全 文 ：利用分子标记对桃属植物种的识别
及其亲缘关系分析＊
程中平1), 2)　陈志伟1)　胡春根3)　邓秀新3)　罗正荣3)
(1)武汉市林业果树研究所 , 武汉 430075;2)中国科学院武汉植物研究所 ,武汉 430074;
3)华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 武汉 430070)
摘要　采用 RAPD技术 , 用筛选的 22个随机引物对桃属主要种类及其类型进行 DNA 扩增分析。结果表明:
不同引物扩增出的 DNA 片段范围在 3～ 13条 , 分子量范围在 300 bp～ 3 kb 之间 ,依据特征谱带 , 可建立种间及其
类型识别的分子检索表。利用 22个引物扩出的 180个位点上的 RAPD带 , 进行聚类分析 , 结合前人研究出的结
果 ,揭示桃种间亲缘演化顺序为:内蒙古长柄扁桃※光核桃※山桃※甘肃桃※白花山桃 、红花山桃 、帚形山桃※
桃巴旦 、陕西桃巴旦※新疆桃 、毛桃。
关键词　桃;种类;RAPD;识别及系统发育
中图法分类号　S 662.102
　　桃原产于我国 ,具有丰富种质资源。在桃的资
源分类方面 ,从形态学[ 1 ～ 3] 、细胞学[ 4] 、孢粉学[ 5～ 7] 、
酶学[ 8] ,提出了桃属植物种间的亲缘关系见解。但
形态学研究过于宏观 ,所能提供的信息有限;细胞学
如染色体核型分析及孢粉学如花粉形态的观察 ,虽
它们在演化过程中 ,具有一定的保守性 ,在鉴别种质
及探讨其演化方面起到了很好的作用 ,同样存在提
供信息量的问题;酶学 ,虽能给出一些多态位点 ,但
它是基因表达的产物 ———蛋白质 ,且易受环境 、气
候 、不同器官的影响。近年来发展起来的分子生物
学技术 ,从遗传物质 DNA 本身揭示物种间的多样
性。张俊卫等[ 9]应用 RAPD进行梅 、桃 、李 、杏 、樱的
分析 ,Lu Zhenxiang 等[ 10]利用RAPD对桃砧木标记识
别 ,Marilyn L ,Warburton 等[ 11]对以美国栽培的主要
桃品种及普通扁桃的遗传多样性 RAPD分析。综观
这方面的研究报道不多 ,涵盖桃属的种类少 ,均缺乏
桃属中一种较重要的内蒙古长柄扁桃材料参试 ,对
光核桃的研究 ,只有宗学普[ 7]用花粉蛋白 SDS 电泳
作过分析 ,而其它的研究均未涉及该种 ,汪祖华[ 6]在
对桃种质亲缘关系演化研究—花粉形态分析一文中
提到“考虑到光核桃在起源中的地位特殊 ,可惜未采
到光核桃花粉 ,对其在演化过程中所处的地位还有
待进一步研究” 。在分子生物学方面 ,对桃属中种的
研究仅含普通桃和普通扁桃两个种 ,涉及的种类更
少 ,本研究选取桃中几乎全部的种作试材 ,采用分子
生物学方法中的 RAPD技术对它们进行识别及其亲
缘关系探讨 ,为种间分类研究提供分子生物学依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料如表 1。
1.2　方法
1)DNA提取 。取采集的各桃种质幼嫩叶 1 ～ 2
片 ,依照史永忠等[ 12]提取 DNA的方法提取 DNA。
2)PCR扩增及电泳检测。应用筛选的 22 个引
物(表 2),进行 PCR扩增 。扩增条件采用经优化的
反应体系 ,PCR反应的总体积25μl ,其中含10×PCR
缓冲液 2.5 μl ,MgCl2(25 mmol/ L)2.0 μl , dNTP(2
mmol/L)2.5 μl , Tag 酶(5 U/μl)0.24 μl ,引物(16.5
ng/μl)2.0μl ,模板 DNA(10 ng/μl)5.0 μl。引物购自
上海生工生物工程公司 ,PCR缓冲液 、Tag 酶 、MgCl2 、
dNTP 均购自 Shanghai promega 公司 。反应液混均
后 ,在其上加一薄层矿物油。PCR 扩增仪为 DNA
Thermal Cycler 480(the Perkin-Elmer Corporation ,
USA),PCR反应条件同史永忠等[ 12]采用的参数 。扩
收稿日期:2000-08-24
＊武汉市晨光计划和华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室资助项目的一部分内容
程中平 ,男 , 1963年生,高级农艺师.现在工作单位:中国科学院武汉植物研究所 ,武汉 430074
第 20 卷 第 3期
2001 年　6 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of Huazhong Agricultural University
Vol.20　No.3
June.2001 , 199 ～ 204
