全 文 ：北方园艺２０１３（１２）：８７～９０ ·生物技术·
第一作者简介：张博（１９８７－），女，吉林松原人，硕士研究生，现主要从
事药用植物资源学和生态学研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｂ１９８７５２３＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：刘霞（１９６５－），女，吉林长春人，博士，副教授，现主要从
事中药资源的分类和调查与栽培技术的研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：
Ｌｉｕｘｉａ６５１０１５＠１６３．ｃｏｍ．
收稿日期：２０１３－０１－１７
东北地区香茶菜属植物遗传多样性的ＲＡＰＤ分析
张 博，刘 翠 晶，刘 霞
（吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春１３０１１８）
摘 要：以东北地区不同产地的２４份蓝萼香茶菜和尾叶香茶菜样品为试材，采用ＲＡＰＤ分
子标记技术对其进行遗传多样性分析。结果表明：从６０条随机引物中筛选出５条引物用于２种
香茶菜的扩增，２种香茶菜共扩增得到６３条清晰条带，其中５５条为多态性条带，多态性比率为
８７．３０％。系统聚类分析结果表明，２种香茶菜亲缘关系明显，遗传多样性较丰富，且种间大于种
内。因此，ＲＡＰＤ分子标记技术可以作为研究香茶菜属植物遗传多样性的有效标记方法。
关键词：蓝萼香茶菜；尾叶香茶菜；ＲＡＰＤ；聚类分析
中图分类号：Ｑ ９４９．９５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１３）１２－００８７－０４
唇形科香茶菜属植物［Ｒａｂｄｏｓｉａ（ＢＬ．）Ｈａｓｓｋ．］在全世
界约有１５０种，我国约有９０种２１个变种，是该属植物资源
最丰富的国家［１］。东北地区有２种，即蓝萼香茶菜［Ｒａｂｄｏ－
ｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ （Ｂｕｒｍ．ｆ．）Ｈａｒａ ｖａｒ．ｇｌａｕｃｏｃａｌｙｘ （Ｍａｘｉｍ．）
Ｈａｒａ］和尾叶香茶菜［Ｒａｂｄｏｓｉａ ｅｘｃｉｓｅ（Ｍａｘｉｍ．）Ｈａｒａ］。２种
香茶菜在吉林省的分布尤为丰富，多生长在向阳山坡、路边、
林间等地［２－３］。香茶菜属植物在民间多作药用，用于清热解
毒、活血破瘀、抗菌消炎、抗癌、治疗各种肝炎等［４］。对于这２
种香茶菜属植物的研究，国内外多有报道，主要集中在其化
学成分、药理和毒理作用等方面［５－９］。该研究利用随机扩增
多态性ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）标
记技术对东北地区不同产地的２种香茶菜的自然群体的遗
传多样性进行研究，以期从分子水平研究其适应环境变化
的能力，为更好的开发、利用和保护现有的野生植物资源奠
定基础，也为这一药用植物人工栽培提供相关理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试蓝萼香茶菜和尾叶香茶菜采于２０１２年６～８
月，蓝萼香茶菜采自吉林省的长白县十二道沟、磐石市
烟筒山和延吉市帽儿山，尾叶香茶菜采自吉林省长白县
十二道沟、磐石市烟筒山和辽宁省丹东凤凰山（表１）。
每个样地每种香茶菜分别采摘４株新鲜幼嫩叶片，每株
植株间隔１０ｍ以上，装入冰盒带回实验室，处理干净后
置于－７０℃超低温冰箱中保存备用。
表１ 采样地地理位置
Ｔａｂｌｅ １ Ｇｅｏｇｒａｈｉｃａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｉｎｇ
采样地（采样地代号） 样本数 经度 纬度 海拔／ｍ
长白十二道沟（ＬＣＢ） ４ １２７°４２′Ｅ ４１°２５′Ｎ ５００～７５０
磐石市烟筒山（ＬＹＴ） ４ １２６°１０′Ｅ ４３°１７′Ｎ ３５０～４５０
延吉市帽儿山（ＬＭＳ） ４ １２９°２８′Ｅ ４２°５１′Ｎ ２１０～２４０
长白十二道沟（ＷＣＢ） ４ １２７°４２′Ｅ ４１°２５′Ｎ ５００～７５０
磐石市烟筒山（ＷＹＴ） ４ １２６°１０′Ｅ ４３°１７′Ｎ ３５０～４５０
辽宁省凤凰山（ＷＦＨ） ４ １２４°５′Ｅ ４０°２５′Ｎ ３００～４００
基因组操作试剂盒（大连宝生物工程有限公司）、
ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（大连宝生物工程有限公司）、
２×Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（北京百泰克生物技术有
限公司）、随机引物（上海生工生物工程股份有限公司）、
三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、硼酸、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、
溴化乙锭（ＥＢ）、琼脂糖（上海瓦兰生物技术有限公司）。
