全 文 :园 艺 学 报 2009, 36 (10):1531-1537
ActaHorticulturaeSinica
收稿日期:2009-06 -12;修回日期: 2009 -08-19
基金项目:国家自然科学基金项目 (30860027)
*通讯作者 Authorforcorrespondence(E-mail:LiaoL58@yahoo.com.cn)
基于核 ITS与叶绿体 trnL-F序列分析 12种紫金牛
属植物的种间关系与变异
徐玲玲1 , 李同建1 , 张美云 1 , 易官美 2 , 廖 亮 1*
(1江西九江学院生命科学学院 , 江西九江 332000;2宁波城市职业技术学院 , 浙江宁波 315502)
摘 要:对江西紫金牛属 12种植物 17个样本及外类群柳叶密花树的核 ITS序列和叶绿体 trnL-F序列
进行最大简约法 (MP)和邻接法 (NJ)分析 , 两种方法得到的系统发育树基本一致。基于 trnL-F序列所
建立的系统发育树将 19个样本聚类成 6个分支 , 而基于 ITS序列建立的系统发育树将 18个样本聚类成 2
个分支 , 说明紫金牛属并不是一个单系类群 。基于 ITS序列建立的系统发育树将腋序组 (Ⅰ )和锯齿组
(Ⅲ)聚在一起 , 说明这两个组有较近的关系 , 而圆齿组 (Ⅱ)稍远。基于 ITS序列所建立的系统树将 4
个紫金牛样本聚类成 2支 , 说明紫金牛的群体中至少存在两个核基因组类型 , 根据染色体数 、 ITS序列和
trnL-F序列综合分析 , 推测紫金牛很可能是异源四倍体。
关键词:紫金牛属;ITS序列;trnL-F序列;种间关系
中图分类号:S687 文献标识码:A 文章编号:0513-353X (2009)10-1531-07
InterspecificRelationshipsand Variationof12 SpeciesinArdisiaSw.(Myrsinaceae)BasedonITSandtrnL-FDataSets
XULing-ling1 , LITong-jian1 , ZHANGMei-yun1 , YIGuan-mei2 , andLIAOLiang1*
(1 ColegeofLifeScience, JiujiangUniversity, Jiujiang, Jiangxi332000, China;2 NingboCityCollegeofVocationalTechnolo-
gy, Ningbo, Zhejiang315502, China)
Abstract:Thenuclearencodedinternaltranscribedspacer(ITS)regionandtheplastidencodedtrnL-F
regionweresequencedfor17 samplesfrom12 speciesofthegenusArdisiaSw.andoutgroupRapanealin-
earis.Basedonmaximumparsimonyandneighbor-joininganalyses, wereconstructedthephylogeneticrela-
tionshipsof19 samplesofArdisia.Thetwomethodsgeneratedsimilartrees.NineteensamplesofArdisiaare
separatedintosixcladesintrnL-Ftrees.EighteensamplesofArdisiaareseparatedintotwocladesinITS
trees.TheresultsshowedthatthegenusArdisiaSw.couldnotbeamonophyleticgroup.TheSect.Akosmos
(Ⅰ)andSect.Bladhia(Ⅲ )formacladeinITStrees, whichindicatedthattheywerecloselyrelated.
FoursamplesofA.japonicaformtwocladesinITStrees, whichshowedthattherewereatleasttwotypesof
nucleargenomeinA.japonicapopulation.Accordingtoanalysisofthechromosomesnumber, ITSsequences
andtrnL-Fsequences, A.japonicaissupposedtobeaalotetraploid.
