全 文 ：果树学报 2015，32（5）: 751-762
Journal of Fruit Science
DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20150171
贵州柿属植物种质资源遗传多样性的SRAP分析
韩振诚，潘学军*，安华明，张文娥
（贵州大学·贵州省果树工程技术研究中心，贵阳 550025）
摘 要：【目的】探明贵州柿种质资源遗传多样性及亲缘关系状况，为其保护与利用提供理论依据。【方法】利用SRAP
分子标记技术对贵州83份柿种质资源的遗传多样性及亲缘关系进行分析。【结果】15对SRAP引物一共扩增出118个
DNA位点，其中 108个位点具有多态性，占总位点的 91.53%，等位基因数（Na）为（1.915 3±0.279 7），有效等位基因数
（Ne）为（1.418 9±0.352 1），遗传多样性指数Nei’s（He）为（0.252 6±0.176 0），平均Shannon信息指数（I）为（0.390 6±0.234 2），
地区间基因流Nm为3.702 6。UPGMA聚类分析表明，相似系数在0.740时83份柿种质资源被分为5组，居群之间的相
似系数与地理距离和种质植物学性状间呈一定的相关性。【结论】贵州柿资源存在丰富的多样性，人为因素导致地区间
存在较强的基因流，5个地区间柿种质资源遗传多样性依次为：黔中＞黔西＞黔南＞黔北＞黔东。SRAP标记可有效
揭示贵州柿种质资源的遗传多样性、分化程度和亲缘关系，研究结果对贵州柿种质资源的保护利用和遗传改良有重要
意义。
关键词：柿；SRAP；贵州；遗传多样性
中图分类号：S665.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980(2015)05-0751-12
Genetic diversity of Diospyros Linn. in Guizhou based on SRAP
HAN Zhencheng，PAN Xuejun*，AN Huaming，ZHANG Wen’e
(Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops，Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China)
Abstract:【Objective】To explore the present situation of Guizhou persimmon germplasm resources genet⁃
ic diversity and genetic relationship，and providing theoretical basis for its protection and utilization.
【Methods】In this study SRAP molecular markers technology was used to analysis the genetic diversity
and genetic relationship of 83 Guizhou persimmon germplasm resources.【Results】118 DNA loci were am⁃
plified by 15 pairs of SRAP primers，of which 108 loci were polymorphic，accounted for 91.53% of total
loci，the number of alleles (Na) was（1.915 3 ± 0.279 7），the effective number of alleles (Ne) was（1.418 9±
0.352 1），Neis gene diversity (He) was（0.252 6 ± 0.176 0），Shannons information index (I) was（0.390 6±
0.234 2）. UPGMA cluster analysis showed that the similarity coefficient is about 0.740，the 83 copies of
persimmon germplasm resources could be classified into 5 groups，there is a certain correlation between
groups of similar coefficient and the distance and germplasm botany traits.【Conclusion】The Guizhou per⁃
simmon resources contain abundant genetic diversity，and human factors leading to the presence of strong
gene flow among regions. The 5 regions of persimmon germplasm resources genetic diversity were，in or⁃
der，the Centre > West > Southern > Northern > Eastern. SRAP marker technology can effectively reveal
the genetic diversity，the degree of differentiation and phylogenetic relationship of persimmon germplasm
resources in Guizhou. And the results also have important significance in protecting，utilizing and genetic
improving of persimmon germplasm resources in Guizhou.
Key words: Diospyros Linn.；SRAP；Guizhou province；Genetic diversity
收稿日期：2015-04-27 接受日期: 2015-06-10
