全 文 ：桃属植物随机扩增多态性 DNA 技术在桃
品种分类学上的应用
曹后男1 , 　高光出2 , 　赵京秀3 , 　玄永男3 , 　朴永虎3
(1.延边大学农学院 园艺系 ,吉林 龙井 133400;2.Seoul大学园艺系 , 韩国 水原 441-744;
3.珲春市果树农场 ,吉林 珲春 133300)
摘要:以 34个桃品种为试验材料利用 23个随机引物进行桃属植物随机扩增多态性 DNA分
析结果共获得了 122条多态性 DNA 带.通过聚类分析可把 34个桃品种划分为三个品种群.
第一个品种群包括所有的油桃及 Shuang tao , Fireprince 等品种;与 Hakuto 有亲缘关系的 18个
品种归属第二个品种群;而北方系品种 Kanto5 ,Myojo , Changhow enhw angdo 及 Saotome等品
种被划分为第三个品种群.本研究利用 RAPD技术能够把 34个桃品种分成黄肉系 、白肉系及
油桃系.从本研究的结果可以看出利用 RAPD技术的分类方法比以往的任何分类方法更准
确 ,尤其对长期进行自花受粉 ,遗传多样性程度比较低的作物更能进行精确的分类.
关键词:桃;RAPD标记;PCR;分类;聚类分析
中图分类号:S662.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1004-7999(2000)01- 0001-05
0　前言
鉴别植物的遗传特性 ,进而进行分类在实际育种及遗传研究中极其重要.最简单的分
类方法是根据叶片及枝条的形态特征进行分类 ,而这种分类方法大多依据分类者的经验 ,缺
乏客观性及准确性.为了提高分类的客观性及准确性 ,多数学者采用了新的分类方法.形态
特征的多变量分析 ,同工酶分析等分类方法已在核果类的种间及品种间亲缘关系的研究中
广泛应用.但是 ,这些分类方法不仅缺乏客观性及准确性 ,而且在分类方法上也存在着很多
制约点.
RAPD分析 ,容易观察 DNA 的多态性 ,实验操作简便而快 ,哪怕是一个 DNA 片段也能
扩增出用肉眼可以观察到的 DNA 带 ,其感应度高 ,而且利用极少量的 DNA 也能达到预期
的研究结果.因此 ,已广泛应用于遗传多样性分析 、基因定位 、遗传连锁图谱构建 、种子纯度
的鉴定 、种质鉴定及起源 、演化和分类等诸多领域 ,成为当今最重要的分子生物技术之一.本
研究以建立分子水平上的桃属分类体系 ,提高分类的准确性为目的 ,利用 34个桃的主载品
种为试验材料进行了分类研究.
1　材料与方法
1.1　供试材料
第 22卷　第 1期
2000年 3月 　 　　　　　 延　边　大　学　农　学　学　报Journal of Agricultural Science Yanbian University 　　　　　Vol.22 No.1　Mar.2000
收稿日期:1999-12-06　　　基金项目:韩国农业振兴厅资助项目.
作者简介:曹后男(1962-), 女(朝鲜族),吉林省延吉市人 , 延边大学农学院园艺系果树育种教研室副教授 , 博士.
DOI :10.13478/j.cnki.jasyu.2000.01.001
本实验采用的 34个桃品种(图 1)采自韩国农村振兴厅园艺研究所的核果类品种资源
圃.6月上中旬采集完全伸展的嫩叶 ,保存于-70℃的低温冰箱中.
1.2　试验方法
1.2.1　DNA 模板制备
采用改良的 CTAB缓冲液提取法.提取的基因组 DNA 用 UV/VIS 分光光度计(UV/
V IS spectrophtometer)测定纯度 ,所用的 34个品种的DNA 纯度都在 1.80以上.测定纯度后
的基因组 DNA 用 DNA荧光计(TKO 100 ,Hoefer 公司)定量后稀释成 10 ng/uL 溶液 ,保存
于-20 ℃的冰箱中备用.
1.2.2　随机引物的筛选
利用 100个 Operon公司的 10碱基随机引物 , 以 Yuuzora和 JuneprinceDNA 作为模板 ,
在相同的条件下进行 PCR后 ,选择了品种间存在多态性 ,扩增效果良好的 23个引物.这些
引物的编号及碱基顺序如表 1所示.