DOI :10.13300/j.cnki.hnlkxb.2001.03.001
表 1　供试材料
Table 1　Experimental materials
编号 No. 名称 Name　 学名 Scientific name 采集地 Place of collection
G1 甘肃桃 Amygdalus kansuensis Skeels 江苏省园艺所 Horticultural Institute of Jiangsu Province
G2 光核桃 A.mira(koenne)Yu et Lu 郑州果树所 Zhengzhou Fruit Research Institute
G3 红花山桃 A.davidiana(carr.)Yu 郑州果树所 Zhengzhou Fruit Research Institute
G4 白花山桃 A.davidiana(carr.)Yu 郑州果树所 Zhengzhou Fruit Research Institute
G5 帚形山桃 A.davidiana(carr.)Yu 郑州果树所 Zhengzhou Fruit Research Institute
G6 山桃 A.davidiana(carr.)Yu 江苏省园艺所 Horticultural Institute of Jiangsu Province
G7 白花山碧桃 A.davidiana(carr.)Yu×A.persica L. 江苏省园艺所 Horticultural Institute of Jiangsu Province
G8 陕西桃巴旦 A.communis L. 江苏省园艺所 Horticultural Institute of Jiangsu Province
G9 桃巴旦 A.communis L. 江苏省园艺所 Horticultural Institute of Jiangsu Province
G10 内蒙古长柄扁桃 A.pedunculata Pall 江苏省园艺所 Horticultural Institute of Jiangsu Province
G11 喀什 1号 A.ferganensis(Kost.et Riab.)Yu et Lu 郑州果树所 Zhengzhou Fruit Research Institute
G12 喀什 2号 A.ferganensis(Kost.et Riab.)Yu et Lu 郑州果树所 Zhengzhou Fruit Research Institute
G13 喀什 3号 A.ferganensis(Kost.et Riab.)Yu et Lu 郑州果树所 Zhengzhou Fruit Research Institute
G14 喀什 4号 A.ferganensis(Kost.et Riab.)Yu et Lu 郑州果树所 Zhengzhou Fruit Research Institute
G15 新疆大甜仁 A.ferganensis(Kost.et Riab.)Yu et Lu 北京市林果所 Bei jing Forestry and Fruit Research Institute
G16 毛桃 A.persica L 江苏省园艺所 Horticultural Institute of Jiangsu Province
G17 甘肃桃 A.kansuensis Skeels 北京市林果所 Bei jing Forestry and Fruit Research Institute
增完毕 ,在 1.4%琼脂糖凝胶上(西班牙产 ,加含 EB
0.5 μg/ml)电泳 , 以华美产 Lambda DNA/EcoRI +
Hind Ⅲ和 MBI 产 Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder
Plus作Marker ,在紫外透射仪上观察 ,照相 。
3)数据记录与统计 。用 Lambda DNA/EcoRI +
Hind Ⅲ和 Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus 作
Marker ,确定扩增产物在凝胶上的位置 ,将 PCR扩增
中出现的清晰的带记为 1 ,不出现的记为 0 ,录入计
算机 Excel表格中 ,以NTS YS-pc 1.8数据软件进行
分析 ,相似系数采用 Dice 系数 ,最后用 UPGMA方法
聚类 。
2　结果与分析
2.1　桃属植物种的 RAPD标记多态性
表 2　RAPD分析中所用的引物
Table 2　Primers with arbitrary sequence in the RAPD analysis
编号
No.
引物碱基顺序
Sequence of primer
编号
No.
