665
0.788
0.802
0.750
0.330
0.153
0.642
0.830
0.885
0.691
0.670
韩 键等: 果梅 nSSR、cpSSR 引物在李属果树上的通用性分析
桃等 5个核果类果树的 24个基因型进行了扩增，全
部扩增产生了清晰谱带，其中 13对引物出现有效扩
增，占设计引物的 100%，扩增结果见表 5。
在这 13对引物 76个等位基因位点上扩增出的
产物片段大小在 157～320 bp。 每对引物可以检测到
等位基因 2～11 个，平均每对引物 5.85 个等位位点。
在检测的所有位点上， 引物 Pmcp13 检测到的位点
最多，达 11 个，引物 Pmcp07、Pmcp08 检测等位位点
数最少，为 2 个。 其中引物 Pmcp14 在 24 个基因型
上的扩增结果如图 2所示。 由表 5 可知 ， 在 13 对表现出多态性的果梅
nSSR 材料中，除 Pmcp7，Pmcp8 2 对引物 PIC值小于
0.5 外，其余 11 对引物 PIC 值均大于 0.5，可以在核
果类果树上通用。 PIC值在 0.153～0.885， 平均值为
0.654，表明所选用的果梅 cpSSR 在核果类果树上具
有较强的通用性。
3 讨 论
微卫星两侧的序列具有较强的保守性， 如果一
个引物设计出来可以在另一个种上进行扩增， 它通
常可以用在其他种上术语称为“种间扩增”，这样用
833
果 树 学 报 26 卷
图 2 Pmcp14 在核果类果树上的扩增图谱（样品编号同表 1）
Fig. 2 Amplification patterns with Pmcp14 in stone fruit trees（sample code same as table 1）
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M
200
bp
200
于分离每个物种 SSR 的时间和花费可以减省下来，
从少数模式生物中获得的遗传信息可以迅速地应用
到许多经济价值大、 但基础理论研究比较薄弱的作
物中去[22]。这种想法最初在动物中得到证实。微卫星
引物在种间、属间，甚至不同物种间的通用性已经在
很多植物上发现（“越种扩增”）。目前，果树上不同树
种间 SSR 分子标记通用性研究报道已有很多 。
Cipriani 等 [23]从桃中开发的引物能在栽培桃、罐藏
桃、日本李、欧洲李、杏、甜樱桃和酸樱桃上得到成功
地扩增。 Yamamoto等[24]将苹果中分离的微卫星引物
在梨的遗传多样性分析中得到成功应用。 王彩虹
等 [25]用来自苹果基因组的 6个 SSR 标记引物对蔷薇
科的 6 个属 19 个种的基因组 DNA 进行了 PCR 扩
增，结果表明，这些 SSR 引物几乎在所有的供试物
种上都能扩增出与在苹果上大小相似的 SSRs产物。
郑丽珊等[26]应用棉花上开发的 SSR 引物在香蕉上得
到了有效扩增， 进一步说明转移扩增的多态性 SSR
引物也具有较强的实用性。 研究利用 17 对果梅
nSSR引物在核果类果树桃、李、梅、杏、樱桃 24 个基
因型间进行通用性分析， 其中 76.5%的引物得到了
有效扩增，高于 Cipriani 等[23]利用桃 nSSR 在相关树
种中获得 59%的扩增， 显示出较高的开发效率。
Dirlewanger 等 [14]报道，来自桃的 SSR 在李属种间具
有较高的通用性，本研究同样显示梅的 SSR 在李属
核果类果树中具有较高的通用性， 这可能是由于核
果类果树之间亲缘关系较近，遗传背景差异小，物种
间的同源性高，而有效转移扩增的效率也高。
限制 cpSSR 应用的最主要的难点是引物的筛
选和设计。由于其引物来源受限，高等木本被子植物
中的应用仅在猕猴桃 [27]、柑橘类 [9，28]、欧洲栗 [29]、栗
属 [30]等果树中有报道。 由于叶绿体基因组本身相对
保守，以及用于开发引物的 cpSSR 相连区域的保守
性， 一个树种设计的引物可以成功地用于扩增近缘
种的 cpSSR[31]。 研究对 13对果梅 cpSSR引物在核果
类果树 24 个基因型间进行了通用性分析， 其中 13
对出现多态性扩增， 占设计引物的 100%， 高于
nSSR比例，通用性高，显示出叶绿体高度的保守性。
尽管 cpDNA SSR 的多态性不如核 DNA SSR 的多态
性强[32]，但是可检测到不同属、种、品种 cpDNA 的差
异和突变， 在区别亲缘关系很近的基因型方面有其
特有的优势[33]。 桃、李、梅、杏、樱桃均属李属植物，亲
缘关系较近，本研究中 13 对 cpSSR 引物的平均 PIC
值达 0.654， 高于 13 对 nSSR 引物的平均 PIC 值
0.591，在研究核果类果树亲缘关系方面更有用。
本研究通过将果梅上开发的 nSSR，cpSSR 引物
在核果类果树上进行通用性分析， 结果显示大部分
引物可以通用， 丰富了核果类果树 SSR 标记的数
量， 进一步弥补了部分树种 SSR 标记数量不足，节
约了开发成本，这对于植物种质资源研究，尤其是构
建高密度遗传图谱及种质资源的收集保存和评价都
有着重要意义。
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