表 1　用于本研究的引物编号及碱基顺序
编号 碱基顺序 编号 碱基顺序 编号 碱基顺序
A01 CAGGCCCTTC B10 CTGCTGGGAC C16 CACACTCCAG
A04 AATCGGGCTG B12 CCTTGACGCA C20 ACTTCGCCAC
A05 AGGGGTCTTG B20 GGACCCT TAC D04 TCTGGTGACC
A10 GTGATCGCAG C05 GATGACCGCC D15 CATCCGTGCT
A12 TCGGCGATAG C08 TGGACCGGTG E11 GAGTCTCAGG
A17 GACCGCTTGT C09 CTCACCGTCC E14 TGCGGCTGAG
A18 AGG TGACCGT C11 AAAGCTGCGG E16 GGTGACTGTG
B08 G TCCACACGG E14 TGCGTGCTTG
1.2.3　PCR及电泳
采用Operon公司的 10碱基引物 , Promega公司的 dNTP , BM(Boehringer Mannheim)公
司的 Taq DNA 聚合酶.基因扩增仪使用了Hybaid公司的Ominigene Thermal Cycler(Heated
Lid).基本反应体系为 50 μL 总反应体积中 , 添加 10 ng 模板 DNA , 10 pmol 引物 , dNTP
150μM , TaqDNA 聚合酶 1.5个单位 ,Mgcl21.5 m M , 10倍反应缓冲液 5μL ,不足的部分由
灭菌的三次蒸馏水来补充.PCR扩增程序为 94 ℃预变性 5 min ,然后以 94 ℃1 min , 36 ℃1
min , 72 ℃2 min为一个循环 , 扩增 50个循环 , 最后在 72 ℃下延伸 5 min.扩增产物在电泳
前存放于-20 ℃的冰箱中.
扩增产物在 1.4%的琼脂糖凝胶上电泳.电泳和凝胶用 0.5倍的 TBE 缓冲液.电泳结
束后 ,凝胶在 0.5 μL/mL 的溴化乙锭(EtBr)溶液中染色 10 ～ 20 min ,而后在水中清洗数秒
中 ,于紫外灯下观察多态性 , 并用 Polaroid 667 胶片拍照.
1.2.4　聚类分析
用 RAPD资料进行聚类分析时 ,如果多态性 RAPD带在特定的位置出现则作为`1 , 不
出现则作为`0 进行编号 ,不通过标准化程序直接应用于聚类分析.供试的 34个桃品种间
的相似度是采用Apostol等人专门为 RAPD资料设计的 simple machting similarity 的计算方
法求出相似度之后 ,换算成 Nei和 Li 的遗传距离.
树状图是利用 Felsenstein 的 PHYLIP(Ver.3.57c)prog ram , 作出 Neighbor-Joining
2 延　边　大　学　农　学　学　报 第 22卷　
Tree ,然后变换这些数据画出树状图.
　　simple machting similarity(M)=n11+n00
n
n :表现多态性的 RAPD 带总数;n11 :两个个体中都存在的 RAPD 带数;n00:两个个体
中都不存在的 RAPD 带数.
图 1　34个桃品种的亲缘关系树状图
图 2　引物 A17产生的 RAPD谱带
注:上面的数字与图 1中 34个桃品种的编号相同;M :DNA分子量标记(λ-HindⅢ+PCR标记).
3　第 1期 曹后男 ,等:桃属植物随机扩增多态性 DNA技术在桃品种分类学上的应用研究
2　结果与分析
利用 34个桃品种的基因组 DNA 和 23 个随机引物 , 在相同的条件下进行 PCR后 ,比
较各个品种的 RAPD 谱带的差异.以 A17引物进行 PCR的结果为例(图 2),在 2190bp-
880bp之间共观察到 7个多态性 RAPD 谱带.其中A17-2190bp带只在 3号和 4号两个北
方系品种中被观察到 ,很可能是这个品种群的特征标记;A17-1700bp带在供试的 34 个品
种中只在 22号和 23号两个油桃品种中没有出现 ,而供试的 34个品种中唯独这两个油桃是
果实全面着色的暗红色品种 ,据此认为这个 RAPD 带可能和果皮的红色有一定的相关.
