全 文 ：　[收稿日期] 　2009-12-07;2010-03-01修回
　[基金项目] 　辽宁省教育厅资助的辽宁省高校创新团队项目“苹果属皱叶矮生型资源的生殖特性及其形成机理研究”(2007T163)
　[作者简介] 　董文轩(1963-),男 ,教授 ,从事果树种质资源与遗传育种研究。
[ 文章编号] 1001-3601(2010)03-0174-0151-03
苹果属皱叶矮生型株系切柱头处理后代的
生长特性和倍性鉴定
董文轩 , 计永胜 , 赵晓东 , 卢丹阳 , 曾广娟
(沈阳农业大学 园艺学院 , 辽宁 沈阳 110161)
　　[摘　要] 对平邑甜茶与扎矮山定子杂交后代中四倍性皱叶矮生型株系 23号在开花前进行切柱头处理
后获得的 22株实生苗进行了叶片形态特征和株高的调查 ,并利用流式细胞仪进行了倍性鉴定 。结果表明 ,
10株皱叶型实生苗的平均高度为 27.70 cm 、叶形指数为 0.88;12株光叶型实生苗的平均高度为 61.12 cm 、
叶形指数为 2.00;后者是前者的 2.21倍和 2.27倍 ,差异明显 。在染色体倍性特征上 , 10株皱叶型实生苗中有 1株二倍体 , 6株三倍体和 3株四倍体;12株光叶型实生苗中有 1株单倍体 ,2株二倍体和 9株三倍体;三
倍性植株最多 ,占总株数的 68.18%。进一步分析表明 ,本试验中采用的切柱头方法对 23号株系没有阻断授粉的作用。[关键词] 皱叶型株系;实生苗;生长特性;倍性鉴定;苹果属[中图分类号] S661.1 [文献标识码] A
Growth Character istic and Ploidy Identification of Seedlings Derived from a
Dwarf Line with Curled Leaves of Malus by Cutting Its
Stigma before Flowering Stage
DONG Wen-xuan , JI Yong-sheng , ZHAO Xiao-dong , LU Dan-yang , ZENG G uang-jun
(College of Horticulture , Shenyang Agricultural University , Shenyang , Liaoning 110161 , China)
　　Abstract:The leaf morphological characteristic and plant height of 22 seedlings derived f rom the
tet raploid dw arf line w ith curled leaves by cutting i ts stigma before f low ering stage w ere investig ated and
their ploidy w as ident ified by the flow cy tome try.The results showed that the average plant height and
leaf index of 10 seedling s w i th curled leaves were 27.70 cm and 0.88 , the average plant height and leaf
index of 12 seedling s w ith smooth leaves w ere 61.12 cm and 2.00 , and there w ere significant dif ferences in
plant height and leaf index betw een tw o kinds of seedlings.There w ere 1 diploid seedling , 6 triploid
seedling s and 3 tet raploid seedling s in 10 seedlings w ith curled leaves and 1 haploid seedling , 2 diploid
seedling s and 9 triploid seedlings in 12 seedling s wi th smooth leaves.The numbe r of t riploid seedlings
accounts fo r 68.18% of to tal seedlings.The cut ting stigma method does no t block the po llinat ion of the
tet raploid dw arf line w ith curled leaves.