引物碱基顺序
Sequence of primer
S17 AGGGAACGAG S125 CCGAATTCCC
S18 CCACAGCAGT S167 CAGCGACAAG
S21 CAGGCCCTTC S319 TGGCAAGGCA
S24 AATCGGGCTG S341 CCCGGCATAA
S29 GGGTAACGCC S360 AAGCGGCCTC
S43 GTCGCCGTCA S441 GGCACGTAAG
S51 AGCGCCATTG S444 AAGTCCGCTC
S60 ACCCGGTCAC S452 CAGTGCTGTG
S65 GATGACCGCC S459 GGTGCACGTT
S68 TGGACCGGTG S464 GTGTCTCAGG
S118 GAATCGGCCA BA2134 AACACACGAG
用筛选的 22个引物(表 2)对山桃 、甘肃桃 、扁
桃 、光核桃 、白花山碧桃 、新疆桃 、毛桃等种的 17 个
样品 DNA进行扩增 ,各引物在种间均表现出不同程
度的多态性 ,统计 22个引物的 180个标记上清晰易
辨的扩增带 。不同引物扩增出 DNA片断从 3 条到
13条 ,分子量范围在 300 bp ～ 3 kb之间 。
图 1　S444引物扩增的谱带
Fig.1　Amplified bands of primer S444
1.M:Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus;2.G8;3.G9;4.G6;5.
G16;6.G10;7.G1;8.G17;9.G2;10.G15
G8, G9 , G6 ,G16 , G10 , G1 ,G17 , G2 ,G15代表种类名称见表 1 , are all
the same as in table 1
从S444引物对各种类 DNA扩增(图 1),可以利
用DNA指纹将它们区别开来 ,得到分子标记种类检
索表 。
200　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 20 卷　
1 、有 S444-680 bp带
　2 、有 S444-2800 bp带 内蒙古长柄扁桃………………………
　2 、无 S444-2800 bp带 桃巴旦和陕西桃巴旦…………………
1 、无 S444-680 bp带
　　3 、有 S444-700 bp带
　　　4 、有 S444-1200 bp带 甘肃桃(江苏省园艺所………… )
　　　4 、无 S444-1200 bp带
　　　　5 、有 S444-2800 bp强带 新疆大甜仁…………………
　　　　5 、有 S444-2800 bp弱带 毛桃…………………………
　　3 、无 S444-700 bp带
　　　　　6 、有 S444-1200 bp带 光核桃………………………
　　　　　6 、无 S444-1200 bp带
　　　　　　7 、有 S444-1300 bp带 山桃………………………
　　　　　　7、无 S444-1300bp带……甘肃桃(北京市林果所)
从S17引物对各样品 DNA扩增得到的指纹图
谱(图 2),建立的分子标记检索表如下:
1 、无 S17-850 bp带
　2 、无 S17-900 bp带 、S17-600 bp带
　　3 、有 S17-580 bp 带 、S17-1000 bp 带 、S17-1900 bp带 ,而
无 S17-700 bp带 内蒙古长柄扁桃……………………………………
　　3 、无 S17-580 bp 带 、S17-1000 bp 带 、S17-1900 bp带 ,而
有 S17-700 bp带 山桃 、光核桃………………………………………
　2 、有 S17-900 bp带 , S17-600 bp带
　　　4 、无 S17-650 bp带 ,有 S17-2500 bp带
甘肃桃(江苏省园艺所)
………………
…………………………………………
　　　4 、有 S17-650 bp带 ,无 S17-2500 bp带
甘肃桃(北京市林果所)
………………
…………………………………………
1 、有 S17-850 bp带
　　　　5 、无 S17-930 bp带
　　　　　6 、无 S17-1300 bp带
　　　　　　7 、无 S17-1350 bp带和 S17-1150 bp带
新疆大甜仁
………
………………………………………………………
　　　　　　7 、有 S17-1350 bp带和 S17-1150 bp带
　　　　　　　8 、有 S17-1100 bp带
　　　　　　　　9 、有 S17-580 bp带 白花山桃………………
　　　　　　　　9 、无 S17-580 bp带 红花山桃………………
　　　　　　　8 、无 S17-1100 bp带 帚形山桃………………
　　　　　6 、有 S17-1300 bp带 桃巴旦 ,陕西桃巴旦…………
　　　　5 、有 S17-930 bp带
　　　　　　　　　10 、有 S17-1000 bp带 毛桃………………
　　　　　　　　　10 、无 S17-1000 bp带
　　　　　　　　　　11 、无 S17-2500 bp带 喀什 3号………
　　　　　　　　　　11 、有 S17-2500 bp带
喀什 1号 、喀什 2号 、喀什 4号
…………………
……………………………………
图 2　S17引物扩增的谱带
Fig.2　Amplified bands of primer S17
1.M:Lambda DNA/ EcoRI+Hind Ⅲ;2.G8;3.G9;4.G16;5.G10;6.G1;7.G17;8.G2;9.G15;10.G13;11.G12;12.G14;13.G11;14.G6;15.G3;16.