基金项目：贵州省科技攻关项目“贵州喀斯特山区特异果树种质资源发掘与利用”[黔科合农G字(2009)4003]
作者简介：韩振诚，男，硕士，研究方向：果树种质资源与遗传育种。Tel: 18286039213，E-mail：283059094@qq.com
􀆽通信作者 Author for correspondence. Tel: 13885094631，E-mail：pxjun2050@aliyun.com
果 树 学 报 32卷
中国是柿属（Diospyros Linn.）植物的原产中心和
分布中心，拥有丰富的种质资源[1-2]。种质资源是遗
传改良的基础，只有了解种质资源的遗传变异信息
及亲缘关系，才能有目的地选配亲本，培育出优良品
种。本课题组在对贵州地方柿种质资源的调查中发
现，贵州柿种质资源表型多样性丰富，在性状表现上
存在较大的变异[3]，但这些变异是环境引起的基因变
异还是人为选择因素导致还未得到印证。DNA分子
标记技术的出现，为种质资源的多样性分析、生物种
质资源的鉴别、杂交亲本的选配以及后代的选择提
供了便捷的途径。分子标记技术在柿属植物中应用
十分广泛，郭大龙 [4]同时采用 4种DNA分子标记技
术，对供试7种柿属植物进行亲缘关系分析，发现君
迁子、油柿、栽培柿的亲缘关系较金枣柿亲缘关系较
远；邓立宝[5]利用 SCoT和 SSR对广西柿属植物遗传
多样性进行分析，发现广西柿属植物遗传多样性较
丰富；艾呈祥等[6]利用SSR标记对山东牛心柿进行亲
缘关系分析，得出山东牛心柿群体遗传背景丰富，群
体间一定程度的遗传分化可能是人为选择所引起。
SRAP技术简便、快速，不需预知物种的序列信息，近
年来在植物遗传多样性分析[7]、种质鉴定[8]、遗传连锁
图的构建[9]、基因连锁标记的寻找与基因定位和比较
基因组学研究[10]等方面得到广泛应用。我们以贵州
不同柿资源为材料，利用SRAP标记技术，系统评价
其遗传多样性及亲缘关系，为贵州柿种质资源状况
评价，优良地方品种鉴选及育种利用提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
通过查阅相关文献资料 [11-12]，笔者于 2011年 8
月至2013年5月底实地踏查了贵州省9个地区（州、
市）19个县（区、市），收集到了83份柿资源，以83份
贵州柿资源（包括地方品种、引进品种及野生资源）
的幼嫩叶片为试材。参照《中国植物志·柿卷》和《贵
州植物志·柿卷》的相关文字描述和图片资料，对所
采资源进行分类，83份柿资源分属3个种1个变种，
其中包括73份柿（D. kaki Thunb.），2份油柿（D. oleif⁃
era Cheng.），2份君迁子（D. lotus Linn.），6份野柿（D.
kaki Thunb. var. silvestris Makino）。所采集资源编号
及采集地情况详见表1。
表1 试验材料及采集地的地理参数
Table 1 Experiment materials and geographical parameters of collecting locations
编号
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
种名(变种)
Species
(Variety)
柿
(Diospyros
kaki Thunb.)
样品名
Sample
水城水柿-1 Shuicheng Shuishi-1
水城水柿-2 Shuicheng Shuishi-2
水城水柿-3 Shuicheng Shuishi-3
水城鸡蛋柿-1 Shuicheng Jidanshi-1
水城牛心柿 Shuicheng Niuxinshi
水城鸡蛋柿-3 Shuicheng Jidanshi-3
水城鸡蛋柿-4 Shuicheng Jidanshi-4
水城水柿-4 Shuicheng Shuishi-4
水城绵柿 Shuicheng Mianshi
水城水柿-5 Shuicheng Shuishi-5
六枝水柿-1 Liuzhi Shuishi-1
惠水盘柿-1 Huishui Panshi-1
惠水盘柿-2 Huishui Panshi-2
惠水盘柿-3 Huishui Panshi-3
惠水盘柿-4 Huishui Panshi-4
惠水馒头柿 Huishui Mantoushi
惠水盘柿-5 Huishui Panshi-5
惠水长柿-1 Huishui Changshi-1
惠水水柿-1 Huishui Shuishi-1
惠水盘柿-6 Huishui Panshi-6
惠水水柿-2 Huishui Shuishi-2
长顺绵柿 Changshun Mianshi
长顺水柿 Changshun Shuishi
荔波绵柿-1 Libo Mianshi-1
采集地
Origin
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
水城县 Shuicheng
六枝县 Liuzhi
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
惠水县 Huishui
长顺县 Changshun
长顺县 Changshun
荔波县 Libo
海拔
Altitude/
m
1 185
1 234
1 234
1 242
1 242
1 209
1 208
1 208
1 208
1 208
1 503
1 219
1 219
1 219
1 149
1 119
1 146
1 146
1 145
1 145
1 057
1 233
1 233
417
栽培类型
Cultivation type
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
752
5期
编号
Num
ber
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
种名(变种)
Species
(Variety)
油柿（Diospyros
oleifera Cheng.）
野柿 (Diospyros
kaki Thunb.
var. silvestris Makino)
君迁子
(Diospyros lotus Linn.)
