全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2006,14 (6): 931~936
*基金项目:国家自然科学基金项目(No.30471203)资助。
作者简介:杜晓云(1979～),女,博士研究生。
**通讯作者。Authorforcorrespondence.教授,主要研究方向:植物种质资源。E-mail:.
收稿日期:2006-02-23接受日期:2006-04-17
·研究论文·
部分柿属植物IRAP反应体系的建立和指纹图谱构建 *
杜晓云,罗正荣**
(华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室,武汉430070)
摘要:为建立柿属(Diospyros)植物反转录转座子间扩增多态性(IRAP)技术体系,对 IRAP分析中影响 PCR扩增结果的若
干因子进行了研究。确立了适合柿属植物 IRAP分析的技术体系:20μL反应体系中,1×Buffer、模板 DNA50ng、Mg2+2.0
mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、引物0.40μmol/L、TaqDNA聚合酶1.0U,矿物油20μL;PCR扩增程序:95℃5min;95℃1
min,56℃1min,升温速率+0.6℃/s,72℃2min,循环44次;72℃延伸8min。该优化体系在7种柿属植物33个基因型的 I-
RAP分析中获得较理想的扩增结果,扩增片段 120～1500bp,不同种和柿种以下不同品种间扩增条带总数和带谱相同。每个
基因型都有其独特的指纹图谱,可作为区分不同基因型的依据,尤其芽变品种的鉴别。
关键词:反转录转座子;IRAP-PCR;技术体系;指纹图谱
中图分类号:S188文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2006)06-0931-06
EstablishmentoftheInter-retrotransposonAmplifiedPolymorphism(IRAP)
ReactionSystemandConstructionofFingerprintinSomeDiospyrosspp.
DUXiao-yun, LUOZheng-rong**
(KeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiology,MinistryofEducation,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)
Abstract: Several main factors influencing the IRAP-PCR reaction were analyzed in order to establish the inter-retrotransposon
amplifiedpolymorphism (IRAP)molecularmarkersysteminDiospyrosspp..Theoptimalsystemwasasfollows (in20μLreaction
system):Buffer1×,templateDNA50ng,Mg2+2. mmol/L,dNTPs0.25mmol/L,primer0.40μ ol/L,TaqDNApolymerase1.0
Uandmineraloil20μL.Theoptimalamplificationprogramwas:1cycleat95℃,5min;1cycleat95℃,1min; 6℃1min;ramp
+0.6℃/sto72℃;44cyclesof72℃,2min,1cycleat72℃, 8min.Steadilyandrealiblyprofilewasobtainedinthe33genotypes
belonging to 7 species using the optimal system and amplification program. The size of fragments obtained ranged from 120～1500
bp,thetotalbandsandamplificationpatternweredistinctiveindifferentspeciesandcultivals.Everygenotypeproducedanuniquefin-
gerprintaccordingtowhichdifferentgenotypescouldbedistinguishedfromeachother,especiallybetweenbudspots.
Keywords:retrotransposon;IRAP-PCR;techniquesystem;fingerprint
反转录转座子在高等植物中分布广泛,以RNA
为媒介保留母本DNA进行转座,参与植物遗传多
样性的产生,在决定植物基因组的大小、结构、功能
和进化中发挥着重要作用(王石平和张启发,1998)。
近年来,基于反转录转座子已经开发了多种分子标
记,其中,由 Kalendar et al.(1999)创建的 IRAP(in-
ter-retrotransposon amplified polymorphism)即反转
录转座子间扩增多态性,已在遗传多样性检测和系
统发育重建(Teoetal.,2005)、种质鉴定(Brétoetal.,
2001)、基因作图以及重要农艺性状基因的标记
(Manninenetal.,2000)等方面得到广泛应用,但国内
报道甚少。本研究拟建立柿属植物IRAP技术体系
和构建部分种质的指纹图谱,为进一步开展柿属植
物的遗传多样性和分子系统学等研究奠定技术基
础,也为其它物种开展相关研究提供借鉴。
1 材料和方法
1.1试材
供试材料为柿属君迁子 (DiospyroslotusL.)、老
鸦柿(D.rhombifoliaHerosl.)、油柿(D.oleiferaCheng)、
农 业 生 物 技 术 学 报 2006年
表1材料及编号
Table1The33Diospyrosspp.genotypes
1)金枣柿分类地位不详。PCNA,完全甜柿;PCA,完全涩柿;PVNA,不完全甜柿;PVA,不完全涩柿。
1)thetaxonomicstatusofJinzaoshiisunclear.PCNA,polination-constantnonastringent;PCA,polination-constantastringent;PVNA,
polination-variantnonastringent;PVA,polination-variantastringent.
