全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 21(4):366 ～ 369 , 2009
浙江海宁月季上发现李属坏死环斑病毒
朱良俊1 ,商晗武2 , ＊ ,郑　丹2 ,黄特跃1
(1 浙江理工大学生物工程研究所 ,浙江 杭州 310018;2 中国计量学院 生命科学学院 ,浙江 杭州 310018)
摘　要:采用双夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA), 对杭州 、嘉兴 、绍兴 3 市 6 县(市 、区)的果树园林植物进行
李属坏死环斑病毒病的病情调查 ,采集检测样品包括樱桃 、桃 、李 、杏和月季等 12 种寄主植物共计 102 个。结
果表明 , 10个海宁月季样品的 ELISA结果呈阳性 , 其他样品呈阴性;阳性样品经 RT-PCR检测和 CP 基因测序
验证 ,确认海宁月季感染了李属坏死环斑病毒。
关键词:李属坏死环斑病毒病;双夹心酶联免疫吸附法;RT-PCR;疫情;CP 基因
中图分类号:S432.41　　　　　　文献标识码:A 文章编号:1004-1524(2009)04-0366-04
Identification of Prunus necrotic ringspot virus from the rose samples in Haining ,
Zheijiang Province
ZHU Liang-jun1 ,SHANG Han-wu2 , ＊ ,ZHENG Dan2 ,HUANG Te-yue1
(1 Institute of Bio-engineering , Zhejiang Sci-Tech University , Hangzhou 310018 , China ;2College of life sciences , China
Jiliang University , Hangzhou 310018 , China)
Abstract:A survey on Prunus necrotic ringspot virus disease of plants in Hangzhou , Shaoxing and Jiaxing areas was under-
taken during 2007-2008.Total 102 samples of twelve fruit and ornamental host plants including cherry , peach , plum , al-
mond , and rose were collected for detection.The results showed that 10 of 14 rose samples from Haining county were DAS-
ELISA positive , which was then comfirmed by RT-PCR and sequencing of the CP gene.It was concluded that these ten rose
samples from Haining County , Zhejiang Province , were infected by Prunus necrotic ringspot virus.
Key words:Prunus necrotic ringspot virus(PNRSV);DAS-ELISA;RT-PCR;occurrence;CP gene
　　李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot
virus , PNRSV)属雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)等
轴不稳环斑病毒属 (Ilarvirus), 是一种可侵染
桃 、樱桃 、杏 、月季和李等 21科果树 、蔬菜和花卉
等经济作物的正链 RNA病毒 ,被列为我国农业和
进境检疫性有害生物[ 1 ,2] 。寄主被 PNRSV 侵染
后的常见症状有:叶片褪绿 、坏死或扭曲;植株皱
缩 ,叶片形成环斑穿孔 ,或线斑 、带纹和花叶斑
收稿日期:2009-01-21