A17-1610bp带在 14 号 、 21 号 、 25号 、 26号 、 27 号 、28 号及 33 号品种上共同出现;而
A17-1360bp带特异地只在 6号和 26号两个品种中出现.A17-1080bp带在 2号 、 19号 、
23号及 29号品种上都被观察到 , 而A17-880bp带在供试的 34个品种中只在 12号品种中
没有出现 , 很可能是这个品种的特殊标记.
采用与上相同的分析法 , 利用 23 个引物进行 RAPD 分析 , 共获得了 122 个多态性
DNA 带.根据这些资料采用如前所述的聚类方法可把 34 个桃品种划分为如图 1所示的三
个分类群.第一分类群包括所有油桃及 31号和 8号品种 , 而后者在利用形态特征进行分类
时也归属同一分类群.第二分类群包含以白肉为主的 18个品种 ,而这 18个品种又可以细分
为 5个小群.第一个小群包括 14号 、13号及 9号品种;第二个小群包括 34号和具有相同父
本的 33号及 7号品种 ,而 33号和 7号与共同父本 20号品种表现出比各自的母本 9号和 14
号更近的亲缘关系;第三个小群包括 29号 、28号及 19 号品种 ,而且表现出比较近的亲缘关
系;第四个小群包括 7个品种 ,其中 11号和 6号两个品种表现出最近的亲缘关系 ,这一结果
与实际亲缘关系相符合;第五个小群包括 27号和 21号两个品种 , 而这两个品种的实际亲
缘关系也很近.第三个分类群里主要包括以黄肉为主的 6个品种 ,其中属于北方系品种群的
3号和 4号品种在供试的 34个品种中表现出最近的亲缘关系 ,这两个品种在利用形态特征
进行分类时也属于同一个分类群 ,而且 ,也表现出非常近的亲缘关系.另外 ,具有南方系品种
群和欧洲系品种群血缘的 1号和 5号品种也属于第三个分类群.这一结果与形态特征的分
类结果有很大的差异.比较这两个品种的实际亲缘关系不难看出这种分类结果更合理 ,更
接近实际.
3　讨论
本研究采用的 simple matching similarity 的计算公式中不仅把特定的 RAPD带在比较
的个体中共同出现的情报计算在内 ,而且还要考虑共同不出现的情报 ,给两者一样的比重.
通过本研究结果认为这种计算方法对以 0和 1出现的数据资料更有利 ,能更精确地表现出
被比较个体间的相似度.
本试验利用 RAPD 分析法 , 能够把 34个桃品种分成黄肉系 、白肉系及油桃系等三个分
类群 ,而以往的诸多分类方法都没有得到这样精确的分类结果.从这一结论可以看出本研
究所采用的 RAPD技术可作为精确的分类手段应用于核果类的种质鉴定及品种分类.另
外 , 本研究利用的是 10碱基的引物 , 为获得更多的多态性 RAPD标记 , 认为有必要使用更
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长一些的引物 ,如 15碱基引物等.此外 , 要想获得与特殊性状相关的 RAPD 标记 , 就要利
用更多的引物进行 PCR ,有可能获得所需的标记.
参考文献:
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Taxonomy of Peach[ prunus persica (L .)Batsch] cultivars based on
RAPD analysis
CAO Hou-nan1 ,GAO Guang-chu2 ,ZHAO Jing-xiu3 ,XUAN Yong-nan3 , PIAO Yong-hu3
(1.Department of Horticulture , Agricul tural Col lege of Yanbian University , Ji lin Longjing 133400 ,
China;2.Seoul National University , Suwon 441-744 , Korea;
3.Hunchun Fruit Farm , J ilin Hunchun 133300 , China )
Abstract:Random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis w as applied to 34 prunus per-
sica cultivars by using 23 random primers and produced 122 reproducible and polymorpic bands.
From the cluster analysis , 34peach cultivars were divided into three groups.The first group in-
cluded all of the nectarines , `Shuangtao and `Fireprince .The second group included eighteen
cultivars that could be explained as relatives of `Hakuto , and the third group included North-
ern China group , `Kanto 5 ,`Myojo ,`Changhoweonhwangdo , and `Saotome .It is possible
to divided the 34 peach cultivars into the white flesh group , the yellow flesh group and the nec-
tarine group based on RAPD analysis.
Key words:prunus persica;RAPD marker;PCR;taxonomy;cluster analysis
5　第 1期 曹后男 ,等:桃属植物随机扩增多态性 DNA技术在桃品种分类学上的应用研究