全 文 ：桃属植物随机扩增多态性 DNA 分析的
最适反应条件
曹后男1 ,高光出2
(1.延边大学农学院 果林系 ,吉林龙井 133400;2.汉城国立大学 园艺系 ,韩国 水原 441744)
摘要:以 Yuuzora桃为试材对桃属植物随机扩增多态性 DNA(RAPD)分析的最佳反应条件进行了
研究.结果表明桃属植物 RAPD分析的最佳反应条件为:总反应混合溶液 5uL 时 , 添加模板 DNA
10 ～ 30 ng , Taq DNA 聚合酶 1～ 1.5 个单位 ,随机引物 10～ 20 pmol , dNTP 100 ～ 200 uM , MgCl2 2.
0 ～ 3.0 mM 及 5 uL10 倍反应缓冲液条件下扩增 50～ 55 个循环 ,能够获得具有良好的稳定性和重
复性的 DNA 扩增产物.PCR反应溶液的各组成因素如低于最适浓度范围时会导致扩增带数的减
少甚至无带 ,如高于最适反应浓度范围 , 则会出现带的弥散或缺失.
关键词:桃;RAPD;反应条件;重复性
中图分类号:S662.103.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1004-7999(1999)04- 0249-05
0　前言
RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)是 1990年由Williams等人在 PCR的基础上
发展起来的一种可对未知序列基因组 DNA 进行多态性检测的分子标记技术.RAPD技术具有
操作简便 ,快速 ,DNA多态性容易观察 ,所需DNA量少 ,感应度高 ,哪怕是一个DNA片段也能
扩增出 DNA带 ,而且无放射性污染等特点.因此 ,自问世以来的短短几年里已广泛应用于遗
传多样性分析 、基因定位 、遗传连锁图谱构建 、种子纯度的鉴定 、种质鉴定及起源 、演化和分类
等诸多领域 ,成为当今最重要的分子生物技术之一.然而 , RAPD分析时 ,反应混合液的各组成
成分对反应条件比较敏感.因此 ,在 RAPD分析时 ,首先要摸清供试材料的最适反应条件 ,建
立起稳定而具有高度重复性的反应体系.本试验以建立桃属植物 RAPD分析的最适反应体系
为目的 ,研究了组成反应混合液的诸因素的最佳反应浓度 ,为日后桃属植物 RAPD 分析提供
参考.
1　材料与方法
1.1　供试材料
本试验的材料是从韩国农村振兴厅园艺研究所的核果类种质资源圃采集的 Yuuzora品
种.六月上中旬 ,采集完全展开的幼嫩叶片 ,如不能马上提取 DNA时 ,放入-70 ℃的低温冰箱
第 21卷　第 4期
1999 年 12月 　 　　 　　　　 延　边　大　学　农　学　学　报Journal of Ag ricultural Science Yanbian University　　 　　　　Vol.21 No.4　Dec.1999
收稿日期:1999-10-09　　　　　　基金项目:韩国农业振兴厅资助项目.
作者简介:曹后男(1962-),女(朝鲜族),吉林省延吉市人 ,延边大学农学院果林系果树育种教研室副教授 ,博士.
DOI :10.13478/j.cnki.jasyu.1999.04.002
中保存备用.
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取
采用改良的 CTAB缓冲液提取法.提取的基因组 DNA用 UV/VIS 分光光度计(UV/VIS
spectrophotometer)测定纯度 ,用 DNA 荧光计(TKO 100 , Hoefer 公司)定量后 ,稀释成 10 ng/
uL 溶液 ,保存于-20℃的冰箱中备用.
1.2.2　PCR影响因素的研究
研究组成反应混合液的各影响因素时 ,在基本反应体系中 ,其它因素不变 ,相应地改变模
板DNA 、随即引物 、dNTP 、Taq DNA 聚合酶 、MgCl2 等因素的浓度及 PCR循环数 ,进行扩增
后 ,观察和比较不同浓度下的扩增效果.以上所有的试验都重复 3次.