５×ＴＢＥ电泳缓冲液（１ ０００ｍＬ）：５４ｇ Ｔｒｉｓ，２７．５ｇ
硼酸，２０ｍＬ ０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０），ｄｄＨ２Ｏ补充至
１ ０００ｍＬ。
１．２ 试验方法
１．２．１ 基因组ＤＮＡ提取 每个单株取新鲜叶片５０ｍｇ，
采用试剂盒提取ＤＮＡ后，用１．５％的琼脂糖凝胶置于
０．５×ＴＢＥ的电泳缓冲液中电泳３０ｍｉｎ，用ＥＢ染色
５ｍｉｎ，取出胶块于天能数码凝胶图像处理系统（上海，广
州誉维生物科技仪器有限公司）中观察成像，记录ＤＮＡ
质量，并用微量分光光度计检测其浓度和纯度，最后将
浓度稀释至４ｎｇ／μＬ，－２０℃保存备用。
１．２．２ ＰＣＲ扩增 反应体系（２０μＬ）：ｄｄＨ２Ｏ ９．２μＬ，
２×Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ９μＬ，模板ＤＮＡ １μＬ，
引物０．８μＬ。扩增程序为：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃４０ｓ，
３６℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３８个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃
保温。取４μＬ扩增产物于２％的琼脂糖凝胶电泳中电
泳１ｈ后，经溴化乙锭染色，置于天能成像系统中进行拍
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·生物技术· 北方园艺２０１３（１２）：８７～９０
照记数。每个引物重复３次，以确保条带的稳定性。
１．３ 数据分析
ＲＡＰＤ是显性标记，同一个引物扩增产物的电泳迁
移率一致的条带被认为具有同源性。根据凝胶同一位
置片段的有无进行统计，有带的记为“１”，无带的记为
“０”，建立０／１数据矩阵，用ＤＰＳ数据处理软件构建遗传
距离矩阵，用ＵＰＧＭＡ法（非加权的成对算术平均法）构
建ＲＡＰＤ聚类树状图。
２ 结果与分析
２．１ 引物筛选
分别用２种香茶菜的ＤＮＡ模板进行扩增筛选，从
６０条ＲＡＰＤ随机引物中筛选出５条条带清晰、数量多、稳
定性好和多态性高的引物用于２种香茶菜的ＲＡＰＤ－ＰＣＲ
反应（表２）。
表２ 用于ＲＡＰＤ分析的５条随机引物序列
Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ５ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓ
引物 序列（５′～３′） 引物 序列（５′～３′）
ＯＰＢ－１０ ＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡ ＯＰＯ－０５ ＣＣＡＣＧＧＧＡＡＧ
ＯＰＤ－０８ ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＴ ＯＰＯ－０６ ＡＧＧＧＡＡＣＧＡＧ
ＯＰＤ－１１ ＣＣＡＣＧＧＧＡＡＧ
２．２ ＲＡＰＤ扩增条带的多态性分析
利用５个引物分别对２种香茶菜的各个自然居群
样品进行ＲＡＰＤ分析，由表３可知，扩增得到的清晰可
记录的条带为１１～１４条不等。共扩增出６３条可统计条
带，其中多态性条带５５条，占总条带数的８７．３０％，平均
每个引物扩增出１２条带，其中１１条是多态性条带，２种
香茶菜表现出较高的遗传多样性。图１为引物ＯＰＤ－０８
对２种香茶菜样品的扩增结果对比图，图２为引物ＯＰＯ－
０５对尾叶香茶菜样品２次重复试验的扩增结果。
表３ 蓝萼香茶菜和尾叶香茶菜种群多态位点比率
Ｔａｂｌｅ ３ Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｌｏｃｉ ｏｆ
Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃａｖａｒ．ｇｌａｕｃｏｃａｌｙｘａｎｄ Ｒ．ｅｘｃｉｓｅ
引物 条带数 多态性条带数 多态位点比率／％
ＯＰＢ－１０ １１ １０ ９０．９１
ＯＰＤ－０８ １４ １２ ８５．７１
ＯＰＤ－１１ １２ １０ ８３．３３
ＯＰＯ－０５ １２ １１ ９１．６７
ＯＰＯ－０６ １４ １３ ９２．８６
Ｔｏｔａｌ ６３ ５５ ８７．３０
图１ 引物ＯＰＤ－０８对２４份香茶菜样品的扩增
注：左１～４为 ＷＣＢ，５～８为 ＷＹＴ，９～１２为 ＷＦＨ；右１～４为ＬＣＢ，５～８为ＬＹＴ，９～１２为ＬＭＳ。
Ｆｉｇ．１ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ２４ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｓｏｄｏｎｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ＯＰＤ－０８