基金项目:浙江省重大科技专项(2006C12020);浙江省教育厅
(2005079411)
作者简介:朱良俊(1984-),男 , 浙江永嘉人 , 硕士研究生 ,研究
方向为外来生物检测技术。 E-mail:zlj0906@126.com
＊通讯作者 ,商晗武 , E-mail:hwshang@cj lu.edu.cn;Tel:86-571-
86875629
驳;芽 、叶 、枝梢和根等坏死 ,树木整体表现为矮
化 、生长迟缓 、树体衰弱并大量减产 ,严重的可导
致树皮坏死 、癌肿直至死亡[ 2] 。我国自 1989年首
次在陕西发现其危害后 ,辽宁 、北京和云南等相
继报道了该病毒病的发生危害[ 3～ 7] ,如 1998年调
查陕西省甜樱桃 、桃上的感染率为 48%,严重的
生长量减少 34.5%,产量降低 77.0%,且果实变
小 、缝合线处出现小裂口和木栓斑[ 4] ;樱桃感病
率为 45.15%,“无病毒苗圃”感染率达 12.2%[ 8] 。
2000年以来农业部全国农技推广中心组织各地
农业植物检疫部门进行疫情检测的结果表明 ,该
病毒在我国北方樱桃和桃等果树中危害严重 ,陕
西 、辽宁 、北京 、河北 、山东等省多处出现其为害 ,
危害植物包括樱桃 、桃 、苹果 、月季等 ,对我国的
核果类果树和花卉生产造成严重威胁[ 4 ,6 , 9 ,10] 。
浙江省是果树种植大省 ,全省果园面积超过
28.67万 hm2 ,其中桃 、李 、梅等核果类果树种植面
积超过 3.33万 hm2 ,同时也是花卉栽培大省 ,花
卉苗木种植面积达 10.55万 hm2(浙江省农业厅
2006年统计数据), 存在广泛的 PNRSV 寄主植
物 ,而且 ,水果和花卉生产对全省农业增产农民
增收地位举足轻重 。为了解该病毒在浙江省的
发生危害情况 ,预防该病毒的突发流行 , 2007 ～
2008年我们以杭州周边地区如西湖景区 、下沙高
教园区 、萧山 、诸暨 、富阳和海宁等地为重点 ,对
该病毒的主要寄主植物樱桃 、李 、桃和月季等 12
种果树园林植物进行了疫情调查。经 DAS-
ELISA , RT-PCR检测和测序鉴定验证 ,我省海宁
花卉基地的月季上发生了 PNRSV危害 ,相关职能
部门应采取切实有效的措施控制其危害 ,以保护
我省农业生产安全。
1　材料和方法
1.1　检测材料
从出现叶片穿孔 、枯斑和枝枯等疑似症状的
寄主植物上采集嫩叶 ,装入采样袋中按照采集地
点 、时间 、植物种类 、症状等田间记录和编号标记
后 ,放入冰盒内临时保存和携带;回实验室后立
即用于检测或置于-70℃冰箱保存待用。杭州 、
诸暨 、富阳和海宁等地共采集样品 102份 。其中
2007年 5月在杭州西湖风景区 、下沙高教园区和
萧山区等地采集樱桃 、樱花 、桃 、李 、月季 、梅 、梨 、
稠李 、红叶李等蔷薇科植物样品 42份 ,2008年 6
月杭州西湖风景区 、下沙高教园以及海宁花卉种
植基地 、诸暨和富阳果园采集了樱桃 、樱花 、桃 、
月季 、百合等样品 60份 。
1.2　双夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测
PNRSV双夹心酶联免疫吸附检测试剂盒购
自美国 Agdia公司 ,样品和缓冲液按 1∶5[ m(g)/V
(mL)] 比例研磨制备样品 , 5000 r/min 离心 10
min ,其余按试剂盒说明书操作 。阳性对照为 Ag-
dia公司提供的阳性质控物 ,阴性对照为中国计
量学院校园采集多次经 ELISA 验证表现为
PNRSV阴性的樱桃样品。每个样品 3次重复 ,样
品与阴性对照 OD405值的比值≥2时 ,判断结果为
阳性。
1.3　RT-PCR检测及克隆测序
对 ELISA检测为阳性的样品进行 RT-PCR检
测和测序验证。
用 Axygen生物技术(杭州)有限公司 RNA提
取试剂盒提取叶片总 RNA 。根据 Glasa 等[ 11] 文
献的方法 ,由上海英骏生物科技有限公司合成
CP 基因全序列引物(PNRSV1109:5 -ATG GTT
TGC CGA ATT TGC AAT-3 ;PNRSV1792:5 -ACT
CTA GAT CTC AAG CAG GTC-3 )。反转录后进行
PCR扩增 ,程序为:94℃3min;94℃1min ,55℃45