样品名
Sample
荔波绵柿-2 Libo Mianshi-2
关岭盘柿-1 Guanling Panshi-1
关岭长柿-1 Guanling Changshi-1
关岭长柿-2 Guanling Changshi-2
关岭长柿-3 Guanling Changshi-3
关岭盘柿-2 Guanling Panshi-2
关岭圆柿-1 Guanling Yuanshi-1
关岭圆柿-2 Guanling Yuanshi-2
普定绵柿-1 Puding Mianshi-1
普定绵柿-2 Puding Mianshi-2
贵阳水柿-1 Guiyang Shuishi-1
贵阳水柿-2 Guiyang Shuishi-2
贵阳水柿-3 Guiyang Shuishi-3
贵阳水柿-4 Guiyang Shuishi-4
贵阳水柿-5 Guiyang Shuishi-5
白云方柿 Baiyun Fangshi
绥阳方柿-1 Suiyang Fangshi-1
绥阳方柿-2 Suiyang Fangshi-2
绥阳方柿-3 Suiyang Fangshi-3
绥阳方柿-4 Suiyang Fangshi-4
汇川水柿-1 Huichuan Shuishi-1
次郎-1 Jiro-1
汇川水柿-2 Huichuan Shuishi-2
次郎-2 Jiro-2
汇川圆柿 Huichuan Yuanshi
汇川牛心柿 Huichuan Niuxinshi
遵义盘柿 Zunyi Panshi
江口水柿-2 Jiangkou Shuishi-2
兴义磨盘柿 Xingyi Mopanshi
兴义平底柿-1 Xingyi Pingdishi-1
兴义平底柿-2 Xingyi Pingdishi-2
兴义平底柿-3 Xingyi Pingdishi-3
兴义牛心柿 Xingyi Niuxinshi
兴义鸡心柿-1 Xingyi Jixinshi-1
兴义鸡心柿-2 Xingyi Jixinshi-2
安龙水柿-1 Anlong Shuishi-1
安龙水柿-2 Anlong Shuishi-2
贞丰盘柿 Zhenfeng Panshi
岑巩糯柿-1 Cengong Nuoshi-1
岑巩糯柿-2 Cengong Nuoshi-2
岑巩糯柿-3 Cengong Nuoshi-3
岑巩糯柿-4 Cengong Nuoshi-4
岑巩糯柿-5 Cengong Nuoshi-5
岑巩糯柿-6 Cengong Nuoshi-6
赫章绵柿-2 Hezhang Mianshi-2
赫章绵柿-3 Hezhang Mianshi-3
赫章绵柿-4 Hezhang Mianshi-4
赫章绵柿-6 Hezhang Mianshi-6
赫章绵柿-7 Hezhang Mianshi-7
望谟油柿Wangmo Youshi
安龙油柿 Anlong Youshi
关岭野柿 Guanling Yeshi
荔波野柿-1 Libo Yeshi-1
荔波野柿-2 Libo Yeshi-2
荔波野柿-3 Libo Yeshi-3
安龙野柿 Anlong Yeshi
册亨野柿Ceheng Yeshi
花溪君迁子Huaxi Junqianzi
赫章君迁子 Hezhang Junqianzi
采集地
Origin
荔波县 Libo
关岭县 Guanling
关岭县 Guanling
关岭县 Guanling
关岭县 Guanling
关岭县 Guanling
关岭县 Guanling
关岭县 Guanling
普定县 Puding
普定县 Puding
花溪区 Huaxi
花溪区 Huaxi
花溪区 Huaxi
花溪区 Huaxi
花溪区 Huaxi
白云区 Baiyun
绥阳市 Suiyang
绥阳市 Suiyang
绥阳市 Suiyang
绥阳市 Suiyang
汇川区 Huichuan
汇川区 Huichuan
汇川区 Huichuan
汇川区 Huichuan
汇川区 Huichuan
汇川区 Huichuan
遵义县 Zunyi
江口县 Jiangkou
兴义市 Xingyi
兴义市 Xingyi
兴义市 Xingyi
兴义市 Xingyi
兴义市 Xingyi
兴义市 Xingyi
兴义市 Xingyi
安龙县 Anlong
安龙县 Anlong
贞丰县 Zhenfeng
岑巩县 Cengong
岑巩县 Cengong
岑巩县 Cengong
岑巩县 Cengong
岑巩县 Cengong
岑巩县 Cengong
赫章县 Hezhang
赫章县 Hezhang
赫章县 Hezhang
赫章县 Hezhang
赫章县 Hezhang
望谟县Wangmo
安龙县Anlong
关岭县 Guanling
荔波县 Libo
荔波县 Libo
荔波县 Libo
安龙县Anlong
册亨县 Ceheng
花溪区 Huaxi
赫章县 Hezhang
海拔
Altitude/
m
433
812
812
812
812
812
726
726
1 394
1 394
1 213
1 217
1 214
1 215
1 226
1 450
663
663
663
663
859
859
859
859
859
859
896
429
1 379
1 147
1 147
1 147
1 147
1 123
938
1 451
1 328
997
525
539
525
581
581
582
1 527
1 522
1 521
1 535
1535
553
1 468
812
849
557
417
1 328
1 075
1 210
1 638
栽培类型
Cultivation type
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
引进品种 Introduced varieties
地方品种Local varieties
引进品种 Introduced varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
地方品种Local varieties
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
野生资源Wild resources
表1（续）Table 1（continued）
韩振诚，等:贵州柿属植物种质资源遗传多样性的SRAP分析 753
果 树 学 报 32卷
1.2 方法
在初步查明柿资源分布情况的基础上，于春季
幼叶抽出时（4—5月）采集柿叶片。取健康植株的
新梢嫩叶，置于冰盒内带回实验室，用蒸馏水洗净叶
片、吸水纸吸干，去除主要叶脉，经液氮处理后放
置-70 ℃冰箱中保存备用。
采用罗正荣等[13]和CTAB法[14]，提取柿嫩叶的基
因组 DNA，利用质量分数 10%琼脂糖凝胶电泳和
K5500型超微量分光光度计分析仪进行DNA样品
质量和浓度的检测。模板DNA稀释至50 mg·L-1，置
于-20 ℃保存备用。