Keywords:Ardisia;ITSsequence;trnL-Fsequence;interspecificrelationship
紫金牛属 (ArdisiaSw.)植物为小乔木 、 灌木或亚灌木状近草本。约 300种 , 分布于热带美洲 ,
太平洋诸岛 , 印度半岛东部及亚洲东部至南部 , 少数分布于大洋洲 , 我国共有 68个种 , 12个变种 ,
分布于长江流域以南。国产紫金牛属植物属下分为高木组 (Sect.Tinus)、 顶序组 (Sect.Acrardi-
sia)、 短序组 (Sect.Pimelandra)、 腋序组 (Sect.Akosmos)、 圆齿组 (Sect.Crispardisia)和锯齿组
DOI :10.16420/j.issn.0513-353x.2009.10.020
园 艺 学 报 36卷
(Sect.Bladhia)(陈介 , 1979)。江西紫金牛属有 12种 , 隶属腋序组 、 圆齿组和锯齿组等 3个组 。紫
金牛 (Ardisiajaponica)、 朱砂根 (A.crenata)、百两金 (A.crispa)、 血党 (A.brevicaulis)、 九节龙
(A.pusila)、虎舌红 (A.mamilata)等是该属中分布范围较广 、 资源较丰富 、药用及观赏价值较
高的类群 。
目前对紫金牛属的研究大多是在园林和药学等方面 (向春玲和冯志坚 , 2002;闫双喜 等 , 2004;
苏雪痕 等 , 2005;邓素芳 等 , 2006;吴庆书 等 , 2007);对紫金牛属 23个种 1个变种植物的花粉形
态研究表明 , 锯齿组的花粉形态有明显组的特征 (张巧玲 等 , 2007)。紫金牛属常常可以见到一些变
异体 (江香梅 等 , 2005), 大多是有开发潜力的园艺资源 (图 1), 但这些突变体的遗传学基础是否
发生了相应的变化尚不清楚 。
作者对江西紫金牛属植物及变异类型的核 ITS序列和叶绿体 trnL-F序列进行分析 , 以期为了解该
属植物种间关系及变异类型的遗传背景提供依据 。
图 1 紫金牛属植物变异类型
A.虎舌红 1 (红叶);B.虎舌红 2 (绿叶);C.朱砂根 1 (高杆);D.朱砂根 2 (矮杆);
E.紫金牛 2 (金边);F.紫金牛 3 (小叶);G.紫金牛 4 (大叶);H.紫金牛 1。
Fig. 1 VariationtypesofArdisia
A.A.mamillata1 (redleaf);B.A.mamilata2 (greenleaf);C.A.crenata1 (high-stem);
D.A.crenata2 (dwarfmutant);E.A.japonica2 (goldenedges);F.A.japonica3 (smalfoliagetype);
G.A.japonica4 (bigfoliagetype);H.A.japonica1.
1 材料与方法
1.1 材料来源
紫金牛属植物材料见表 1, 活体标本存于庐山植物园 。取新鲜嫩叶硅胶干燥后于 -20 ℃保存 。紫
金牛属其他类群的 DNA序列来源于 NCBI网站上的 GenBank。
1.2 基因组总 DNA提取
采用改良的 CTAB法 (Doyle&Doyle, 1987)提取总 DNA。取 0.1 g干燥叶片于无菌研钵中 , 液
氮速冻并将叶片研磨成粉末状 , 加入预热的 600 μL2 ×CTAB提取液 (100 mmol· L-1 Tris-HClpH
8.0, 1.4 mol·L-1NaCl, 20 mmol· L-1 EDTA, 2% CTAB, 0.1% β -巯基乙醇)65 ℃水浴 45 min,
氯仿 ∶异戊醇 (24 ∶1)抽提 , 2 /3体积冰冷的异丙醇沉淀 DNA, 各 DNA样本经 RNaseA处理后 , 再
用氯仿 ∶异戊醇抽提 , 2倍体积冰冷的 100%乙醇沉淀 DNA, 预冷的 70%乙醇洗涤沉淀 , 50 μLTE溶
解 DNA, 于 -20 ℃保存备用。
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10期 徐玲玲等:基于核 ITS与叶绿体 trnL-F序列分析 12种紫金牛属植物的种间关系与变异
表 1 试验材料及来源
Table1 Theoriginofthematerialsusedinthisstudy
分组
Section
分类群
Taxon
凭证标本
Voucher
采集地
Locality
GenBankNo.
