全 文 ：1312 环球中医药 2015 年 11 月第 8 卷第 11 期 Global Traditional Chinese Medicine，November 2015，Vol. 8，No. 11
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(收稿日期:2015-08-18)
(本文编辑:蒲晓田)
基金项目:国家国际科技合作专项(2011DFA31370)
作者单位:100102 北京中医药大学中药学院［臧艺玫(硕士研究生)、顾选、肖瑶、刘春生、马长华］，针灸推
拿学院(赵百孝) ，中医养生学研究所(韩丽) ;北京华邈中药工程技术开发中心(顾选) ;河南省药品审评认证中心
(余春霞)
作者简介:臧艺玫(1990 － ) ，女，2013 级在读硕士研究生。研究方向:药用植物与分子生药学。E-mail:meiy-
ee0810@ sina． com
通讯作者:赵百孝(1963 － ) ，教授，博士生导师。研究方向:针灸推拿。E-mail:baixiao100@ gmail． com
基于 DNA 条形码—产地—形态分析联用
的巴西马钱属植物药 QUINA基原鉴定研究
臧艺玫 顾选 余春霞 肖瑶 赵百孝 刘春生 马长华 韩丽
【摘要】 目的 通过 DNA条形码—产地—形态分析联用的方法对巴西马钱属植物药 QUINA
进行基原鉴定研究，为这种药材的开发利用提供依据。方法 通过提取样品 DNA、PCR扩增及双向
测序，获得样品的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列，利用 NCBI数据库中的 BLAST
功能计算相似度，对其基原进行 DNA条形码鉴定;根据其产地信息对 DNA 条形码鉴定结果进行筛
选和分析;依据其形态特征验证鉴定结果。结果 本次收集的植物类药材 QUINA 来源于马钱科马
钱属植物 Strychnos pseudo quina A． St． -Hil．的根皮。结论 DNA条形码—产地—形态三者联用的方
法可弥补单一鉴定方法的不足，能够快速、准确的对未知样品进行基原鉴定。
【关键词】 马钱属; ITS序列; 基原鉴定
【中图分类号】 R284． 1 【文献标识码】 A doi:10. 3969 / j. issn. 1674-1749. 2015. 11. 010
The variety identification of QUINA in Brazil based on a combined analysis of DNA barcoding-ori-
gin-morphology ZANG Yi-mei，GU Xuan，YU Chun-xia，et al． School of Chinese Materia Medica，Bei-
jing University of Chinese Medicine． Beijing 100102，China
Corresponding author:ZHAO Bai-xiao，E-mail:baixiao100@ gmail． com
【Abstract】 Objective To study the variety identification of QUINA of Strychnos Linn． with the
combined analysis of DNA barcoding-origin-morphology and provide an evidence for the exploitation of this
kind of herbal in Brazil． Methods ITS sequences were amplified by PCR from genomic DNA and se-
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quenced．，BLAST(basic local alignment search tool)in NCBI database was used to calculate the similarity
of sequences to identify the variety of samples;then the DNA barcoding identification results were screened
and analyzed in reference to its origin information;finally，the morphological characteristics of samples was
used to verify the accuracy of identification． Results QUINA collected from market in Brazil was the root
bark of Strychnos pseudo quina A． St． -Hil． Conclusion The combined analysis of DNA barcoding-origin-
morphology could make up for the deficit of onefold identification method． It contributes to identifying the
variety of unidentified samples quickly and accurately．
【Key words】 Strychnos Linn．; ITS sequence; Variety identification
巴西蕴含丰富的植物资源［1］，其中许多植物具
有药用价值［2］。由于没有植物药药典，巴西植物药