Ｎｏｔｅ：Ｌｅｆｔ １～４ｉｓ ＷＣＢ，５～８ｉｓ ＷＹＴ，９～１２ｉｓ ＷＦＨ；ｒｉｇｈｔ １～４ｉｓ ＬＣＢ，５～８ｉｓ ＬＹＴ，９～１２ｉｓ ＬＭＳ．
图２ 引物ＯＰＯ－０５对尾叶香茶菜样品的扩增结果
注：１～４为 ＷＣＢ，５?～８为 ＷＹＴ，９～１２为 ＷＦＨ，２次重复。
Ｆｉｇ．２ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ １２ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｒ．ｅｘｃｉｓａｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ ＯＰＯ－０５
Ｎｏｔｅ：１～４ｉｓ ＷＣＢ，５～８ｉｓ ＷＹＴ，９～１２ｉｓ ＷＦＨ，ｒｅｐｅａｔ ｔｗｏ ｔｉｍｅｓ．
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北方园艺２０１３（１２）：８７～９０ ·生物技术·
２．３ ２种香茶菜居群间聚类分析
通过用ＤＰＳ数据处理软件按Ｎｅｉ’ｓ遗传距离，得到
蓝萼香茶菜和尾叶香茶菜的２４个样本的居群遗传距
离，其范围约为０．００００～０．４１９４，并使用ＵＰＭＧＡ聚类
法得出树状图（图３）。从图３可以看出，在遗传距离
０．３１４３处，聚类为二大类群，前１２个是蓝萼香茶菜，后
１２个是尾叶香茶菜。蓝萼香茶菜的种内遗传距离较小，
磐石烟筒山（ＬＹＴ１１）和长白县（ＬＣＢ）的４个样品之间的
遗传距离较近，为０．０８１１，首先聚在一起，再与延吉帽儿
山（ＬＭＳ）的４个样品聚类，最后与磐石烟筒山（ＬＹＴ）的
其它３个样品聚集成为蓝萼香茶菜的类群。由于长白
县（ＷＣＢ６）与凤凰山（ＷＦＨ）的４个样品遗传距离较近，
为０．１６６７，首先聚在一起，又与烟筒山（ＷＹＴ）的４个样
品聚在一起，最后于长白县（ＷＣＢ２、４、８）的３个样品聚
集成为尾叶香茶菜类群。图３结果明确显示出蓝萼香
茶菜和尾叶香茶菜的亲缘关系，但仍可看出２种香茶菜
的种间差异大于种内差异。
图３ 种源Ｎｅｉ’ｓ遗传距离的ＵＰＧＭＡ聚类图
Ｆｉｇ．３ ＵＰＧＭＡ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｎｅｉ’ｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ
３ 讨论
利用ＲＡＰＤ标记可明确显示出供试材料种间和种
内的遗传差异，并能根据种内不同基因型或种间差异将
供试材料区分出来。长白县（ＷＣＢ６）与丹东凤凰山
（ＷＦＨ）的４份尾叶香茶菜存在交叉现象，也许是因为尾
叶香茶菜主要分布在东北地区，自然资源丰富，种内遗
传差异较小。磐石烟筒山（ＬＹＴ１１）与长白县的４份蓝
萼香茶菜存在交叉现象，原因也是如此。由于采集的材
料数量和地点有限，对研究这２种香茶菜的遗传多样性
有一定的局限性，因此，今后可采集更多地区的香茶菜
进行居群遗传多样性研究。
由于ＲＡＰＤ分子标记技术操作简便、快速、易行，近
年来广泛的用于研究种群遗传结构和种质资源保
存［１０－１１］，及药用植物的遗传关系［１２］。该试验结果表明，
利用ＲＡＰＤ技术对香茶菜属植物的蓝萼香茶菜和尾叶
香茶菜进行遗传分析时，表现出较强的区分能力，这也
说明用ＲＡＰＤ标记技术分析香茶菜属植物种质资源遗
传多态性的可行性。检测方法的稳定性是影响样本的
遗传多样性和居群遗传结构的重要因素。该试验中，
ＲＡＰＤ对ＤＮＡ模板的纯度和退火温度极为敏感，对聚
合酶等条件在一定范围内的改变却稳定很多。这与
Ｓｃｈｉｅｒｗａｔｅｒ等［１３］和Ｓｋｒｏｃｈ等［１４］的研究结论相符。因
此，确保ＤＮＡ模板的质量，使用同一批次的聚合酶，并
且在同一台ＰＣＲ仪进行试验，是获得重复性好的试验结
果必要保障。
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·生物技术· 北方园艺２０１３（１２）：９０～９２
作者简介：祝海燕（１９７８－），女，硕士，讲师，研究方向为蔬菜学。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｕｈａｉｙａｎ１９７８＠１２６．ｃｏｍ．
收稿日期：２０１３－０１－２１
结球甘蓝不同初级三体的花粉整齐度及生活力的研究
祝 海 燕
（潍坊科技学院，山东 寿光２６２７００）
摘 要：以“中甘１１”结球甘蓝初级三体为试材，结球甘蓝二倍体为对照，研究比较了其花粉
生活力、花粉整齐度和花粉量。结果表明：结球甘蓝各初级三体花粉的花粉量、整齐度、生活力均
低于二倍体，但不同三体之间存在着显著差异。经比较发现，三体６的花粉不管是在花粉量、花
粉整齐度还是花粉生活力上与二倍体相比都达到了差异极显著水平，说明结球甘蓝第６染色体
对花粉各方面的影响都较大，可能存在于花粉发育相关的基因。
关键词：结球甘蓝；初级三体；花粉整齐度；花粉生活力
中图分类号：Ｓ ６３５．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１３）１２－００９０－０３