编号
Code
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
试材
Genotype
富有 Fuyuu
松本早生Matsumoto-wase
上西早生Uenishi-wase
西村早生Nishimura-wase
赤柿 Akagaki
前川次朗Maekawa-Jirou
次郎 Jirou
阳丰 Youhou
花御所 Hana-gosho
骏河 Suruga
晚御所 Oku-gosho
新秋 Shinsyuu
禅寺丸 Zenjimaru
平核无 Hiratanenashi
华柿1号HuashiNo.1
雄株9号MaletypeNo.9
鄂柿1号EshiNo.1
宝盖甜柿Baogaitianshi
小宝盖柿Xiaobaogaishi
湘西甜柿Xiangxitianshi
四方甜柿Sifangtianshi
小果甜柿Xiaoguotianshi
罗田甜柿Luotiantianshi
磨盘柿 Mopanshi
铜盆柿 Tongpenshi
台湾正柿Taiwanzhengshi
沙谷1号SagoksiNo.1
浙江柿 Zhejiangpersimmon
君迁子 Dateplum
老鸦柿 Diamondleafpersimmon
油柿 Oilypersimmon
美洲柿 Commonpersimmon
金枣柿 1)Jinzaoshi
学名
Scientificname
DiospyroskakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.kakiThunb.
D.glaucifoliaMetc.
D.lotusL.
D.rhombifoliaHemol.
D.oleiferaCheng
D.virginianaL.
D.spp.
倍性
Polidylevel
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=9x=135
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=6x=90
2n=2x=30
2n=2x=30
2n=4x=60
2n=2x=30
2n=4x=60
2n=2x=30
脱涩类型
Astringenttype
PCNA
PCNA
PCNA
PVNA
PVNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PVNA
PVNA
PVNA
-
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCNA
PCA
PCA
PCA
PCA
-
-
-
-
-
-
原产地
Origin
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
Japan
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Korea
China
China
China
China
USA
China
浙江柿(D.glaucifoliaMetc.)、金枣柿(Jinzaoshi)、美
洲柿(D.virginianaL.)和柿(D.kakiThunb.)7种33个
基因型(表1)。
条件优化采用罗田甜柿(D.kakiThunb.)、磨盘
柿(D.kakiThunb.)和君迁子;指纹图谱构建试材见
表1。以上试材均采自华中农业大学柿圃。
1.2 DNA提取
基因组总 DNA提取参考 Luoetal.(1995)。
DNA质量及浓度检测使用 Cary-50紫外分光光度
计(美国Varian公司),终浓度稀释至10ng/μL,4℃
保存备用。
1.3 IRAP-PCR反应体系和参数
在预备实验基础上,设定 PCR基本反应体系
为:总体积 20μL,内含 10×Bufer(freeMg2+)2μL,
模板DNA40ng,Mg2+2mmol/L,dNTPs0.20mmol/
L,引物 0.3μmol/L,TaqDNA聚合酶 1U,矿物油
1滴。扩增反应于Biometra梯度PCR仪上进行,扩
增程序为:95℃ 5min;95℃ 1min,56℃ 1min
ramp+0.6℃/s,72℃,2min,循环 44次;72℃延伸
8min。
932
第6期 杜晓云等:部分柿属植物IRAP反应体系的建立和指纹图谱构建
PCR反应的各组分浓度优化条件见表2。在保
持其它因素一致的条件下,变化单一因子,筛选最优
参数(每次都将上一个筛选到的某个因素的最佳值,
作为固定值使用到下一个因素筛选中)。退火温度
(Tm)中间值设置在 56℃,共 12个温度梯度,选取
PCR仪自动生成的 46.0、48.6、51.5、54.4、57.3、60.2