Key words:line wi th curled leaves;seedling;g row th characteristic;ploidy ident ification;Malus
　　苹果属(Malus M ill)植物属于蔷薇科(Rosace-
ae)苹果亚科(Maloideae),全世界约有 35 种。我国
丰富的苹果属植物种质资源对培育苹果新品种或砧
木将起着重大的作用[ 1] 。束怀瑞[ 2] 认为充分发掘和
利用丰富的砧木资源 ,选育适应不同生态条件下的各
类苹果砧木已成为苹果育种的一项重要内容。在苹
果属植物中 ,已经发现具有兼性无融合生殖习性的至
少有 8种 ,并发现不同种的无融合生殖能力差别较
大 ,其中 ,原产我国的湖北海棠变种平邑甜茶(Malus
hupehensis(Pamp.)Rehd.var.pingyiensis Jing et
Cheng)的无融合生殖能力很高 。此外 ,扎矮山定子
(M.Baccata(L.)Borkh.)也是我国发现的抗寒矮生
种质资源 ,其矮生性状由显性单基因控制 ,能稳定遗
传 ,可与来源不同的苹果品种杂交传递矮生性状 ,是
一个优良的矮生种质资源 。为此 ,沈阳农业大学园艺
学院董文轩等[ 3] 利用这一矮生资源作父本 ,与无融合
生殖类型平邑甜茶杂交以培育无融合生殖型实生矮
化砧木 ,共获得了几十个四倍性皱叶矮生型株系。王
颖等[ 4]曾利用流式细胞仪方法观测了其中 10号皱叶
矮生型株系在自然授粉条件下所得实生苗后代群体
中的倍性特征 ,结果发现8株光叶型实生苗全部为三
倍体 ,5株皱叶型实生苗中 3株三倍体 ,1株四倍体和
1株二倍体。本试验通过对 23号皱叶矮生型株系花
前切柱头处理的后代实生苗群体进行生长特性观测
和倍性鉴定 ,以评价其无融合生殖能力的强弱;为丰
富苹果无融合生殖砧木的育种理论 、获得新的无融合
生殖型砧木提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 试验材料
平邑甜茶(母)与扎矮山定子(父)杂交后代中 23
号株系在花前切柱头处理后所结种子形成的 2年生实
　贵州农业科学　2010 , 38(3):151～ 153　Guizhou Ag ricultural Science s
生苗群体 22株;对照植株为二倍性的普通山定子 、扎
矮山定子和三倍性的平邑甜茶。所有植株均种植在沈
阳农业大学园艺学院苹果育种基地 ,正常田间管理。
1.2 试验方法
1.2.1 切柱头处理及实生苗培育 切柱头处理于
2007年5月8日进行 ,在四倍性皱叶矮生型株系大量
开花前 1 d ,去除已开花朵和过小花蕾后 ,用手术剪剪
掉其他花蕾上部的 2/3 ～ 1/2 ,以切掉雌蕊的柱头和部
分花柱 ,并挂牌标记。到 9月 30日果实成熟时采收果
实 ,然后进行取种 、层积和播种 ,待幼苗生长1年后 ,于
2009年5-6月进行各项指标观测。
1.2.2 实生苗生长指标观测和倍性鉴定
1)DNA含量测定。2009年 5月 ,采集 22株实
生苗和 3个对照的幼叶 ,每株 2 ～ 3片 ,保湿处理并
做好标记后放入冰瓶中备用 。具体试验参照吴雅
琴[ 5]报道的方法 ,以二倍体山定子 、扎矮山定子和三
倍体平邑甜茶为对照 。称取 100mg 幼叶 ,在滴有
2mL 提取缓冲液的培养皿中研碎 ,500目尼龙网过
滤 ,滤液用标准试管收集 ,再加入 2mL 染色缓冲
液 ,在暗处和常温下染色 30min , 随即采用美国
Beckman公司的流式细胞仪测定 DNA 含量 。
2)2009年6月 ,用卷尺测量植株的叶片特征和
高度 ,每株至少测量 3个正常生长的叶片。
2 结果与分析
2.1 植株生长特性
经观察 ,22株实生苗中发现有 10株的叶片特
征为皱叶型 、12株为光叶型。皱叶型植株的叶片形
状为阔椭圆或近圆形 ,而光叶型植株的叶片形状为
长椭圆或纺锤形(图 1)。进一步测量皱叶型和光叶
型植株的叶片大小和植株高度 ,结果(表 1 、表 2)表