ITS trnL-F
腋序组(Ⅰ ) 矮紫金牛 Yi070601 华南植物园 FJ482142 FJ482160
Sect.Akosmos ArdisiahumilisVahl. SouthChinaBotanicalGarden
密鳞紫金牛 Yi070602 华南植物园 FJ482151 FJ482169
ArdisiadensilepidotulaMerr. SouthChinaBotanicalGarden
圆齿组(Ⅱ) 虎舌红 1(红叶) Yi070603 江西大余 FJ482134 FJ482152
Sect.Crispardisia ArdisiamamilataHance1 JiangxiDayu
虎舌红 2(绿叶) Yi070604 江西大余 FJ482135 FJ482153
ArdisiamamilataHance2 JiangxiDayu
朱砂根 1(高杆) Yi070605 江西大余 FJ482136 FJ482154
ArdisiacrenataSims1 JiangxiDayu
朱砂根 2(矮杆) Yi070606 江西庐山 FJ482137 FJ482155
ArdisiacrenataSims2 JiangxiLushan
朱砂根 3(红凉伞) Yi070607 江西庐山 FJ482138 FJ482156
ArdisiacrenataSims3 JiangxiLushan
朱砂根 4 AF547730# AF547795#
ArdisiacrenataSims4
百两金 Yi070608 江西大余 FJ482139 FJ482157
Ardisiacrispa(Thunb.)A.DC. JiangxiDayu
血党 Yi070609 江西上犹 FJ482141 FJ482159
ArdisiabrevicaulisDiels JiangxiShangyou
莲座叶紫金牛 Yi070610 江西上犹 FJ482147 FJ482165
ArdisiaprimulifoliaGardn.etChamp. JiangxiShangyou
波叶紫金牛 Yi070611 华南植物园 FJ482148 FJ482166
ArdisiaaffinisHemsl. SouthChinaBotanicalGarden
雪下红 Yi070612 江西上犹 FJ482150 FJ482168
ArdisiavilosaRoxb. JiangxiShangyou
锯齿组(Ⅲ) 九节龙 Yi070613 江西上犹 FJ482140 FJ482158
Sect.Bladhia ArdisiapusilaA.DC. JiangxiShangyou
紫金牛 1 Yi070614 江西大余 FJ482143 FJ482161
Ardisiajaponica(Hornstedt)Blume1 JiangxiDayu
紫金牛 2(金边) Yi070615 江西大余 FJ482144 FJ482162
Ardisiajaponica(Hornstedt)Blume2 JiangxiDayu
紫金牛 3(小叶) Yi070616 江西大余 FJ482145 FJ482163
Ardisiajaponica(Hornstedt)Blume3 JiangxiDayu
紫金牛 4(大叶) Yi070617 江西庐山 FJ482146 FJ482164
Ardisiajaponica(Hornstedt)Blume4 JiangxiLushan
走马胎 AF547795#
ArdisiagigantifoliaStapf
外类群 柳叶密花树 Yi070618 华南植物园 FJ482149 FJ482167
Outgroup Rapanealinearis(Lour.)S.Moore. SouthChinaBotanicalGarden
注:#GenBank下载。
Note:#DownloadfromGenBank.
1.3 扩增与测序
使用引物 ITS1 (5′AGAAGTCGTAACAAGGTTTC3′)、 ITS4 (5′TCCTCCGCTTATTTATATGC3′)
(Whiteetal., 1990)扩增全长 ITS(包括 5.8S)区域 。 PCR反应体系为 20 μL, 内含 MgCl2
(2 mmol· L-1)、 dNTP(2 mmol· L-1)、引物 ITS1、 ITS4 (10 pmol)、聚合酶 1单位 、总 DNA约 50
ng。扩增程序为:循环 1:70 ℃ 4 min;循环 2:94 ℃ 1 min※50 ℃ 20 s※72 ℃ 50 s, 2个循环;循
环 3:94 ℃ 20 s※52 ℃ 20 s※ 72 ℃ 50 s, 40个循环;最后 , 72 ℃ 4 min。 trnL-F区扩增使用引物
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园 艺 学 报 36卷