的品种鉴别主要依靠口授家传［3］，导致其药材市场
伪品混杂。因此，建立一套规范化的基原鉴定方法
对保证巴西植物药的用药安全具有重要意义。
随着分子生物学的发展，DNA 条形码技术为物
种鉴定提供了新的依据，其具有准确、快速、能鉴别
无背景信息物种的优点［4-7］，但由于存在相似度阈
值等问题，仅依靠 DNA条形码鉴定不能准确完成物
种鉴定，还需结合该属物种在巴西的分布情况对数
据库中的物种进行筛选，最终参照文献核对该物种
的性状和显微特征，判断入药部位的合理性。
巴西将可以提取到奎宁成分的 29 种苦味植物
药统称 QUINA［8］，但这些不同来源的植物药中其他
的化学成分差异较大，药理作用也不甚相同，一旦
混用将带来严重的安全隐患。作者在巴西市场收
集药材样本时发现名为 QUINA 的药材，其基原可能
为马钱属植物，但品种难以确定。本文尝试利用
DNA条形码—产地—形态分析联用的方法对缺少
背景信息的该马钱属植物药进行基原鉴定研究，为
其安全、正确的使用提供依据。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
QUINA药材 3 份，每份 200 g，2012 年 4 月购买
于巴西隆城市场药材集散地。样品的凭证标本保
存于北京中医药大学大学标本室。
1． 2 试剂
广谱植物基因组 DNA 快速提取试剂盒(北京
博迈德生物有限公司，批号:69632855) ;rTaq酶(上
海生工生物工程有限公司，批号:695671BE)、乙醇
(北京化工厂，批号:1124120381060079) ;琼脂糖
(BIOWEST，批号:142045) ;ddH2O等。
1． 3 仪器
显微镜(OLYMPUSCX-21，中国) ;SY-601 超级
恒温水浴(天津欧诺仪器仪表有限公司) ;L-901 涡
旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ;
JA1103N千分之一精密电子天平;SIGMA3K-15 低
温高 速 离 心 机 (SIGMA 公 司) ;TECHNE TC-
3000PCR扩增仪，Bio-Rad电泳仪，水平电泳槽(北京
六一仪器厂) ;JS-680B全自动凝胶成像分析仪(上海
培清科技有限公司) ;GRANT 制冰机，超纯水制备系
统;KQ5200E型超声波清洗器;SANYO －80℃超低温
冰箱(SANYO公司) ;DHG-9145A型电热恒温鼓风干
燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)等。
1． 4 DNA提取和 PCR扩增方法
取 3 份样品，观察形态，形态结果一致。每份样
品取 40 mg进行 DNA 提取。各份样本分别用液氮
冷冻后研磨成细粉，按照广谱植物基因组 DNA 快速
提取试剂盒操作步骤提取样品 DNA，1%琼脂糖凝
胶电泳检查 DNA 纯度及完整性。采用内转录间隔
区(internal transcribed spacer，ITS)序列通用引物对
样品进行 PCR扩增，ITS-R:5-CGTAACAAGGTTTC-
CGTAGGTGAA -3，ITS-F:5-TTATTGATATGCTTA-
AACTCAGCGGG -3。PCR扩增条件:50 μL 体系含
2 × Taq PCR MasterMix 25 μL，ITS-R(5 μmol /L)2．
5 μL，ITS-F(5 μmol /L)2． 5 μL，DNA 模板 4 μL，
ddH2O 16 μL。PCR 扩增程序:94 ℃预变性 5 分
钟，94 ℃ 变性 1 分钟，55 ℃ 退火 1 分钟，72℃ 延伸
1 分钟，35 个循环;72℃再延伸 10 分钟。PCR 产物
经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，条带单一明亮者即
扩增成功。PCR扩增产物经纯化后，送上海生工生
物工程有限公司测序部测序。各样品均采用正向
和反向测序，以保证测序的准确性。
1． 5 DNA 条形码鉴定方法
利用 ContigExpress 软件对测序获得的正、反向
序列进行拼接，以 TCGA/T和GACCC /TC作为 ITS序
列边界截取 ITS 序列，然后利用相似度法分析序列。
根据 NCBI 中相似度搜索法(basic local align-
ment search tool，BLAST)功能，检索样品的 ITS 序列，
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本文以相似度 90%以上为属的鉴定依据，以相似度
97%以上的最高相似度物种为物种鉴定依据，获得鉴
定结果。若 BLAST 比对后得到的序列相似度均在
97%以下，则认为数据库中可能未注册该序列，此时，
根据“基于 ITS序列的鉴定方法”仅能鉴定到属水平;
该属中未注册序列的物种可能为鉴定结果。
1． 6 基于产地分析的鉴定方法
根据“基于 DNA 条形码鉴定方法”项下获得的
科、属和种的鉴定结果，依据《巴西植物志》记载的
巴西分布的该属植物物种信息，依次分析最高相似
度物种的产地是否相符合，如果符合，则为产地鉴
定结果，继续进行下一项分析;如果不符合，则分析
第二高相似度物种，以此类推，分析直至相似度
97%的物种。若相似度在 97%以上的物种产地均
与样品产地不相符合，则认为数据库未注册该样品
序列，无法根据“基于产地分析的鉴定方法”准确鉴
定到种水平。
1． 7 基于性状分析的鉴定方法
根据“基于产地分析的鉴定方法”项下获得的
鉴定结果，查询植物志(efloras)等数据库的形态信
息，按照《中华人民共和国药典》(一部)中性状和显
微鉴定的方法，核对性状特征和显微特征，进一步
证实鉴定物种结果和入药部位。