1.2.3　PCR及电泳条件
采用 Operon公司的10碱基引物 , Promega公司的 dNTP , BM(Boehringer Mannheim)公司
的 Taq DNA 聚合酶.基因扩增仪使用了 Hybaid 公司的 OminiGene Thermal Cycler (Heated
Lid).基本反应体系为 50 uL 总反应体积中 , 添加 10 ng 模板 DNA , 10 pmol 引物(A01),
dNTP150 uM ,Taq DNA聚合酶 1.0个单位 ,MgCl21.5 mM ,10 倍反应缓冲液 5 uL ,不足的部
分由灭菌的三次蒸馏水来补充.PCR扩增程序为 94 ℃预变性 5min ,然后以 94 ℃1min ,36 ℃
1min ,72 ℃2min为一个循环 ,扩增 50个循环 ,最后在 72 ℃下延伸 5 min.扩增产物在电泳前
存放于 -20 ℃的冰箱中.
扩增产物在 1.4%的琼脂糖凝胶上电泳 ,电泳和凝胶用 0.5倍的 TBE 缓冲液.电泳结束
后 ,凝胶在 0.5 uL/mL 的溴化乙锭(EtBr)溶液中染色 10 ～ 20 min ,而后在水中清洗数秒中 ,于
紫外灯下观察并照像.
2　结果与分析
2.1　模板 DNA的浓度对 RAPD结果的影响
在 50 uL 反应体积中 ,其它的因素不变 ,各添加 1 ,5 ,10 ,15及 30 ng 模板 DNA进行 PCR ,
结果在 1 ng 的浓度下没有扩增产物 ,而在 5 ng 以上的浓度下 RAPD谱带基本上保持稳定 ,没
有差异(图 1-A).这说明 RAPD结果对模板 DNA的浓度不太敏感.
2.2　引物浓度对 RAPD结果的影响
从图 1-B ,C 中两个引物的 RAPD谱带中可以观察到 ,引物浓度为 1 pmol时没有扩增产
物 ,5 pmol时虽得到扩增 ,但带数减少 ,而在 10 ～ 20 pmol时扩增出很多分子量小的谱带.
Innis等人报导 ,引物的浓度过高时 ,会增加引物的错误搭配(mispriming),非特异性(non-
specific)扩增产物积累 ,还会形成与模板无关的引物———二聚体(primer-dimer).这些产物在
PCR过程中与正常的扩增产物发生竞争 ,结果正常的 PCR产物将会减少.Weeden等人认为引
物的最适浓度一般决定于模板 DNA的浓度及引物自身的碱基序列的组成.在本试验条件下 ,
引物的最适反应浓度为 10 ～ 20 Pmol.
2.3　dNTP 浓度对 RAPD结果的影响
从图 2-A 可知 ,桃进行 RAPD分析时 ,最适 dNTP 浓度为 100 ～ 200 uM .当 dNTP 浓度
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为 50 uM 时 ,扩增的带少 ,而且不稳定 ,当浓度增加到 100 ～ 200 uM 时 , RAPD带清晰 ,具有高
度的重复性 ,而当浓度增加到 300 uM 时没有扩增产物.Innis等人认为在 dNTP 的最适浓度范
围内 ,尽可能取低浓度时 ,可以减少引物与互补性不完全的碱基序列错配的现象 ,从而能够提
高 RAPD结果的特异性及可信度 ,梁太振认为 ,当 dNTP 浓度增加时能够有效地促进 DNA链
的合成 ,增加大于 2.0 kb的 RAPD带的形成.以桃为试材的其它研究中(Rajapakse , Lu等)均
采用 200 uM 浓度 ,与本试验结果基本一致.
2.4　MgCl2浓度对 RAPD结果的影响
据 Rajapakse和 Lu等人报导 ,MgCl2 是与 Taq DNA 聚合酶的活性有关的物质 ,如果浓度
过低 ,延伸反应受到阻碍 ,随着浓度的增加促进 RAPD带的形成 ,但浓度过高时 ,由于增加引
物的错误搭配 ,因而 ,降低 RAPD结果的特异性及重复性.从图 2-B可知 ,本研究中最适的
MgCl2 浓度范围是 2.0 ～ 3.0 mM .但是 ,Rajapakse和 Lu等人的研究中采用 5.0 mM 浓度时也
获得了清晰而具有重复性的 RAPD带.因此 ,认为桃中 MgCl2 的最适反应浓度范围可能超过
本试验的浓度范围.