明 ,两者在叶片平均长度和植株平均高度上差异明
显;皱叶型植株分别为 3.98 cm 和 27.70 cm ,光叶型
植株分别为 8.06 cm 和 61.12 cm , 后者是前者的
2.02倍和 2.20倍;但两者在叶片平均宽度上差别较
小 ,皱叶型比光叶型宽 0.32 cm 。此外 ,皱叶型植株
的平均叶形指数为 0.88 ,而光叶型植株的平均叶形
指数为 2.00 ,后者是前者的 2.27倍 。
图 1 皱叶型(左侧)与光叶型(右侧)植株的叶片特征
　　Fig.1　The leaf cha racteristics o f seedling s with
curled leaves and smoo th leaves
表 1 皱叶型植株的叶片特征和植株高度及倍性
Table 1　The leaf characteristics , plant height and ploidy of seedlings with cur led leaves
材料编号
No.of samples
叶长/ cm
Leaf leng th
叶宽/ cm
Leaf width
叶形指数
Leaf index
株高/cm
P lant height
倍性
P loidy
37 3.60 4.40 0.82 24.0 3 倍体
38 3.20 2.90 0.65 27.0 3 倍体
39 2.10 2.30 0.91 28.0 2 倍体
40 5.06 5.20 0.97 43.0 4 倍体
41 4.00 4.52 0.88 20.0 4 倍体
42 3.94 4.17 0.94 33.0 3 倍体
43 4.70 5.07 0.93 32.0 3 倍体
44 4.39 4.62 0.95 27.0 4 倍体
45 4.25 4.90 0.87 22.0 3 倍体
46 4.54 4.98 0.91 21.0 3 倍体
平均值 3.98 4.51 0.88 27.7 -
表 2 光叶型植株的叶片特征和植株高度及倍性
Table 2　The leaf characteristics , plant height and ploidy o f seedling s with smooth leaves
材料编号
No.of samples
叶长/ cm
Leaf leng th
叶宽/ cm
Leaf width
叶形指数
Leaf index
株高/cm
P lant height
倍性
P loidy
25 9.00 3.91 2.30 57.0 3 倍体
26 9.94 5.30 1.88 92.0 3 倍体
27 5.40 2.09 2.58 75.0 3 倍体
28 9.72 5.63 1.73 45.0 3 倍体
29 7.54 4.08 1.85 84.0 3 倍体
30 7.65 4.70 1.63 72.0 3 倍体
31 8.31 4.44 1.87 76.0 单倍体
32 8.58 4.27 2.01 64.0 3 倍体
33 8.06 3.93 2.05 49.0 3 倍体
34 8.26 3.96 2.09 47.0 3 倍体
35 6.00 2.76 2.17 28.0 2 倍体
36 8.69 5.20 1.67 45.0 2 倍体
平均值 8.06 4.19 2.00 61.12 -
·152· 　　　　　　　　　　　　 　　　　贵 州 农 业 科 学 2010 , 38 卷
　　注:A 为 CK 1 ,普通山定子 , 2n=2x;B为CK 2 ,平邑甜茶 , 2n=3x;C为CK 3 ,扎矮山定子 , 2n=2 x;D为 35号 , 2n=2 x;E为 29号 ,
2n=3x;F 为 39号 , 2n=2x;G 为 45号 , 2n=3x;H 为 40号 , 2n=4 x。
图 2 对照植株和部分实生苗的细胞核 DNA 含量
F ig.2　The DNA content of CK and some seedlings de rived from the tetraplo id dw arf line with curled leaves