PCR[15]反应程序为：94 ℃，预变性 5 min；然后，
首次 5个循环按 94 ℃变性 1 min，35 ℃退火 1 min，
72 ℃延伸1 min的顺序，然后将退火温度升至50 ℃，
其他温度仍然不变，再进行35个循环；最后，72 ℃再
延伸10 min。扩增产物于4 ℃下保存。用质量分数
为2%的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳检测，并在紫外
凝胶成像系统上拍照保存。
引物选择参考Li等[15]、Ferriol等[16]和Riaz等[17]的
方法，所选引物序列如表2所示。用3个遗传差异较
大的柿DNA样品对 80对引物（上下游引物互相配
对）进行筛选，选取多态性好、扩增条带清晰稳定的
引物用于所有DNA样品的扩增。
1.3 数据统计与分析
SRAP产物按条带的有无分别赋值，在相同迁移
位置有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，建立
SRAP标记的 0、1矩阵。利用NTSYSpc2.10e软件计
算遗传相似性系数，按 UPGMA方法进行聚类分析，
构建树状图，分析样品间亲缘关系。应用 POP⁃
GENE 1.32软件进行遗传多样性参数分析，计算多
态性引物的有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性
指数（He）和Shannons信息指数（I）。
1.4 生态区域的划分
根据各生态区域环境的差异将贵州划分为黔
中、黔南、黔西、黔北和黔东 5个生态区域 [3]，利用
Popgen32对各地区柿种质资源间的亲缘关系做进一
步分析，计算各区域柿种质资源间的Neis遗传相似
系数和遗传距离。
2 结果与分析
2.1 DNA提取质量
釆用CTAB法和罗正荣等[13]提取柿DNA的方法
进行综合改良，提取柿属植物叶片基因组总DNA，
所提取的DNA样品用 1.0%琼脂糖凝胶电泳和超微
量分光光度计检测。从图1可以看出该方法提取的
DNA样品电泳带型亮度较好，整齐且没有明显拖
尾，表明其完整性较好，没有被降解现象[5]。各DNA
样品的OD260/280值在1.62~2.07，各样品之间的浓度比
表2 SRAP所用引物序列
Table 2 The primer sequences used in SRAP analysis
编号
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
引物名称
Primer name
Me1
Me2
Me3
Me4
Me5
Me6
Me7
Me8
Em1
Em2
Em3
Em4
Em5
Em6
Em7
Em8
Em9
Em10
引物序列(F 5’→ 3’)
Sequence(F 5’→ 3’)
5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGACC-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGAAG-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGTCC-3′
5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′
5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′
5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′
5′-GACTGCGTACGAATTGAC-3′
5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′
5′-GACTGCGTACGAATTAAC-3′
5′-GACTGCGTACGAATTGCA-3′
5′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′
5′-GACTGCGTACGAATTCTG-3′
5′-GACTGCGTACGAATTCGA-3′
5′-GACTGCGTACGAATTCAG-3′
退火温度
Annealing temperature/℃
46.15
51.11
47.19
50.63
48.17
46.81
50.63
51.80
45.18
50.05
49.03
48.10
46.46
51.11
48.10
48.70
50.24
48.70
754
5期 韩振诚，等:贵州柿属植物种质资源遗传多样性的SRAP分析
较接近，表明DNA质量较好，可用于下一步的 PCR
研究。
2.2 SRAP体系的建立
2.2.1 Master Mix浓度对 SRAP扩增结果的影响
Master Mix包含 Taq DNA Polymerase、Buffer、dNTPs
和Mg2+等成分，浓度为 2×Master Mix，进行 SRAP反
应时只需加入适量引物、模板和水即可进行PCR扩
增。由于Master Mix内含有反应的优化剂和增强
剂，因此它具有快速简便、特异性强、稳定性好等优
点。且室温下存放 7 d无明显活性改变。本实验采
用加染料（蓝色）的一种Master Mix，反应完成后直接
电泳。由图 2可知，Master Mix在 8.0、9.0 μL时扩增
产物较弱，当Master Mix增至 10.0和 11.0 μL时扩增
效果较好。从经济的角度来说，Master Mix的用量以
10.0 μL为宜。
2.2.2 引物浓度对SRAP扩增结果的影响 SRAP引物
采用的5个浓度为0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mol·L-1，
从图2可以看出，引物在试验的浓度范围内对SRAP
反应的影响较大。引物浓度在 0.4~0.7 mol·L-1时扩
增产物较弱，0.30 mol·L-1时扩增效果较好。
图1 部分柿DNA电泳分析
Fig. 1 Persimmon DNA electrophoresis
23 130 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
泳道1~5. Master Mix量依次为8.0、9.0、10.0、11.0、12 μL；泳道6~10.引物浓度依次为0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mol·L-1；泳道11~15.模板DNA
量依次为10、15、20、25、30 ng。
Line 1-5. Master Mix 8.0，9.0，10.0，11.0，12.0 μL；Line 6-10. Primer 0.30，0.40，0.50，0.60，0.70 mol·L-1；Line11-15. Template DNA 10，15，
20，25，30 ng.