2.5　Taq DNA 聚合酶对 RAPD结果的影响
从图 3-A 中可知 , Taq DNA聚合酶的浓度在 1.5 ～ 2.0个单位时 , RAPD带比较稳定 ,而
且具有重复性 ,可认为是最适浓度范围.但考虑到试验费用时 ,宜采用 1.5个单位.据 Innis和
Devos等人报导 , Taq DNA 聚合酶的最适浓度决定于模板 DNA 及引物的浓度 ,当聚合酶的浓
度增加时 ,扩增的带数会增加 ,但浓度过高时会降低扩增产物的特异性.
2.6　PCR反应循环数对 RAPD结果的影响
从图 3-B中可知 ,当采用 30和 45循环数时 ,几乎没有扩增产物 ,采用 50 ～ 55个循环数
时能够产生清晰而有重复性的 RAPD带 ,而在扩增 70个循环时 ,只有几条模糊的带.扩增 50
和 55个循环时 RAPD谱带无差异 ,但为缩短试验时间 ,扩增 50个循环为宜.
3　讨论
从本试验结果来看 ,桃 RAPD 分析的最佳反应条件为:50 uM 的总反应体积中 ,含模板
DNA 5 ～ 30 ng ,引物 10 ～ 20 pmol ,dNTP 100 ～ 200 uM , Taq DNA 聚合酶 1.5 ～ 2.0个单位 ,
MgCl22.0 ～ 3.0 mM ,扩增 50 ～ 55个循环.此反应条件与 Shimada , Rajapakse 和 Lu 等人在桃
中采用的反应条件基本一致.在此反应条件下 ,可以揭示出更丰富的 DNA 多态性 ,而且谱带
清晰 ,重复性强 ,稳定性高.各反应影响因素在低于最适浓度范围时会导致扩增带数减少甚至
无明显扩增 ,超过最适浓度范围时则会出现扩增带的弥散甚至扩增失败.因此 ,在进行大量的
RAPD分析前 ,首先针对所用试材及本实验室的具体条件 ,摸索最适反应条件.
据报导 ,PCR程序中的变性 、退火及延伸温度依作物而有所差异 ,而且 ,最适的变性温度
及其持续时间 ,根据模板 DNA中 G+C 含量的多少而有所变化.但是 ,在本试验中固定 PCR
温度及持续时间的条件下 ,研究了其它的因素.所以本试验结果得到的最适反应条件有可能不
是桃 PCR的最佳条件.在本研究中没能涉及到的反应温度 、反应溶液的酸度等诸影响因素 ,有
待于继续研究.
251　第 4 期 曹后男 ,等:桃属植物随机扩增多态性 DNA分析的最适反应条件
图 1　模板 DNA(A)及引物(B和 C)浓度对 RAPD 分析的影响
图顶数字为模板 DNA 及引物的浓度.M:λ-Hind Ⅲ分子量标记
图 2　dNTP(A)及 MgCl2(B)浓度对 RAPD 分析的影响
图顶数字为 dNTP及 MgCl2 浓度.M:λ-Hind Ⅲ分子量标记
图 3　Taq DNA聚合酶浓度(A)及循环数(B)对 RAPD 分析的影响
图顶数字为 Taq DNA 聚合酶浓度及循环数.M :λ-Hind Ⅲ分子量标记
252 延　边　大　学　农　学　学　报 第 21 卷　
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Factors influencing RAPD band patterns in Prunus Persica
CAO Hou-nan1 ,GAO Guang-chu2
(1.Department of Horticulture , Agricultural college of Yanbian University , Jilin Longjing 133400 , China;
2.Seoul National University , S uwon 441744 , Korea )
Abstract:This study w as carried out to investigate several factors affecting RAPD band pat terns
in Prunus Persica and to establish the optimum RAPD conditions for Prunus Persica.Acco rding
to the results the optimized RAPD reaction conditions for Prunus persica were 5 ～ 30 ng template
DNA ,10 ～ 20 pmol random primer ,100 ～ 200 uM dN TP ,2.0 ～ 3.0 mM MgCl2 ,1.5 ～ 2.0 unit
Taq DNA polymerase in a total of 50uL reaction mixture , and 50 ～ 55 cycles of amplification pro-
duced best RAPD band pat terns.Under optimized reaction conditions , RAPD band pat terns of
Prunus persica were quite repeatable.Lower concentration caused the decrement or lack of RAPD
bands and higher amount resulted in smear of RAPD bands or failure of amplif ication.
Key words:peach;Prunus persica;RAPD;react ion condition;reproducibility
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