和63.1℃7个温度进行IRAP-PCR温度梯度优化实
验 。 所 用 IRAP引 物 为 本 实 验 室 开 发 的 柿
Ty1-Copia类反转录转座子LTR特异引物,由北京
奥科生物技术有限责任公司合成,体系优化使用的
引物编号为SAR10;PCR试剂购自北京三博远志生
物技术有限责任公司。
表2IRAP-PCR反应体系各组分浓度优化条件设计
Table2Theoptimumdesignofcomponentconcentrationsfor
IRAP-PCRprotocol
1.4 产物电泳检测
取1/5上样缓冲液(1份10×TBE电泳缓冲液,
9份去离子甲酰胺,加溴酚蓝至0.5%,与 PCR产物
混合后,在含有EB(0.5mg/μL)的1.8%琼脂糖(西班
牙Biowest)凝胶上电泳,SYNGENE凝胶成像系统
观察并摄影记录。
2 结果和分析
2.1 不同DNA模板浓度对IRAP反应的影响
图1结果显示,20μL体系中,当DNA模板量
在10～50ng时均有扩增产物产生。但在10ng时扩
增谱带较少,产率较低,20和 30ng的谱带基本一
致,但存在一些非特异条带,40和50ng模板量时,
扩增趋于稳定,且谱带清晰,特异性较强。因此,模板
DNA用量在50ng时较佳。
2.2 不同Mg2+浓度对IRAP反应的影响
Mg2+通过影响TaqDNA聚合酶活性影响 PCR
扩增。由图 2可见,Mg2+浓度为 1.5和 2.0mmol/L
时,表现出良好的扩增效果。在1.5和2.0mmol/L以
上,虽也有扩增产物,且特异性较好,但产量不高,有
缺失带现象。因此从产量和扩增主带条数角度分析,
Mg2+浓度为1.5或2.0mmol/L时都比较理想。
图1.IRAP-PCR的DNA模板浓度梯度实验
Fig.1.ThetestofseriesofDNAtempleteconcentrations
intheIRAP-PCR
M,DL2000marker;1、2、3,分别代表罗田甜柿、磨盘柿和
君迁子(下同);TheconcentrationsofDNA:
a,10;b,20;c,30;d,40;e,50ng.
M,DL2000marker;1,2and3,Luotiantianshi,Mopanshi,andDate
plum,respectively,thesameasbelow.
图2.IRAP-PCR的Mg2+浓度梯度实验
Fig.2.ThetestofseriesofMg2+concentrationsintheIRAP-PCR
TheconcentrationofMg2+:a,1.0;b,1.5;c,2.0;d,2.5;e,3mmol/L.
2.3 不同dNTPs浓度对IRAP反应的影响
在上述实验基础上对dNTPs组分进行优化。图
3结果表明,dNTPs在0.15mmol/L时,谱带较弱,不
太稳定。0.20、0.25、0.30和 0.40mmol/L时,均可得
到很好扩增,说明dNTPs浓度对体系影响较小,但
第12涌道在0.30mmol/L明显有主带缺带现象,所
以从经济稳定的角度考虑,0.25mmol/L为最适宜的
dNTPs浓度。
2.4 不同引物浓度对IRAP反应的影响
不同引物浓度对IRAP反应的影响较大,由图4
可以看出,当引物浓度 0.40和 0.50μmol/L时谱带
清晰稳定,引物浓度太低(0.20和 0.30μmol/L)或太
高(0.60μmol/L),会由于与模板DNA配对结合量过
少或错配结合位点过多,在PCR呈指数扩增增长期
因得到的产物不充足或产生非特异性谱带,导致弥
散、主带不清晰或部分缺失。因此,引物浓度 0.4
μmol/L时最佳。
反应成分 浓度优化
Components Optimumconcentrations
TemplateDNA/ng 10 20 30 40 50
Mg2+/mmol·L-1 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
DNTPs/mmol·L-1 0.15 0.20 0.25 0.30 0.40
Primer/μmol·L-1 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
Taqpolymerase/U 0.50 0.75 1.00 1.50 1.75
933
农 业 生 物 技 术 学 报 2006年
图3.IRAP-PCR的dNTPs浓度梯度实验
Fig.3.ThetestofseriesofdNTPsconcentrationsinthe
IRAP-PCR
TheconcentrationsofdNTPs:a,0.15;b,0.20;
c,0.25;d,0.30;e,0.40mmol/L.