图 2 引物浓度、模板DNA量以及Master Mix浓度对SRAP反应的影响
Fig. 2 Effects of primer concentration，template DNA and Master Mix amount on SRAP reaction
2 000 bp
1 000 bp
500 bp
250 bp
100 bp
750 bp
引物筛选
Primer screening
DNA筛选
DNA screening
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M
MIX筛选
MIX screening
2.2.3 模板DNA含量对SRAP扩增结果的影响 20 μL
反应体系设的 5个模板 DNA量（10、15、20、25、30
ng）扩增谱带大致相同。当模板 DNA的反应量为
10 ng时，虽然条带数目较清晰，但条带亮度较大且
数目不稳定；当模板DNA的量为 15、20、25和 30 ng
时，均可扩增出清晰的条带，但大于 20 ng时亮度稍
减弱。因此，模板DNA量以20 ng为宜。
2.2.4 SRAP-PCR扩增优化反应体系的建立 综合
以上 3个影响 SRAP-PCR扩增反应体系的因素，可
以确定贵州柿 SRAP-PCR最优化反应体系：总体积
20 μL时，模板DNA 20 ng，引物浓度2×0.30 mol·L-1，
Master Mix 10 μL。
2.3 SRAP标记的遗传多样性及亲缘关系鉴定
2.3.1 SRAP 检测结果 根据 SRAP引物在属内种
间有通用性的特点，利用已发表的在柿上开发的80
对SRAP引物[18]，筛选得出16对引物，再对83份贵州
755
果 树 学 报 32卷
柿资源的基因组DNA进行扩增。在实际扩增中，只
有 15对引物对 83份柿资源有较好的扩增，引物
ME2-EM7扩增条带模糊，不适用于大批量扩增。利
用 15对 SRAP引物一共扩增出 118个DNA位点，其
中108个位点具有多态性，占总位点的91.53%，说明
供试样品遗传多样性比较丰富。每条引物可扩增出
5～11条带，平均 7.86条；产物介于 50～2 000 bp之
间，以 200～1 500 bp居多。其中引物ME5-EM9扩
增出的DNA条带数目最多，为11条，多态性比例为
100.00%。多态性最高的引物较多，有ME1-EM9等
8条引物，多态性最低的是引物ME6-EM2，多态性
百分率仅 60.00%。采用不同的 SRAP引物对贵州
柿资源进行 PCR扩增，扩增出的谱带数差异较大
（表3）。
表3 贵州柿SRAP分析的多态性情况
Table 3 Situation of appearances quality of SRAP analysis
编号
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
引物
Primer
引物ME1-EM9
引物ME3-EM2
引物ME3-EM8
引物ME5-EM9
引物ME6-EM5
引物ME6-EM2
引物ME7-EM9
引物ME8-EM8
引物ME2-EM2
引物ME8-EM9
引物ME1-EM1
引物ME4-EM9
引物ME7-EM2
引物ME5-EM4
引物ME1-EM2
总计 Total
扩增总条带
The total bands amplified
9
9
7
11
10
5
6
7
6
10
7
7
8
7
9
118
多样性条带
Diversity bands
9
9
6
11
10
3
6
5
6
10
7
6
7
5
8
108
多样性条带百分率
Diversity bands percentage/%
100.00
100.00
85.71
100.00
100.00
60.00
100.00
71.43
100.00
100.00
100.00
85.71
87.50
71.43
88.89
91.53
特异性条带
Specific bands
1
1
2.3.2 地区间资源遗传多样性 利用15条SRAP引
物对5个区域83份贵州柿种质资源DNA进行扩增，
Popgen32软件对 83份柿材料扩增的 118条DNA条
带进行分析。结果显示（表 4），等位基因数（Na）为
（1.915 3±0.279 7），有效等位基因数（Ne）为（1.418 9±
0.352 1），Nei’s基因多样性（H）为（0.252 6±0.176 0）、
Shannons信息指数（I）为（0.390 6±0.234 2），表明83
份柿资源间的遗传变异较大，品种资源间存在比较
丰富的遗传多样性。在5个地区水平上多态性条带
比例分布为 37.29%～80.51%，等位基因数（Na）的变
表4 地区间遗传多样性
Table 4 Genetic diversity among regions
地区
Area
贵州
Guizhou
黔中区域
Central of Guizhou
黔西区域
Western of Guizhou
黔南区域
Southern of Guizhou
黔北区域
Northern of Guizhou
黔东区域
Eastern of Guizhou
多态性带
Polymorphic
bands
108
95
83
83
69
44
多态性百分率