G4;17.G5
G8, G9 ,G16 , G10, G1 , G17 , G2 ,G15 , G13 , G12, G14 ,G11 ,G6, G3 , G4 ,G5代表种名称见表 1 , all the same as in tabe 1
　　经22个引物 ,对各样品 DNA扩增 ,得到的指纹
分析 ,种与种之间 ,可以得到不同程度的多态性。经
过S444一个引物可以区分各种(图 1),S17 引物除
对山桃和光核桃外 ,其余各种类也易区别(图 2),同
样经过 S341 引物也可将桃属中各种区别开来(图
3)。白花山碧桃杂种在 S24 引物扩增下 ,与山桃的
带相似 ,但在 S24-1250 bp 处缺少一条带 ,此带也是
与其他种相区别的带(图 4)。以上引物对种内的各
个类型有的容易区分 ,如在北京市林果所采集的甘
肃桃和江苏园艺所采集的甘肃桃 ,新疆大甜仁与喀
什各号可区别开来 ,喀什 3号又可与喀什其他各号
区别。喀什 1 、2 、4号经 S17引物难以区别 ,但别的
引物可将其区分开来 。如 S341 扩出的带中喀什 1
号在 S341-850 bp 处较喀什 2号 、喀什 4号少一条
带;S459扩出的带中 ,喀什 4号在 S459-930 bp 处较
喀什 2号少一条带。通过以上引物可再将喀什 1 ～
201　第 3期 程中平等:利用分子标记对桃属植物种的识别及其亲缘关系分析 　
4号区别开来。唯独巴旦中的桃巴旦 、陕西桃巴旦
在22个引物扩增的 DNA指纹中 ,很难发现区别带 ,
但S18引物扩出的带中桃巴旦在 S18-1600 bp 处较
陕西桃巴旦多出一条带。
图 4　S24引物扩增的谱带
Fig.4　Amplified bands of primer S24
1.M:Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus;9.G18:鸳鸯垂枝;
10.G19:红重瓣寿星桃;11.G20:红花碧桃 G18 ,G19 , G20 repre-
sent types of A.persica L.;2.G9;3.G6;4.G16;5.G10;6.G1;7.G2;
8.G15;12.G7
G9,G6, G16 , G10 , G1 , G2, G12 , G15 , G7 代表种类名称见表 1 , all
the same as in tabe 1
图 3　S341引物扩增的谱带
Fig.3　Amplified bands of primer S341
1.M:Lambda DNA/ EcoRI +Hind Ⅲ;2.G8;3.G9;4.G16;5.G1;
6.G2;7.G15;8.G13;9.G12;10.G14;11.G11;12.G3;13.G4;14.G5
G8, G9 , G16 , G1 , G2 , G15 , G13 , G12 , G14 G11 , G3 , G4 , G5 代
表种类名称见表 1 , all the same as in table 1
图 5　桃属主要种类及类型的聚类分析图
Fig.5　Cluster analysis of major species and their types of Amygdalus plants
G1 , G2, G3 , G4 , G5 , G6, G7 , G8 , G9 , G10 , G11 , G12 , G13, G14 , G15 , G16代表种类名称见表 1;
G1 , G2, G3 , G4 , G5 , G6, G7 , G8 , G9 , G10 , G11 , G12 , G13, G14 , G15 , G16 all the same as in table 1