s ,72℃1 min , 35个循环;72℃ 10 min;4℃保存。
详细操作方法参见Glasa等[ 11] 。
2　结果与分析
2.1　DAS-ELISA检测
共检测了 102个样品(表 1),其中 10 个样品
OD405与阴性对照之比值大于 2 ,被判定为感染
PNRSV的阳性样品 ,PNRSV总体检出率为 9.8%。
所有检出的阳性样品均为海宁花卉基地 4个不
同种植区采集的月季样品 ,叶片表现明显的条状
纹 、花叶等 PNRSV侵染后典型症状(图 1),该基
地月季上 PNRSV 检出率达 71.4%,发病田块株
发病率为 10%～ 25%。
2.2　RT-PCR检测及克隆测序结果
用 1%琼脂糖凝胶电泳 RT-PCR扩增产物 ,阳
性样品中扩增出约 680 bp目的片段 ,与根据引物
设计的目标片段大小一致 ,而健康样品中未扩增
出相应大小的片段(图2)。由RT-PCR结果 ,确认
海宁月季感染了李属坏死环斑病毒 。
对克隆质粒的插入片断进行序列测定 ,测序
结果在 NCBI上作 blastn序列比对。结果显示本
实验扩增得到的核酸序列与 GenBank 中已知的
PNRSV的外壳蛋白核酸序列同源性在 89%～
99%之间。进一步证明海宁月季感染了李属坏
死环斑病毒 。
3　讨论
李属坏死环斑病毒病是我国从国外大量引
进种质而新传入的检疫性有害生物 ,可侵染47
·367·朱良俊等:浙江海宁月季上发现李属坏死环斑病毒
图 1　PNRSV在月季上表现的症状
Fig.1　PNRSV the performance of the symptoms in rose
表 1　杭州周边地区 PNRSV 疫情调查检测总体检测情况
Table 1　Detection and infection of PNRSV in Hangzhou surrounding areas
采样地点 检测和阳性样品数/个
检测样品 阳性样品
调查植物和采集样品
调查植物 采样数/个
杭州市 西湖风景名胜区 36 0 桃 Prunus persica 12
樱花 Cerasus serrulata 6
樱桃 Prunus spp. 4
李 F lacourtia ramontchii 2
杏 Armeniaca vulgaris 4
梨 Pyrus pyrifolia 3
海棠 Malus spectabilis 2
红叶李 Prunus cerasifera cv.pissardii 1
山楂 Crataegus pinnat ifida 1
绢毛稠李 Padus wi lsonii 1
下沙高教园区 26 0 月季 Rosa rugosa 11
樱桃 Prunus spp. 7
桃 Prunus persica 5
李 F lacourtia ramontchii 2
红叶李 Prunus cerasifera cv.pissardii 1
萧山区 10 0 樱桃 Prunus spp. 6
桃 Prunus persica 3
梨 Pyrus pyrifolia 1
富阳市 3 0 樱桃 Prunus spp. 1
李 F lacourtia ramontchii 2
绍兴市 诸暨市 7 0 樱桃 Prunus spp. 5
李 F lacourtia ramontchii 2
嘉兴市 海宁市 20 10 月季 Rosa rugosa 14
百合 Li lium brownii var.viridulum 3
桃 Prunus persica 2
李 F lacourtia ramontchii 1
小计 102 10 12 102
个属 189种植物 ,其中包括桃 、杏 、苹果 、樱桃 、西
瓜 、菜豆 、月季 、棉花 、烟草等多种果树 、蔬菜和花
卉等经济作物。该病毒可通过花粉 、种子和无性
繁殖材料等传播[ 12] ,在世界范围内广泛分布 ,其
在欧洲的阿尔巴尼亚 、意大利 、约旦 、黎巴嫩 、马
耳他 、巴勒斯坦 、西班牙 、叙利亚 、突尼斯 、土耳
其 、捷克 ,美洲的美国 、阿根廷 ,大洋洲的澳大利
亚 、新西兰等国家均有分布[ 2] 。目前我国南北方
多个省市有该病毒发生的报道[ 3～ 7] ,说明我国的
地理气候环境适宜该病害的发生 ,而且该病毒的
·368· 浙江农业学报　第 21卷　第 4期(2009年 7月)
M:DNA marker;1:健康对照;2～ 11:阳性样品