Percentage of
polymorphic/%
91.53
80.51
70.34
70.34
58.47
37.29
Na
1.915 3±0.279 7
1.805 1±0.397 8
1.703 4±0.458 7
1.703 4±0.458 7
1.584 7±0.494 9
1.372 9±0.485 6
Ne
1.418 9±0.352 1
1.498 6±0.367 9
1.403 4±0.378 3
1.374 3±0.364 2
1.339 8±0.376 2
1.228 6±0.354 7
H
0.252 6±0.176 0
0.287 2±0.189 7
0.235 0±0.198 8
0.222 3±0.193 0
0.198 2±0.201 4
0.131 8±0.191 4
I
0.390 6±0.234 2
0.426 0±0.262 2
0.352 3±0.278 9
0.337 4±0.271 5
0.297 3±0.286 1
0.196 6±0.275 0
756
5期
化为 1.372 9～1.805 1，有效等位基因（Ne）的变化为
1.228 6～1.498 6，Neis遗传多样性指数（H）的变化为
0.131 8～0.287 2，Shannons信息指数（I）的变化为
0.196 6～0.426 0。利用 SRAP标记分别对 5个地区
间柿种质资源遗传多样性分析显示遗传多样性依次
为：黔中＞黔西＞黔南＞黔北＞黔东。
2.3.3 地区遗传距离及遗传分化 利用 Popgen32
对各地区柿种质资源间的亲缘关系做进一步分析，
计算各区域柿种质资源间的Neis遗传相似系数和
遗传距离，由表 5可见各地区间的遗传相似系数很
高，变化为 0.928 7～0.980 1，平均为 0.955 6。各地
区间的遗传距离很近，变化为0.020 1～0.074 9，平均
为0.045 7（表5）。其中黔西区域与黔北区域间柿种
质资源亲缘关系最近，遗传相似性最高，为0.980 1，
遗传距离最近为 0.020 1。黔西区域与黔东区域间
柿种质资源亲缘关系最远，遗传相似性最低为
0.928 7，遗传距离最远为0.074 0（图3）。
利用Popgen32进行分析，由表 6可见柿资源总
韩振诚，等:贵州柿属植物种质资源遗传多样性的SRAP分析
表5 5个地区间的遗传距离及遗传相似系数
Table 5 Genetic identity and genetic distance among 5 regions
地区
Area
黔中区域
Central of Guizhou
黔西区域
Western of Guizhou
黔南区域
Southern of Guizhou
黔北区域
Northern of Guizhou
黔东区域
Eastern of Guizhou
黔中区域
Central of Guizhou
****
0.023 4
0.029 8
0.023 4
0.072 9
黔西区域
Western of Guizhou
0.976 9
****
0.038 6
0.020 1
0.074 0
黔南区域
Southern of Guizhou
0.970 6
0.962 2
****
0.036 6
0.069 1
黔北区域
Northern of Guizhou
0.976 9
0.980 1
0.964 0
****
0.068 6
黔东区域
Eastern of Guizhou
0.929 7
0.928 7
0.933 2
0.933 7
****
注：上三角表示遗传相似系数，下三角表示遗传距离。
Note: Neis genetic identity（above diagonal）and genetic distance（below diagonal）.
的遗传多样性（Ht）为（0.243 9±0.031 4），地区内遗传
多样性（Hs）为（0.214 9±0.025 3），遗传分化系数
（Gst）为0.119 0，表明分布在地区间的遗传变异占总
遗传变异的11.90%，地区内遗传变异占总遗传变异
的88.11%。地区间基因流的估测值（Nm）为3.702 6
（表6）。
2.3.4 资源间遗传多样性 利用NTSYSpc2.10e软
件对15对引物扩增获得的SRAP多态性数据进行分
析，得到各供试样品之间的相似系数。83个供试材
料之间相似系数为0.600～0.940。其中‘惠水盘柿-
4’和‘关岭盘柿-1’之间的相似系数最大，为 0.940，
说明这 2个材料的亲缘关系较近，其他较近的种质
表6 5个地区的遗传分化系数及基因流
Table 6 5 regions genetic differentiation and gene flow
平均值Mean
标准差 Stand
n
83
Ht
0.243 9
0.031 4
Hs
0.214 9
0.025 3
Gst
0.119 0
Nm
3.702 6
注：n样本数，Ht总的遗传多样性，Hs地区内遗传多样性，Gst遗传分化系数，Nm基因流。
Note: n sample size，Ht total genetic diversity，Hs genetic diversity in region，Gst genetic differentiation，Nm gene flow.