图4.IRAP-PCR的引物浓度梯度实验
Fig.4.Thetestofseriesofprimerconcentrationsinthe
IRAP-PCR
Theconcentrationsofprimer:a,0.20;b,0.30;c,0.40;
d,0.50;e,0.60μmol/L.
2.5 不同TaqDNA浓度对IRAP反应的影响
TaqDNA聚合酶在 PCR中的用量受反应体
积、酶活性、酶耐热性等因素的制约,TaqDNA聚合
酶用量偏低会使新链合成的效率下降,导致扩增产
物量减少;使用浓度过高,既造成浪费,又会导致非
特异性的扩增产物的积累。由图 5可见,当 Taq
DNA聚合酶用量为0.50U时,扩增的条带较少,且
不稳定,用量为 1.50和 1.75U时,非特异性条带增
多,主带变弱或缺失,用量为 1.0和 1.25U时,扩增
谱带相似且稳定清晰,从经济适用的角度考虑,确定
1.0U为适宜TaqDNA聚合酶浓度。
2.6 不同退火温度对IRAP反应的影响
在优化好的 DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物及
TaqDNA酶浓度的基础上,最后对退火温度进行优
化,扩增结果已较为理想。由图6结果表明,在预设
定的 7个不同退火温度下均得到了清晰的扩增谱
带。但不同的退火温度谱带带型差异较大。当Tm值
为 46.8、48.6和 51.5℃时,随退火温度的增加,约
1300bp大片段的扩增强度逐渐减弱,集中于400～
750bp的小分子量片段增多,直到Tm值为 54.4℃
时,约1300bp的大片段消失;Tm值为54.4和57.3
℃时结果趋于稳定;Tm值为 60.2和 63.1℃时,因
退火温度过高,引物扩增的特异性加强,导致谱带减
少,信息量降低。所以,为获得稳定有效的谱带,综合
多方面因素,退火温度选择51.5℃为理想。在具体
使用多个引物扩增时,参考各引物实际的Tm值,不
同的引物在此温度基础上稍有调整。
图5.IRAP-PCR的TaqDNA酶浓度梯度实验。
Fig.5.ThetestofseriesofdNTPsconcentrations
intheIRAP-PCR
TheconcentrationsofTaqDNAPolymerase:
a,0.50;b,0.75;c,1.00;d,1.50;e,1.75U.
图6.IRAP-PCR引物退火温度梯度实验
Fig.6.Thetestofseriesofannelingtemperatures
intheIRAP-PCR
Theannelingtemperatures:a,46.0;b,48.6;c,51.5;d,54.4;e,4.57.3;
f,60.2;g,63.1℃.
2.7 不同引物种类对IRAP反应的影响
本实验室共开发了 25个柿 Ty1-Copia类反转
录转座子LTR特异引物,在33份供试基因型中 19
个引物获得很好的扩增。但不同引物在不同基因型
扩增结果差别较大。图7为其中5个引物在其中3
份基因型中的扩增情况。
2.8 柿属植物指纹图谱构建
在以上反应体系和退火温度优化的基础上,建
立了表 1中柿属植物 7种 33份基因型的 IRAP指
纹图谱,结果如图8所示。SAR10在33份基因型上
934
第6期 杜晓云等:部分柿属植物IRAP反应体系的建立和指纹图谱构建
均能扩增出清晰、多态性丰富的谱带,扩增片段大小
在120～1500bp,不同种和柿种以下不同品种间扩
增条带数和带谱不尽相同,介于2～15条之间,除共
享一条约120bp的带外,每份材料都有其各自独特
的指纹图谱,即使是亲缘关系很近的品种,也可根据
指纹相互区分。如富有、松本早生及上西早生,三者
为芽变关系。由SAR10扩增图谱明显可以看出松本
早生比富有多出3条带,1条约在260bp处,2条位
于375～430bp之间,上西早生与富有、松本早生相
比都多出3条特征带,但同时也缺失了松本早生特
有的3条带。供试材料中次郎和前川次郎为芽变关
系,通过SAR10也得到很好的区分。由此可见由基
于反转录转座子的单个引物扩增建立的 33份基因
型指纹图谱,在柿品种鉴定上很有效。
图7.不同引物扩增产物电泳图
Fig.7.Theprofilesamplifiedbydiferentprimers
a,SAF1;b,SAR1;c,SAR8;d,SAR9;e,SAR10.
