全 文 ：第 23 卷 第 5期
2001 年 9 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.23 , No.5
Sep., 2001
2000-10-11收稿
http: www.chinainfo.gov.cn periodical bjlydxxb
＊北京市科委科技合同项目“樱桃果树病毒脱毒及病毒检测技术研究”
李属植物脱毒技术及病毒检测研究进展＊
陈君帜 李 青
(北京林业大学园林学院 , 100083 ,北京;第一作者女 , 26岁 ,硕士)
摘要 该文对李属植物主要病毒病 、脱毒技术及病毒检测进行了系统的论述.李属植物大多为园艺植物 , 由于病毒
危害 , 严重降低其经济价值.各国对病毒病的研究和防治极为重视 , 目前主要采用脱毒技术以获得脱毒苗.常用脱
毒技术包括茎尖培养 、茎尖微嫁接 、热处理和化学处理.经脱毒处理的苗木必须经过严格的病毒检测 , 确定脱毒 ,才
能推广应用.常用病毒检测方法有指示植物法 、酶联免疫法和分子生物学技术.
关键词 李属 ,脱毒 , 病毒检测
中图分类号 S685.12
Chen Junzhi;Li Qing.Advances of research on eradication and detection of viruses in Prunus spe-
cies.Journal of Beijing Forestry University(2001)23(5)71 ～ 74[ Ch , 41 ref.] College of Landscape Architec-
ture , Beijing For.Univ., 100083 , P.R.China.
The main viruses in Prunus species , the techniques of virus-free and detection of virus in Prunus species
are discussed in the paper.Infected by viruses , the value of Prunus species being horticultural plants was
greatly decreased.Lots of efforts were given to research on and fight against the viruses.The plants of virus-
free would be obtained by eradicating viruses.Shoot-tip culture in vitro , shoot-tip micrografting in vitro , ther-
motheraphy , and chemotherapy were among common eradicating methods.Before application , the plants
should be pretreated to ensure being virus-free.Indicator plants , ELISA , and molecular techniques were ap-
plied in detecting viruses.
Key words Prunus , virus-free , virus detection
李属植物种类丰富 ,大多为重要的园艺植物 ,果
实可食用 、加工 ,花 、叶 、枝等可观赏 ,在果品生产 、园
林绿化等方面占据重要地位.近年来由于病毒病的
危害 ,严重影响其果实产量 、品质 ,花 、叶 、枝等的观
赏价值.各国学者正致力于病毒病的研究和防治 ,已
在利用脱毒技术获得脱毒苗方面取得了成功的经
验.检测病毒的技术也发展很快.通过分子生物学技
术可以快速检测 fg(10-15)级水平的病毒.
1 李属植物主要病毒病
目前已发现的李属病毒病共计 161种 ,其中樱
亚属 68 种 ,桃亚属 41种 ,李亚属 32种 ,杏亚属 20
种[ 1] .桃亚属的主要侵染病毒有伪桃病 、桃黄化病 、
桃丛簇病 、桃痘病 、桃潜隐花叶病 、桃褪绿叶斑病 、李
矮缩病等[ 1 ～ 4] .李亚属主要侵染病毒有李矮缩病 、李
痘病 、李坏死环斑病 、李线纹斑病 、桃黄化病等[ 1 ～ 5] .
杏亚属主要侵染病毒有坏死环斑病 、苹果褪绿叶斑
病 、桃丛簇病 、李痘病等[ 1～ 2] .樱亚属主要侵染病毒
有坏死环斑病 、苹果褪绿叶斑病 、樱桃黄化病 、美国
糙叶病 、李矮缩病 、李痉痘病 、X-病 、绿色斑驳病 、
李痘病 、樱桃卷叶病等[ 1 ～ 6] .
在 161种病毒中 ,苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、
李坏死环斑病毒(PNRSV)、李矮缩病毒(PDV)寄主
范围广 ,为害严重 ,国际上已将以上 3种病毒作为脱
毒研究的主要对象[ 7] .