0.931 3 0.943 5 0.955 7 0.967 9 0.980 1
相似系数
The similarity coefficient
黔北区域Northern ofGuizhou
黔西区域Western ofGuizhou
黔中区域Central ofGuizhou
黔南区域Southern ofGuizhou
黔东区域Eastern ofGuizhou
图3 5个地区UPGMA聚类分析
Fig. 3 UPGMA dendrogram of 5 regions
757
果 树 学 报 32卷


图4 引物ME5-EM9对83份柿材料的扩增分析
Fig. 4 83 persimmon materials amplification maps of primer ME5-EM9
有‘惠水水柿’和‘贵阳水柿’，相似系数为0.925。而
‘次郎-1’和‘望谟油柿’的相似系数为0.600，这说明
‘次郎-1’和‘望谟油柿’的亲缘关系较远。图4为引
物ME5-EM9对83份柿种质资源的扩增条带图谱。
2.3.5 贵州柿资源分子遗传多样性聚类图谱 用
UPGMA构建83份柿资源的分子系统树（图5），根据
聚类分析结果，当相似系数在0.740时，可将供试83
份柿种质资源划分为 5组：组一包含甜柿‘次郎-1’
‘次郎-2’等 79份资源，本组资源都属于柿和野柿，
符合柿和野柿的植物学特性。组二包含 1份资源，
为‘花溪君迁子’。组三包含1份资源，为‘赫章君迁
子’。组四为 1份资源，‘安龙油柿’。组五只有‘望
谟油柿’1份资源，2份油柿资源并没有聚类到一起，
说明‘望谟油柿’和‘安龙油柿’的亲缘关系远，可能
在遗传进化中变异较大。
在相似系数为0.758时，进一步将上述柿与野柿
组分为6个亚组，亚组一包含2个甜柿资源，亚组二
包含 71份柿资源，亚组三包含‘关岭野柿’和‘册亨
野柿’，亚组四包含‘荔波野柿-1’，亚组五包含‘荔
波野柿-2’和‘荔波野柿-3’，亚组六包含‘安龙野
柿’。说明‘安龙野柿’与其他野柿之间亲缘关系较
远，甜柿与其他栽培柿不属于同一类群。
2 000
1 000750500
250
100
2 000
1 000750500
250
100
2 000
1 000750500
250
100
2 000
1 000750500
250
100
2 000
1 000750500
250
100
2 000
1 000750500
250
100
bp
758
5期 韩振诚，等:贵州柿属植物种质资源遗传多样性的SRAP分析
图5 83份柿材料SRAP标记聚类分析
Fig. 5 SRAP marker clustering dendrogram of 83 persimmon materials
0.60 0.69 0.77 0.86 0.94
相似系数
The similarity coefficient
4648114547182755049284142434431299223424697071727333255859576364656667685260612382310192135373639138121362142026151756545551533040164673276817780787982837574
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
ⅥBCDE
A
759
果 树 学 报 32卷
3 讨 论
3.1 SRAP标记在贵州柿种质资源研究中的应用
SRAP技术具有操作方便、快速、多态性高、预先
不需要知道物种的序列信息、可以产生共显性标记
等优点，该技术已在柿、香蕉等果树[18-20]种质资源遗
传多样性研究中得到应用。本研究SRAP-PCR反应
体系采用的是Master Mix，与郭大龙[18]的 SRAP反应
体系稍有不同，可能对扩增敏感性、特异性及产量产
生影响，所以需要重新进行体系的摸索和建立。在
试验中发现，Master Mix快速简便、特异性强、稳定性
好、经验证扩增效果良好，完全适用于柿种质资源的
SRAP分析，并在贵州柿遗传多样性和亲缘关系鉴定
中得以应用。
SRAP标记可明确各种质在基因水平上的亲缘
关系。贵州柿资源 SRAP标记结果表明，在分子遗
传多样性聚类图谱中相似系数为 0.740时，SRAP标
记可以将供试材料的亲缘关系分开，柿、野柿、油柿
和君迁子被归到不同的组。杜晓云等[21-22]研究中君
迁子与油柿、柿的亲缘关系较近，且被聚类到不同的
组。郭大龙 [4]釆用 SSR、SRAP、IRAP和REMAP 4种
分子标记技术对部分柿属植物进行遗传关系研究，