图 2　RT-PCR扩增结果
Fig.2　Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products
寄主在我国种植广泛 ,目前该病毒极有可能已成
功定殖并逐渐进入流行期。本研究通过 DAS-
ELISA和 RT-PCR的方法 ,在海宁花卉基地4个种
植区的月季上发现了 PNRSV ,而且田间调查结果
显示株发病率较高 。在本次 PNRSV病情调查的
月季样品中 ,一些表现PNRSV疑似症状的样品中
未能检测到该病毒 ,可能的原因之一为其他病原
菌侵染引起类似 PNRSV的病害症状;或因土壤 、
气候等环境因素造成的生理性异常表现;或
PNRSV侵染病毒含量少滴度低而与所使用的抗
体之间的血清学反应较弱或无血清学反应。
浙江省大量种植着该病毒最适宜的寄主植
物 ,随着农林业生产结构的进一步调整优化和对
国内外优良种子苗木的大量引进与流通 , PNRSV
在我省危害并扩散蔓延的风险必将逐年增加 ,但
目前对全省 PNRSV 疫情发生和分布情况尚缺乏
全面了解。因此 ,必须充分认识到该病毒病的危
害性和检疫防控工作的艰巨性 ,急需及时对海宁
周边地区和其他寄主进行检测 ,以及全省范围内
的疫情普查 ,以便制定果断检疫措施 ,防止其对
浙江省大量种植的桃 、梅 、李 、樱花等蔷薇科园林
景观植物及果树造成巨大危害。同时 ,有必要进
一步研究海宁病毒的来源及其株系 ,以便针对该
病毒的经济影响和分布状况开展风险评估 ,采取
更有效的防治措施。
参考文献:
[ 1] 　Hammond RW , Crosslin JM.Virulence and molecular polymor-
phism of Prunus necrot ic ringspot virus isolates[ J] .The Journal
of General Virology , 1998 , 79(7):1815-1823.
[ 2] 　万方浩 , 郑小波 , 郭建英 ,等.重要农林外来入侵物种的生
物学与控制[M] .北京:科学出版社 , 2005.
[ 3] 　魏宁生 , 吴云峰.花卉病毒病害的鉴定—(Ⅱ)[ J] .云南农
业大学学报 , 1989, 4(4):302-308.
[ 4] 　阮小凤 , 马书尚.桃病毒病调查与检测研究[ J] .西北农业
学报 , 1998 , 7(3):59-62.
[ 5] 　侯义龙 , 张开春 , 胡文玉 ,等.逆转录—聚合酶链式反应检
测果树 RNA病毒[ J] .病毒学报 , 2002, 18(1):71-73.
[ 6] 　李明福 , 张永江 , 黄冲 ,等.北京怀柔地区樱桃上发现李属
坏死环斑病毒[ J] .植物病理学报 , 2005, 35(6):552-554.
[ 7] 　王继华 , 王丽花 , 杨秀梅 ,等.侵染月季的李坏死环斑病毒
的检测及CP基因序列分析[ J] .植物病理学报 , 2007 , 37
(1):99-101.
[ 8] 　阮小凤 , 杨勇 , 马书尚 ,等.甜樱桃病毒病的 ELISA检测研
究[ J] .山东农业大学学报(自然科学版), 1998 , 29(3):277
-282.
[ 9] 　侯义龙.逆转录—聚合酶链式反应技术检测“歇马杏”主要
病毒[ J] .生物技术 , 2005 , 26(06):626-627.
[ 10] 　马云霞.我国李属坏死环斑病毒的检测与鉴定[ D] .北
京:中国农业大学农学与生物技术学院 , 2003.
[ 11] 　Glasa M , Betinova EVA , Kudela O , et al.Biological and molec-
ular characterisation of Prunus necrotic ringspot virus isolates and
possible approaches to their phylogenetic typing[ J] .Annals of
Applied Biology , 2002 , 140(3):279-283.
[ 12] 　全国农业技术推广服务中心.植物检疫性有害生物图鉴
[M] .北京:中国农业出版社 , 2001.
(责任编辑　陈华平)
·369·朱良俊等:浙江海宁月季上发现李属坏死环斑病毒