2 脱毒技术研究
由于病毒对植物危害日益严重 ,世界各国对病
毒危害的研究和防治都极为重视 ,并取得了成功的
经验.获得脱毒苗的基本方法有 4种:茎尖培养 、茎
DOI :10.13332/j.1000-1522.2001.05.017
尖微嫁接 、热处理 、化学处理.
2.1 茎尖培养
White(1934)和 Limasset等(1949)研究表明 ,病
毒浓度呈梯度变化 ,病毒粒子随植物组织的成熟而
增加 ,旺盛生长的根尖 、茎尖很少有病毒分布[ 8 ～ 12] .
Morel等(1952)首次通过茎尖培养成功获得脱毒的
大丽花.以后茎尖培养相继用于桃 、樱桃 、樱花 、豆
樱 、山樱花等植物脱毒.茎尖的成活率和脱毒率是茎
尖脱毒培养的两个关键环节.
褐化是降低茎尖培养成活率的首要原因.茎尖
大小 、取材季节 、培养方式 、激素浓度 、基本培养基 、
培养基添加物都对茎尖褐化有影响.茎尖越小 ,褐化
越严重[ 5, 13 ～ 15] .同等大小茎尖休眠季节取材 、液体培
养 、添加低浓度激素成活率高于休眠前期或生长期
取材 、固体培养 、添加高浓度激素[ 14 ～ 16] .桃 、樱桃 、杏
的茎尖在 F14 ,MS , LG培养基上培养 ,结果 3个树种
在F14培养基上成活率均高于MS ,LG[ 14] .应用抗氧
化剂 AC 和 Vc 对茎尖培养的褐化现象可有效抑
制[ 17 ～ 18] .
茎尖大小 、细胞分裂素浓度 、继代次数影响脱毒
率.不同植物种类和病毒无毒茎尖长度不相
同[ 19 ～ 20] .高浓度细胞分裂素结合多次继代可提高脱
毒率[ 21] .在草莓上应用二次茎尖脱毒可有效提高脱
毒率 ,该方法可尝试用于李属植物脱毒.
2.2 茎尖微嫁接
在茎尖培养的基础上 ,Marashige 等提出微体嫁
接技术 ,即将茎尖分生组织嫁接在试管中经脱毒培
养的砧木上得到完整植株[ 13 ～ 16] .微体嫁接解决了某
些木本植物茎尖培养发根困难 、生长缓慢的问题 ,并
且可使复合侵染的病毒分离.至今李属桃 、杏 、樱桃 、
李用该技术都获得了脱毒苗[ 19 ,22 ～ 24] .一般认为大多
数植物种子不带病毒 ,可直接采用试管播种苗作为
微体嫁接的砧木 ,但有的病毒通过种子和花粉传染 ,
砧木必须进行脱毒处理.茎尖大小 、病毒种类和接穗
来源影响微嫁接成活率和脱毒率.茎尖越大嫁接成
活率越高 ,但脱毒率越低.茎尖大小对微嫁接成活率
和脱毒率的影响同于茎尖培养.桃采用<0.4mm的
茎尖嫁接不成活 , 0.4 ～ 1.0 mm 时 ,随茎尖长度增
加 ,成活率增加 ,但脱毒率降低[ 24] .桃的ACLSV易用
微体嫁接脱毒 ,而 PNRSV ,PDV 不易脱除[ 22 ～ 23] .接穗
经一定时间高温处理后再进行微嫁接 ,脱毒率明显
提高[ 22] .
2.3 热处理
热处理是应用最早的脱毒技术 ,该技术操作简
单 、见效快.热处理的理论依据是在高温下病毒钝
化 ,复制明显减弱或不再繁殖 ,而植物在高温下生长
较快 ,将植物在高温下培养数周至数月 ,这个期间生
长的嫩梢不带病毒[ 14 , 25] .热处理的关键问题是存活
率和脱毒率.