初级三体是重要的遗传工具材料，利用初级三体可
将基因及连锁群定位到特定染色体上，从而构建基因的
物理图谱。由于三体增加了一条同源的额外染色体，位
于该染色体上的ＤＮＡ含量亦以等比例增加，因此必定
会影响到植株性状的表现，现以结球甘蓝二倍体为对
照，对结球甘蓝各初级三体的花粉生活力、花粉整齐度、
花粉量进行了研究，旨在研究不同染色体的附加对结球
甘蓝花粉生活力、花粉整齐度及花粉量的影响，以期为
结球甘蓝三体有性繁殖的保存、利用及利用其进行基因
定位提供遗传参数和依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试植物材料为“中甘１１”结球甘蓝初级三体系
植株。
１．２ 试验方法
１．２．１ 花粉量的测定 用血球计数板测定花粉量。取
单个花朵内即将开裂散粉的６枚花药置于洁净的小玻
璃瓶中，加入１０％甘露醇水溶液１ｍＬ，制成花粉悬浮
液，３次重复。然后用血球计数板计数花粉数，并计算出
平均单个花药中花粉量。
１．２．２ 花粉整齐度的观察 于上午９：００左右分别采
集各初级三体及二倍体当天散粉的花粉，将采集的新
鲜花粉均匀地撒到洁净的载玻片上，在４０×镜下观察
并记录花粉总数及畸形花粉数，各材料的观察花粉数
为１ ０００～１ ５００粒，并统计正常花粉和畸形花粉所占的
比例。
１．２．３ 花粉生活力的测定 用ＴＴＣ（２，３，５－氯化三苯基
四氮唑）染色法进行花粉生活力的测定。用１０％的蔗糖
溶液配成０．５％的ＴＴＣ染色液。将新鲜花粉涂在载玻
片上，加１～２滴ＴＴＣ染色液，盖上盖玻片，放入铺有湿
ＲＡＰＤ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｕｓ Ｒａｂｄｏｓｉａｉｎ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ
ＺＨＡＮＧ Ｂｏ，ＬＩＵ Ｃｕｉ－ｊｉｎｇ，ＬＩＵ Ｘｉａ
（Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ １３０１１８）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ２４ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｂｄｏｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｂｕｒｍ．ｆ．）Ｈａｒａ ｖａｒ．ｇｌａｕｃｏｃａｌｙｘ（Ｍａｘｉｍ．）Ｈａｒａ ａｎｄ Ｒａｂｄｏｓｉａ ｅｘｃｉｓｅ
（Ｍａｘｉｍ．）Ｈａｒａ ｆｒｏｍ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｒａｎｄｏｍ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）ｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ５ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ６０ｐｒｉｍｅｒｓ．６３ＤＮＡ
ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｒａｂｄｏｓｉａ，ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｗａｓ ８７．３０％．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｅｉ’ｓ
ｕｎｂｉａｓｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｒａｂｄｏｓｉａ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．Ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗａｓ ｈｉｇｈ，ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ＲＡＰＤ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｎ ｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒａｂｄｏｓｉａｐｌａｎｔｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｒａｂｄｏｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ ｖａｒ．ｇｌａｕｃｏｃａｌｙｘ；Ｒａｂｄｏｓｉａ ｅｘｃｉｓｅ；ＲＡＰＤ；ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ
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