　　从上面分析可知 ,用单个引物的 RAPD带 ,分析
各种及其类型的特征带 ,可以比较容易地建立一个分
子检索表 ,用以区分种及其类型 ,对于过去传统采用
的植物学形态识别方法来说 ,又拓展了一个更快捷
的 、全新的分子生物学识别方法 ,从而也说明了种间
及其类型的差异反映基因组系列的多态性 ,即在 DNA
系列上存在差异 ,因分子生物方法从遗传物质本身揭
示事物的内在规律 ,它更具有客观性和科学性。
2.2　桃种间及其类型的聚类分析
通过所记录的 180个位点清晰带进行聚类分析
202　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 20 卷　
(除北京市林果所采集的甘肃桃少数位点带不清晰
未参与聚类外),得到如图 5的聚类图 。以 0.87 处
作为结合线 ,可将它们分成内蒙古长柄扁桃;光核
桃;山桃;甘肃桃;白花山桃 、红花山桃 、帚形山桃;白
花山碧桃;陕西桃巴旦 、桃巴旦;毛桃 、新疆大甜仁 、
喀什 1号 、喀什 2号 、喀什 3号 、喀什 4 号等 8组 。,
由此可见 ,可以区分桃属主要种 ,它们亲缘关系的顺
序如划分各组 ,其中内蒙古长柄扁桃的亲缘关系较
远 ,按上面各组顺序演化到毛桃 ,杂种白花山碧桃紧
靠白花山桃 、红花山桃 、帚形山桃组 ,从而进一步证
实其亲缘演化关系。
3　讨　论
经过 RAPD 分析可以用 DNA 指纹区别桃属各
种及其类型 ,比起前人从细胞学 、孢粉学 、酶学的手
段区分桃属种及其各类型更有效。且可以从这些特
殊带 ,建立分子系统识别检索表。
关于桃属中亲缘关系的演化 ,本试验得到的聚
类图可以看到内蒙古长柄扁桃在聚类图外围 ,这无
论是从其起源 ,还是从其形态特征如叶倒卵形 、有不
整齐锐锯齿 、绒毛多 ,都证明其亲缘关系较远。Pall
将其与普通扁桃区别 ,单列为一种证明是恰当的 。
光核桃在供试的桃属种聚类位置仅次于内蒙古长柄
扁桃 ,从形态上讲 ,光核桃的核上无纹 ,与桃属中进
化的几乎全部桃的核都有纹相比 ,则更原始相吻合 。
山毛桃和甘肃桃的演化地位上看 ,因山毛桃种中的
类型而有别 , 但都分布在甘肃桃的左右 。郭振怀
等[ 4]对甘肃桃和山桃的染色体分析表明 ,甘肃桃和
山桃亲缘关系相近 ,从染色体臂比分析和汪祖华[ 6]
等从花粉形态的电子显微镜观察 ,都认为甘肃桃的
原始性强 ,但他们的参试材料山桃只有一个 ,也就无
法进行多重比较 。宗学普等[ 7] 利用花粉蛋白 SDS
电泳谱带聚类分析 ,有两个类型甘肃桃和两个类型
山桃划在同一级 ,另一个类型山桃较甘肃桃进化 ,笔
者聚类得到的山毛桃中的类型分布在甘肃桃左右与
其相吻合。陕西桃巴旦和桃巴旦均属普通扁桃 ,按
其起源来讲应聚在内蒙古扁桃之后 ,虽它们还有共
同的特征带如 S444-680 bp ,但经聚类却在白花山碧
桃组和毛桃组之间 ,与宗学普等[ 7]的 SDS 电泳带聚
类将普通扁桃同新疆桃 、普通桃 、红花山桃划为同
级 ,得出与美国Westwood(1979)的研究一致的结论 ,
即普通扁桃与桃演化地位处于平行的观点相符合 。
毛桃和新疆桃聚在一组 ,与郭振怀等[ 4] 、高锁柱等[ 5]
分别对染色体和花粉形态观察分析认为新疆桃和普
通桃相似的结果一致 。从 RAPD指纹可以区分种间
及种的各类型来看 ,比染色体 、花粉形态分析更深
入直观 ,应该说 RAPD指纹更有说服力。
致谢　承蒙中国农业科学院郑州果树研究所朱更瑞
先生 、江苏省园艺研究所郭洪先生 、北京市林业果树
研究所姜全先生及其他同志提供试材 、资料和帮助 ,
在此一并致谢 !