温度和持续时间 、热处理方式等对存活率和脱
毒率有影响.李属植物病毒一般在 38 ℃左右可被钝
化 ,通常采用 38 ℃作为处理温度.但李属植物耐热
性差 ,38 ℃恒温处理死亡率高.采取一些改进措施
可有效提高存活率 ,同时不影响脱毒率.这些措施包
括昼夜变温(38 ℃, 16 h , 光照 25 ～ 30 ℃, 8 h , 黑
暗)[ 14 , 16 , 26] ;预先处理[ 9] ;降低土温(29 ℃),处理期间
浇水[ 3] ;高 CO2 ,降低根部温度[ 8 ～ 9] .一般认为高温
(38 ℃)长时间处理 ,脱毒率高 ,但有的病毒是让寄
主植物在低温下生长一段时间来消除的[ 25] ,对于这
些病毒侵染的植物变温处理存活率和脱毒率均高于
恒温处理[ 14 , 16 , 25 ～ 27] .低温处理结合微嫁接或茎尖培
养[ 26 ,28 , 29] ,高浓度细胞分裂素 、多次继代结合低温处
理[ 14 ,16 , 26 ～ 28] 也是有效的脱毒途径.
2.4 化学处理
国内外对抑制植物病毒的活性物质的研究近几
十年来发展较快.该类物质包括代谢拮抗物质 、高等
植物生长调节物质等.种类繁多 ,作用机理各不相
同.目前国际上常用的是两种植物生长调节物质:2 ,
4-二氧六氢三氮杂苯(DHT)和类似嘌呤碱基代谢
物质病毒唑(ribavirin , virazdes)[ 12 ,25 , 28 , 30] .作用机理为
这两种物质可抑制病毒复制[ 12 , 25 , 28] .Deogrativos等报
道培养基中添加病毒唑 , 甜樱桃可脱除 ACLSV ,
PNRSV ,PDV[ 28] .对苹果田间植株直接喷施该类物质
也可获得脱毒苗.
3 病毒检测技术研究
采用各种办法获得的脱毒苗 ,必须经过严格的
病毒检测确定脱毒才能推广应用.危害李属的几种
主要病毒在侵染寄主后 ,经过各种脱毒处理 ,表现症
状极轻微 ,或不表现任何症状 ,必须借助于其他手段
来鉴定[ 7 , 14 , 16 , 31] .目前常用的检测技术包括指示植物
法 、酶联免疫法 、分子生物学技术.电镜技术应用较
少.
3.1 指示植物法
李属植物病毒检测的基本手段是指示植物法.
该属植物的一部分病毒可以采用汁液接种法 ,接种
到草本植物上 ,从而进一步研究其生物属性特征并
进行种类鉴定(核果病毒病害.中国农科院果树研
究所 ,烟台无病毒果树实验场 ,1991).叶烟 、昆诺藜 、
烟草可作为李属植物病毒指示植物[ 9 , 32] .但大多数
李属病毒 ,只能用嫁接方法 ,借助于木本指示植物所
表现的症状特点来鉴定病毒种类[ 16 , 33] .目前国际上
72 北 京 林 业 大 学 学 报 第 23卷
通用的标准李属指示植物是`GF305 、` 阿尔巴特 、
山樱桃[ 14 , 16 , 23] .这几种植物对目前已知的 30 余种
桃 、38种樱桃 、14种杏 、16种李的病毒均能给以指
示.指示植物法比较简单 ,但其检测速度很慢 ,有的
1 ～ 2周表现症状 ,有的需 1 ～ 3 a ,并且受季节限制 ,
维护指示植物园费用高 ,灵敏度也较低[ 14 ,34] .
3.2 酶联免疫法
目前应用最广泛的检测方法是酶联免疫吸附法
(ELISA).植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋
白 ,是一种很好的抗原 ,给动物注射后会产生抗体.