结果表明不同分子标记技术之间所反映材料间的遗
传关系大致相同，中国柿和日本甜柿被完全分开，近
缘种在聚类时和栽培柿也聚在不同的组中；贵州省
柿资源在表型性状Q型聚类分析中，欧氏距离D=
9.05处，将88份种质分为4个组，按欧氏距离大小依
次为油柿、君迁子、野柿和柿[3]。野柿共有6份资源，
它们作为柿的变种，与柿的亲缘关系较近，此研究结
果与邓立宝等[23]的研究结果相吻合。
SRAP标记结果可与表型分析的结果相互印证、
补充。在表型遗传多样性分析中 [3]，‘赫章绵柿-1’
与‘关岭盘柿-2’，虽分属两个区域但能聚类到一
起，表明2者的植物学性状非常相似，但在分子聚类
中，这2者的相似系数较小，说明2者在基因水平上
亲缘关系较远。从表型分析结果来看，‘兴义牛心
柿’和‘兴义鸡心柿’分在同一亚组但没有聚类在一
起，说明它们的植物学性状存在一定差异，而在分子
聚类分析中，它们聚类到一起，说明它们的遗传关系
在基因水平上较近。‘花溪君迁子’和‘赫章君迁子’
的相似系数为 0.720，亲缘关系较近，花溪和赫章的
地理位置相差较远，这也说明君迁子在遗传进化中
变异不大。
SRAP标记可区分柿属同物异名和同名异物的
种质资源。‘兴义平底柿’与‘惠水盘柿’的亲缘关系
较近，说明平底柿可能是盘柿的一种，而且‘惠水盘
柿’、‘贞丰盘柿’和‘关岭盘柿’为近缘种质，可能为
同物异名。贵州的‘惠水盘柿’由于其优良的品质，
被贵州及南方地区广泛栽培，‘贞丰盘柿’与‘关岭盘
柿’有可能是‘惠水盘柿’引种的后代，平底柿为兴义
当地群众的称呼，其果实形状为扁圆形，与‘惠水盘
柿’一致，单果质量小于‘惠水盘柿’，所以有可能是
‘惠水盘柿’引种后在兴义管理的差异导致单果质量
偏低，在地方品种审定中，可将其视为同一品种；‘关
岭圆柿’和‘水城鸡蛋柿’能够聚类到一起，‘关岭圆
柿’有可能与‘水城鸡蛋柿’为同源；‘兴义牛心柿’与
‘汇川牛心柿’‘水城牛心柿’的相似系数较小，说明
为同名异物的柿资源；‘六枝水柿’‘汇川水柿’与‘贵
阳水柿’的相似系数较小，分别聚类到不同的组中，
结合表型聚类的结果，这几个种质亲缘关系也较远，
说明这几份种质是同名异物。
3.2 贵州柿资源遗传多样性丰富
一个居群、物种遗传多样性越高或遗传变异越
丰富，对环境变化的适应能力就越强；容易扩展其分
布范围和开拓新的环境，因此对遗传多样性的研究
可以揭示物种或居群的进化历史，也能为进一步分
析其进化潜力和未来的发展方向提供重要的资料，
尤其有助于对物种稀有或濒危原因及过程的探讨。
贵州省位于滇黔桂植物区系融汇交错地带，立
体气候明显。独特的气候和良好的生态环境可为柿
的生长繁育提供得天独厚的条件，致使贵州柿资源
分布范围广，类型多样。SRAP标记结果表明贵州柿
资源遗传多样性丰富，5个地区间柿种质资源遗传
多样性依次为：黔中＞黔西＞黔南＞黔北＞黔东，此
结果与韩振诚等[3]的表型研究结果基本一致，说明贵
州省柿资源最丰富的地区为黔中区域，应优先考虑
在此处建立种质保护点，以加强对柿种质资源的保
护和利用。黔西区域包含柿、油柿、君迁子和野柿4
个种资源，生物多样性丰富，也应列入保护范围。黔
西区域与黔北区域间柿种质资源亲缘关系最近，遗
传相似性最高，为0.980 1，遗传距离最近为0.020 1，
黔西区域和黔北区域位于贵州的西部和北部，地理
位置紧邻，资源间可能会产生基因渗透，使其两地资
源间遗传相似性较高。黔西区域与黔东区域分属贵
760
5期
州西部和东部，中间有黔中区域相隔，导致柿种质资
源亲缘关系最远，遗传相似性最低为 0.928 7，遗传
距离最远为 0.074 0。5个地区间基因流的估测值
（Nm）为3.702 6，表明地区间存在较强的基因流。遗
传分化和基因流是反映遗传结构的重要指标，一定
大小的研究群体对有效群体的代表性直接影响到对
群体遗传结构评价的准确性，Slatkin等 [24]认为基因
流大于1会抵制自然变异，防止群体内的遗传分化，
由于区域间地理障碍明显，区域间基因交流较少，本
研究区域间基因流估测值（Nm）为3.702 6，表明影响
本研究5个区域间群体遗传结构的主导因素不是遗
传分化，而是人为的广泛传播，说明人为的选择作用
对群体分化的影响很大。
4 结 论
贵州柿资源存在丰富的多样性，人为因素导致
地区间存在较强的基因流，5个地区间柿种质资源
遗传多样性依次为：黔中＞黔西＞黔南＞黔北＞黔
东。SRAP标记可有效揭示贵州柿种质资源的遗传
多样性、分化程度和亲缘关系，能够区分种质间的同
名异物和同物异名，研究结果对贵州柿种质资源的
保护利用和遗传改良有重要意义。
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