trn“c” (5′CGAAATCGGTAGACGCTACG3′)和 trn“f” (5′ATTTGAACTGGTGACACGAG3′)(Taberlet
etal., 1991)。 PCR反应体系为 20 μL, 内含 MgCl2 (2 mmol· L-1)、 dNTP(2 mmol· L-1)、引物
trn“c”、 trn“f” (10 pmol)、聚合酶 1单位 、 总 DNA约 50 ng。扩增程序为:循环 1:94 ℃ 5 min;
循环 2:94 ℃ 45 s※48 ℃ 45 s※72 ℃ 60 s, 35个循环;最后 , 72 ℃ 6 min。PCR产物送交上海生工
生物技术服务有限公司测序 , 为保证所测序列的准确性 , 分别对每一种类的 ITS、 trnL-F序列的正 、
反链进行双向测序并校准。
1.4 排序和系统发育分析
序列排列用 ClustalX(Thompsonetal., 1997)初排 , 进一步用人工核对排列 。排列好的序列用
PAUP4.0b10 (Swoford, 2002)的简约法与邻接法 (Saitou&Nei, 1987)构建 ITS、 trnL-F树 , 进行
系统发育分析 。在简约法分析中 , 所有的空位作缺失处理 。以柳叶密花树 (Rapanealinearis)为外类
群。用 TBR分支交换与随机类群附加 1 000次 , 进行完全启发式搜索。在邻接法分析中 , 采用 Kimu-
ra2参数距离 , 构建邻接树 , 并进行 1 000次自展计算。
2 结果与分析
所有样本的 GenBank序列号见表 1。测定了紫金牛属 12种植物 17个样本及外类群柳叶密花树的
核 ITS序列和叶绿体 trnL-F序列 (图 2)。 ITS(包括 ITS1, 5.8SrDNA, ITS2)序列的长度范围为
623 ~ 629 bp, trnL-F序列的长度范围为 788 ~ 815 bp, 序列特征见表 2。当空位 (gap)作为缺失处理
时 , ITS区全序列排序后的长度为 633位点 , 其中有 90个变异位点 , 59个为系统发育的信息位点 ,
分别占 14.22%和 9.32%;trnL-F区全序列排序后的长度为 825位点 , 其中有 29个变异位点 , 9个为
系统发育的信息位点 , 分别占 3.52%和 1.09%。
以 Rapanealinearis为外类群 , 用最大简约法 (MP)与邻接法 (NJ)构建系统树 (图 3)。 ITS简
约树长度为 256步 , 一致性指数 (CI)和维持性指数 (RI)分别为 0.7266和 0.6804;trnL-F简约树
长度为 46步 , 一致性指数 (CI)和维持性指数 (RI)分别为 0.9348和 0.8929 (表 2)。
Bootstrap分析获得各分支的支持强度 , 结果见图 3。
图 2 部分 ITS和 trnL-FPCR扩增产物电泳图谱
1, 4:紫金牛 1; 2, 5:虎舌红 2 (绿叶);3, 6:朱砂根 4;M:100 bpDNAladderplus。
Fig. 2 ElectrophoretogramofPCRproductsofITSandtrnL-F
1, 4:Ardisiajaponica1; 2, 5:Ardisiamamilata2 (greenleaf);3, 6:Ardisiacrenata4;M:100 bpDNAladderplus.
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10期 徐玲玲等:基于核 ITS与叶绿体 trnL-F序列分析 12种紫金牛属植物的种间关系与变异
表 2 紫金牛属植物ITS及 trnL-F序列特征
Table2 SequencecharacteristicsofITSandtrnL-FintheArdisia
比较 Comparison ITS trnL-F
长度范围 /bpLengthrange 623~ 629 788~ 815
排列长度 /bpAlignedlength 633 825
G+C含量 /% G+Ccontentrange 55.6 33
变异位点数 Numberofvariablesites 90 29
信息位点数 Numberofpotentialyinformativesites 59 9
树长 Treelength 256 46
一致性指数(CI)Consistencyindex 0.7266 0.9348
维持性指数(RI)Retentionindex 0.6804 0.8929
重新调整的一致性指数(RC)Rescaledconsistencyindices 0.4943 0.8346
图 3 基于 ITS和 trnL-F的最大简约树
(Ⅰ ):腋序组;(Ⅱ):圆齿组;(Ⅲ):锯齿组。分支上的数值为支持率。
Fig.3 MPphylogenytreebasedonITSandtrnL-F
(Ⅰ ):Sect.Akosmos;(Ⅱ):Sect.Crispardisia;(Ⅲ):Sect.Bladhia.