由于不同病毒产生的抗血清都有各自的特性 ,因此
可以用已知病毒的抗血清鉴定病毒种类.ELISA的
灵敏度较高 , 可检测 ng 水平的病毒.最早应用的
ELISA为直接双抗体夹心法(DAS-ELISA),应用该技
术 已 检 测 出 桃 丛 簇 花 叶 病 毒[ 11] ,
ACLSV
[ 14 , 20 , 22, 23 , 28 , 30 , 35] , PNRSV[ 14 , 20, 22 , 27 , 35 , 36] ,
PDV
[ 7 ,11 , 20 , 36 ～ 38] .当待测样品为组培苗 ,提取样品的
OD值 490均极低 ,接近阴性对照值 ,难以准确测出
甜樱桃组培苗的 PNRSV ,PDV ,ACLSV[ 21] ,需对 DAS
-ELISA进行改良.A 蛋白夹心 -ELISA 法(PAS-
ELISA)[ 8, 33 ,39 , 40]和间接双抗体夹心法[ 12 , 40] ,可能由于
避免了病毒在包被过程中受植物汁液中钝化物质的
作用的影响 ,其准确率比 DAS-ELISA高.酶联免疫
吸附法有一定的局限:有的病毒在某些情况下缺乏
外壳蛋白 ,而类病毒则没有外壳蛋白[ 12] ;受病毒系
统和复合侵染的木本植物 ,纯化病毒和制备抗血清
难于完成;寄主植物中低浓度的病毒无法检测[ 4, 31] .
3.3 分子生物学技术
分子生物学技术是通过检测病毒核酸来证实病
毒的存在 ,该技术比 ELISA灵敏度高 、特异性强 、快
速 ,可用于大量样品的检测 ,并且适应范围广 ,其应
用对象可是 RNA病毒 、DNA 病毒及类病毒.目前常
用的分子生物学技术包括核酸分子杂交技术 ,双链
RNA电泳技术 , RT -PCR技术.分子杂交技术可检
测到 pg数量级的植物病毒基因组 ,但存在同位素标
记有放射性污染 , cDNA探针半衰期短的缺点[ 25 , 34] .
双链 RNA 电泳技术可检测 dsRNA的数目 、大小 ,已
知和未知的病毒及低浓度病毒 ,但纯化 dsRNA 比较
麻烦 ,不能检测
放射性危险 ,可以检测 fg(10-15)数量级的植物病毒
及大规模的样品[ 4, 31 , 34] .近来 ,在 RT-PCR基础上又
发展了 IC-RT -PCR和多重 IC-RT-PCR.与 RT
-PCR相比 , IC-RT -PCR 可使灵敏度提高 1 250
倍 ,多重 IC-RT-PCR可以准确地同时检测出两种
以上症状相似 、难以区分的病毒[ 4 ,34] .分子生物学技
术在病毒检测上的应用将会有更广阔的前景.
3.4 电镜技术
电子显微镜以电磁波为光源 ,利用短波电子流 ,
分辨率可达到 0.1 nm ,而病毒粒体大小在 10 ～ 100
nm 之间 ,采用电镜可观察到有无病毒存在[ 12, 33] .电
镜应用受几个方面限制:电子穿透能力低 ,样品必需
很薄;制样需选取病毒浓度最高的组织[ 12] .由于李
属植物病毒浓度低 、分布不平衡 ,检测效果不十分理
想 ,电镜技术在李属植物病毒检测中应用少[ 14] .免
疫电镜技术的出现可能促进电镜技术在李属植物病
毒检测的应用.
4 展 望
综上所述 ,李属植物目前常用的 4 种脱毒技术
及 3种病毒检测技术各有其优缺点 ,从发展趋势来
看 ,取长补短 ,综合应用可有效提高脱毒效果及病毒
检测的灵敏度 、准确性和特异性.
李属植物脱毒及病毒检测技术的研究可为其他
科属观赏植物的脱毒及病毒检测提供有价值的参考
资料.部分观赏植物特别是切花类(如香石竹 、菊花 、
唐菖蒲 、月季等)由于病毒危害 ,品种退化 ,观赏价值
降低.通过脱毒处理及应用商品脱毒苗可保持优良
种性及提高观赏价值.病毒检测技术的研究还可为
由病毒引起的花叶现象的研究提供技术支持.
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