2 结果
2． 1 DNA条形码分析鉴定结果
2． 1． 1 科属的鉴定 3 份样品的测序峰图良好，测
序结果一致，选择一条序列用于后续分析。截取
ITS片段后，经 BLAST 检索，样品与马钱科马钱属
Strychnos L．植物相似度最高，相似度范围为 95% ～
99%，与其他属相似度均低于 95%。因此，该样品
来自马钱科马钱属 Strychnos L．植物。
2． 1． 2 种的鉴定 经 BLAST 检索，相似度达到
97%以上的物种有 Strychnos pseudo quina A． St． -Hil．
(JF938028． 1， 99%)、 Strychnos ecuadoriensis
(JF937975． 1，98%)、Strychnos cogens(JF937962． 1，
98%)及 Strychnos mitscherlichii(JF938007． 1，98%)。
故上述植物可能为巴西植物药 QUINA的基原，其中，
最佳鉴定结果为 Strychnos pseudoQuina A． St． -Hil．。
2． 2 基于产地分析的鉴定结果
巴西植物志记载马钱科马钱属共有 35 种植物，
ITS序列的最佳鉴定结果 Strychnos pseudoQuina A．
St． -Hil．在巴西分布［8-9］，因此，根据产地分析巴西植
物药 Quina 的基原为 Strychnos pseudoQuina A．
St． -Hil．。
2． 3 基于形态分析的鉴定结果
样品的性状特征如下:浅槽状，有的为不规则
片状或块状。厚 1． 0 ～ 10． 0 mm。外表面红棕色或
棕褐色，多刮去外层栓皮，具“龟裂状”浅沟纹，和
“疙瘩状”突起，粉性;内表面偶见根痕，纤维性。质
脆，易折断，断面多分为两层，内层棕黄色或浅棕红
色，外层红棕色或棕褐色，有时两层分开。气微，味
极苦，见图 1。可知本样品与马钱属植物性状特征
较为符合，入药部位为根皮。
图 1 QUINA的性状图
样品的粉末显微特征如下:粉末黄棕色;木栓
细胞黄棕色，表面观多角形，侧面观呈栅栏状;石细
胞类圆形、多角形、长方形或少数呈纺锤形，纹孔及
孔沟明显;晶鞘纤维纤维束周围薄壁细胞中常含草
酸钙方晶，形成晶鞘纤维，见图 2。
由于以上显微特征专属性不强，且缺少参考资
料，无法根据显微特征对该样品基原进行准确鉴定。
1．木栓细胞 2．石细胞 3．晶鞘纤维
图 2 QUINA的显微图
3 讨论
DNA条形码分子鉴定技术为植物药基原物种
的鉴定提供了强有力的科技支撑，但也存在如下
问题:由于生物进化机制的复杂性，如多倍化现
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象，基因水平转移，基因渗入和物种谱系分选不完
全等，经常造成物种树与基因树不一致，导致 DNA
条形码序列在一些物种间没有鉴别力［10］;一些物
种序列尚未登录 NCBI核酸数据库，因此通过分子
鉴定技术仅能够鉴定到属，但不能准确鉴定到物
种水平;一些物种没有准确的鉴定阈值且参比对
照序列时常变化，导致鉴定标准难以统一;一些物
种在 NCBI核酸数据库中比对后会出现相似度在
99%以上物种有两个甚至多个的情况，构建邻接
树时则会出现不同物种聚为一支的现象，因而无
法准确进行物种鉴定。综上所述，仅依靠 DNA 条
形码技术还不能满足植物药溯源及鉴定的要求。
产地适宜性是大部分药用植物的固有性质，不同
物种在不同国家的分布有所不同，因此产地信息
对植物药的基原鉴定起到了辅助作用;植物的形
态特征，包括性状特征及显微特征，是判断入药部
位的重要依据。先利用分子鉴定的方法对无背景
信息的药材进行品种溯源，再结合该药材的产地
及形态信息对分子鉴定结果进行筛选和验证，最
后利用形态特征判断药材的入药部位，三种方法
相互补充，弥补了单一鉴定方法的不足，能够快
速、准确地对未知样品进行基原鉴定。
本研究结果表明，本次收集的巴西植物药 QUI-
NA来源于马钱科马钱属 Strychnos pseudo quina A．
St． -Hil．的根皮。在巴西，Strychnos pseudo quina A．
St． -Hil．的根皮一直是提取奎宁的原料之一，用以治
疗发热、疟疾等症［8］。因此，中国也可以此为依据，
尝试在马钱属植物中提取奎宁。
2010 版《中国药典》收录的马钱属药材为马钱
Strychnos nux-vomica L． 的干燥成熟种子［11］。马钱
子的主要成分是单萜吲哚类生物碱，包括马钱子碱
(brucine)、伪马钱子碱(pseudobrucine)、番木鳖碱
(stryehnine)、4-羟基士的宁 (4-hydroxystrychine)
等［12-15］。药理研究显示，马钱子提取物具有肌松、
中枢神经系统兴奋、镇痛、治疗风湿性关节炎等作
用且疗效显著［16-19］。Strychnos pseudo quina A． St． -
Hil．的根皮中也含有生物碱类［8］，具体的化学成分还
鲜有报道，但已有研究表明，皮刺马钱(strychnos ac-
uleata)、里渥马钱(strychnos castelneana)等马钱
属其他植物的根皮中也含有多种吲哚类生物碱，
如黑马钱碱(nigritanins)、裸籽士的宁(spermos-
trychnine)、N-乙酰基异华采马钱 碱 (n-acetyl-
isostrychnosplendine)［20］等，与马钱子的主要成分相
似。因此，可对 Strychnos pseudo quina A． St． -Hil．和
其他马钱属植物根皮提取物的化学成分及药理活
性进行深入研究，以期扩大马钱属植物的药用资源。
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