Thenumbersabovebranchesarebootstrapvalues.
基于 trnL-F序列的最大简约法 (MP)和邻接法 (NJ)建立系统发育树将 19个样本聚类成 6个
分支 , 而基于 ITS序列最大简约法 (MP)和邻接法 (NJ)建立的系统发育树将 18个样本聚类成 2个
分支 , 说明紫金牛属并不是一个单系类群 (图 3)。由 trnL-F序列建立的系统树在组级 (section)水
平上分辨力并不高 , 说明紫金牛属植物的 trnL-F序列分化速率较慢 , 以致从系统发育树的根部发出 6
个分支 , 尤其是在腋序组 (Ⅰ )的矮紫金牛 、 密鳞紫金牛和锯齿组 (Ⅲ )的走马胎 , 分别在根部发
出不同的分支 , 在系统树上与同组其它类群之间形成独立的关系。
根据陈介 (1979)对组的定义 , 腋序组 (Ⅰ )叶具微波状边缘或全缘 , 边缘腺点极不明显;萼
片在果时通常贴果基部 。圆齿组 (Ⅱ)叶缘具备圆齿或锯齿 , 齿间或齿尖具边缘腺点;萼片在果时
大多数反卷 , 不贴果;锯齿组 (Ⅲ)叶缘具锯齿或契蚀状细齿 , 无边缘腺点;萼片在果时通常不反
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卷 (陈介 , 1979)。腋序组 (Ⅰ )和锯齿组 (Ⅲ)在叶边缘腺点不明显及萼片在果时通常贴果上 , 有
相似之处 。基于 ITS序列建立的系统发育树将腋序组 (Ⅰ)和锯齿组 (Ⅲ )聚在一支 (图 3), 说明
在 3个组中这两个组有较近的关系 , 而圆齿组 (Ⅱ)稍远 。
基于 trnL-F序列所建立的系统树将 4个紫金牛 (A.japonica)样本聚类成一支 (图 3), 说明 4
个形态和产地有所不同的样品均来源于同一母系 , 而基于 ITS序列的所建立的系统树将 4个紫金牛
(A.japonica)样本聚类成 2支 (图 3), 说明紫金牛种内 ITS序列存在明显变异 , 在它们的群体中至
少存在两个核基因组类型 , 具金边的紫金牛和小叶型的紫金牛聚在一起 , 为一个类型 , 另外两个样本
为一个类型 (图 1, 图 3)。紫金牛的染色体数目为 2n=4x=92, 为四倍体 (Koyama& Kokubugata,
1998), 在 trnL-F序列和 ITS序列建立的系统树中 , 他们聚类的结果明显不同 , 这和一些杂种情况很
相似 (Liaoetal., 2008), 说明紫金牛很可能是来自同一个母系亲本 , 而父系亲本可能来源不同 , 是
个异源四倍体 (图 3)。
Kress等 (2005)曾提出 ITS和 trnH-psbA两段序列可以作为被子植物的条形码 , 但核基因本身存
在多拷贝的特性 , 在种内序列变异较大 , 降低了其作为条形码的应用性 (Kress& Erickson, 2007)。
本研究中紫金牛的 4个不同材料在 ITS序列建立的系统树中聚类为两支 , 鉴定为 2个类型 , 显现出
ITS作为条形码在鉴别多倍体杂种方面的局限性 。这种核基因组与叶绿体基因组反映出的不同系统关
系 , 充分说明了多基因作为条形码的必要性 (张金梅 等 , 2008)。
基于 ITS、 trnL-F序列所建立的系统树将 4个朱砂根 (A.crenata)样本聚类成一支 , 而在 ITS系
统树中 4个朱砂根 (A.crenata)样本中的高杆和矮杆样本进一步被分成两支 (图 1, 图 3)。在虎舌
红 (A.mamilata)两个样本中 1个为红叶 , 1个为绿叶 (图 1), 它们无论在基于 trnL-F序列所建立
的系统树 , 还是基于 ITS序列所建立的系统树中其相似度都不高 , 形态和分子水平同时都表现出明显
的分化 , 说明虎舌红 (A.mamilata)红叶的变异体有其分子变异基础。
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