2.2 皱叶型和光叶型实生苗的倍性鉴定
通过对 23号切柱头处理后代的全部 22株进行
流式细胞仪倍性分析 ,结果(表 1 、表 2和图 2)表明 ,
在 10株皱叶型后代中有 1株二倍体 ,6 株三倍体 , 3
株四倍体;在 12株光叶型后代中有 9 株三倍体 , 2
株二倍体 ,1株单倍体 。因此 ,23号株系的实生后代
中有 68.18%为三倍体植株 , 13.64%为四倍体植
株 ,还有 13.64%的二倍体植株和 4.54%的单倍体
植株 ,并没有因为切柱头处理而全部出现与母体相
同的皱叶型四倍体植株 。说明 ,本试验采取的花前
切柱头处理并没有完全阻止 23号株系的授粉 、受
精 ,也未能造成无融合生殖后代的大量发生。
3 讨论
1)在以往有关无融合生殖特性的研究报道中 ,
切柱头处理的目的就是为了避免授粉并强制被处理
材料进行无融合生殖 ,也可以说切柱头是一种替代
去雄套袋的方法 。本试验进行切柱头处理的最初目
的也是为了评价处理材料的无融合生殖能力 。因
此 ,按照以往的报道和传统观念 ,所得到的实生苗都
应该是皱叶型四倍体植株 ,但实际结果是皱叶型四
倍体植株很少(13.64%)、而是三倍体植株居多
(68.18%),还出现了二倍体(13.64%)和单倍体植
株(4.54%)。出现倍性上如此混乱的主要原因应该
是本试验所采用的切柱头处理方法对 23号株系抑
制授粉并导致植株进行无融合生殖的效果很差。
2)尽管实生苗的倍性来源有待于进一步确定 ,
但根据以往的研究结果表明 ,四倍性皱叶矮生型资
源的减数分裂能力加强 、过程明显 ,在自然授粉条件
下主要形成三倍体后代[ 4 , 6] 。因此 ,本研究中出现
的大量三倍体植株 ,其来源应该是 23号四倍性株系
正常减数分裂所得二倍性雌配子与单倍性花粉正常
授粉受精的结果;实际上 ,处理树周围也确有较多的
二倍性苹果属植物。然而实生苗群体中出现二倍性
和单倍性植株的原因有待进一步探索 。此外 ,本试
验结果也显示切柱头处理的方法应谨慎使用并注意
改进(如采用切除全部花瓣和花柱而只保留子房的
方法),也说明去雄套袋的方法是阻止授粉的最有效
方法。
3)倍性鉴定在植物遗传育种和无融合生殖能
力鉴定中具有十分重要的作用 ,主要包括直接鉴定
和间接鉴定两种方法。直接鉴定法即为染色体计数
方法 ,这是确定倍性最基本和最精确的方法 。间接
鉴定法主要有流式细胞仪测定法 、气孔大小及保卫
细胞叶绿体数目 、植株形态指标鉴定等。因此 ,在使
用流式细胞仪确定试材倍性时最好与染色体计数方
法结合使用 ,特别是对那些特异倍性植株和非整倍
性植株 。
4)尽管本研究中皱叶矮生型四倍性实生苗只
有 3株 ,占全部实生苗的 13.64%,但这些植株应该
是母株无融合生殖的结果 ,这说明 23号四倍性皱叶
矮生株系具有一定的无融合生殖能力;这一结果可
为苹果砧木育种特别是为无融合生殖型矮化砧木育
种提供新的依据。
[ 参 考 文 献]
[ 1] 李育农.苹果属植物种质资源研究[ M] .北京:中国农
业出版社 , 2001:208-213.
[ 2] 束怀瑞.苹果学[ M] .北京:中国农业出版社 , 1999:
210-235.
[ 3] 董文轩.苹果实生矮砧育种途径的研究[ D] .辽宁:沈
阳农业大学 , 1995.
[ 4] 王 颖 , 周 攀 ,王玉霞 , 等.苹果属皱叶型植株实生
后代倍性鉴定研究[ J] .北方园艺 , 2008(11):43-46.
[ 5] 吴雅琴 , 常瑞丰 ,程各禾.流式细胞术进行倍性分析的
原理和方法[ J] .云南农业大学学报 , 2006 , 21(4):
407-409.
[ 6] 王 颖 , 商月惠 ,王玉霞 , 等.平邑甜茶与扎矮山定子
杂交后代的胚胎发育特征研究[ J] .园艺学报 , 2008 ,
35(8):1093-1100.
(责任编辑:聂克艳)
·153·　第 3 期 董文轩 等　苹果属皱叶矮生型株系切柱头处理后代的生长特性和倍性鉴定