参　考　文　献
1　中国农科院果树研究所.中国果树栽培学.北京:农业出版社 ,
1960
2　俞德俊.中国果树分类学.北京:农业出版社 , 1979
3　吴耕民.中国温带果树分类学.北京:农业出版社 , 1984
4　郭振怀 ,葛会波 ,王秀伶等.桃属植物染色体核型及种间系缘关系
分析.园艺学报, 1996 , 23(3):223～ 226
5　高锁柱 ,马德伟 ,张新文等.桃属植物花粉形态的观察研究.中国
果树 ,(4):13～ 16
6　汪祖华 ,周建涛.桃种质的亲缘演化关系研究—花粉形态分析.园
艺学报 ,1990 , 17(3):161～ 168
7　宗学普 ,俞　宏 ,王志强.桃属植物种间亲缘关系及演化研究———
花粉蛋白 SDS电泳分析.园艺学报 , 1995 ,22(3):288～ 290
8　Bruce D Mowrey , Dennis J Werner , David H Byrne.Isozyme survey of
various species of Prunus in the subgenus Amygdalus.Scientia Horticul-
turae , 1990 , 44:251～ 260
9　张俊卫 ,包满珠 ,陈龙清.梅 、桃 、李 、杏 、樱的 RAPD 分析.北京林
业大学学报 ,1998 , 20(2):13～ 15
10　Lu Zhenxiang , Reighard G L , Baird W V.Identification of peach root-
stock cultivars by RAPD markers.Hortscience , 1996 , 31(1):127～ 129
11　Marilgn L , Warburton , Fredrick A Bliss.Genetic diversity in peach
(Prunus Persica L.Batch)revealed by randomly Amplif ied Polymorphic
DNA(RAPD)markers and compared to inbreeding coeffi cients.J Amer
Soc Hort , 1996 , 121(6):1012～ 1019
12　史永忠 ,郭文武 ,邓秀新.柑桔 RAPD 技术体系建立与体细胞杂
种鉴定.园艺学报 , 1998 , 25(2):105～ 110
203　第 3期 程中平等:利用分子标记对桃属植物种的识别及其亲缘关系分析 　
The Identification and Systematic Relationship Analysis of
Amygdalus spp.by Molecular Markers
Cheng Zhongping1),2)　Chen Zhiwei1)　Hu Chungen3)　Deng Xiuxin3)　Luo Zhengrong3)
(1)Wuhan Forestry and Fruit Research Institute ,Wuhan 430075 , China;
2)Wuhan Institute of Botany , CAS , Wuhan 430074 , China;
3)Huazhong Agricultural University ,Wuhan 430070 , China)
Abstract　Total DNAs of major species and types in Amygdalus L.were amplified with selected 22 arbitrary
primers by using RAPD.The results showed that the number of DNA fragments amplified by different primers varied
from 3 to 13 ,molecular sizes from 300 bp to 3 kb.The tested accessions could be identified by the amplified bands.
According to special bands , a chart capable of distinguishing the species and types was figured out.The cluster and
analysis of RAPD bands in 180 loci of 22 arbritrary primers , involving the relative research results , revealed the sys-
tematic evolution of the experimented species as follow:Neimenggu changbinbiantao(A.pedunculata)※Guanghetao
(A.mira)※Shantao(A.davidiana)※Gansutao(A.kansuensis)※Baihuashantao ,Honghuashantao , Zouxingshantao
(A.davidiana)※Taobadan ,Shanxi taobadan(A.communis)※Xinjiangtao(A.ferganensis),Maotao(A.persica).
Key words　peach , species , RAPD , identification and systematic evalution
(责任编辑:张志钰)
204　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 20 卷