3 讨论
基于反转录转座子的分子标记技术的多态性来
源于反转录转座子结构、组成、分布和生物学过程
(Kumaretal.,1999)。不同类型的反转录转座子标记
检测的侧重点不同,IRAP反映反转录转座子插入位
点之间的多态性。其基本原理是根据反转录转座子
的LTR包含的保守序列设计引物,在PCR过程中与
LTR反转录转座子的相应区域退火,扩增出相邻的
同一家族的反转录转座子成员间的片段。由于IRAP
也是基于PCR反应,所以同其它传统的分子标记类
型一样,其最终结果易受多种因素的干扰。如模板
DNA、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、退火温
度以及扩增程序等,因此筛选并固化以上反应参数
对于获得稳定清晰的电泳结果十分必要。
众因素中,本实验发现扩增程序对实验结果影
响较大。关于分子标记反应体系优化试验的报道,很
少提及扩增程序对体系的影响。本实验对目前在
IRAP-PCR中使用的两种扩增程序均做了尝试。二
者差异仅存在于 PCR扩增由退火阶段向延伸阶段
过渡过程中的升温速率(ramp)。程序1使用PCR仪
默认的+5℃/s,但扩增图谱模糊,非特异性扩增明
显,有些品种出现明显的主带缺失现象,重复实验稳
定性较差。程序2调整升温数率ramp值为+0.6℃
/s,获得较理想的实验结果。原因可能是升温速率变
化平缓,有利于退火后的引物在延伸反应开始前更
图8.SAR10单引物对供试33个柿属植物基因型的IRAP扩增谱带
Fig.8.TheprofileofIRAPamplificationusingSAR10singleprimerinthe33Diospyrosspp.genotypes
试材编号见表1。ThecodenumbersareshowedinTable1.
充分、稳定的与模板结合。任羽等 (2005)对辣椒
SRAP-PCR反应体系的构建与优化实验中也发现程
序对结果的影响。本实验使用程序2得到很好的扩
增图谱,因此,该程序的调整思路是否可以用于常规
分子标记,尤其对于减小RAPD分子标记始终存在
的重复性差的缺点是否同样有效,值得进一步实验
探讨。
Miler和 Capy(2004)指出,反转录转座子较常
规标记具有灵敏度高、基因组覆盖度广和多态性丰
富等特点,尤其适用于种质鉴定、遗传多样性及系统
935
农 业 生 物 技 术 学 报 2006年
参 考 文 献
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stract)
发育分析。Pearceetal.(2000)利用 SSAP构建了迄
今作为详尽的豌豆属系统进化图。Brétoetal.(2001)
在克里迈丁桔上,用IRAP和 REMAP发现了很多
特异的标记,将用传统的RAPD、RFLP及AFLP分
子标记不能区分的不同芽变品种区别开来。本实验
利用构建好的体系对33份基因型进行 IRAP-PCR,
均能得到很好的扩增,且谱带丰富,可以很好地反映
基因型之间的差异,如图8所示。供试基因型中的松
本早生为富有的早熟性芽变,上西早生为松本早生
的芽变,前川次郎是次郎的芽变,本实验室曾经使用
RAPD和ISSR不能将它们区分开来(待发表),但利
用IRAP却可以明显区分之。表明IRAP用于柿属植
物品种鉴定具有很大的应用潜力。目前,柿芽变系列
品种鉴定及33份基因型的亲缘关系和系统起源与
进化的IRAP分析正在进行(待发表)。
936