全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(9)：1363—1367
Acta Hortieulturae Sinica
茄子 IRAP和 REMAP分子标记的开发
王利英 ，杜永臣 ，张 斌 ，石 瑶 ，王秋锦。，赵福宽
( 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 天津科润蔬菜研究所，天津 300384； 北京农学院生物技术系，
北京 102206)
摘 要：根据烟草和大麦中反转录转座子 Bare一1和Ttol的 LTR保守区域设计引物，对 14份茄子材料
进行 PCR扩增，分别采用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，建立了茄子 IRAP(inter—retrotrans—
poson amplifed polymorphism)和REMAP(retrotransposon．mierosatellite amplifed polymorphism)分子标记技术
体系。两种方法均得到了多态性丰富的指纹图谱，为茄子品种鉴定和指纹图谱构建提供了新途径。
关键词：茄子 ；分子标记；反转录转座子；IRAP；REMAP
中图分类号：S 641．1 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)09-1363-05
Development of M olecular Markers IRAP and REM AP in Eggplant
WANG Li．ying’一
，
DU Yong—chenh
， ZHANG Bin ，SHI Yao ，WANG Qiu-jin ，and ZHAO Fu-kuan
( Institute of Vegetables and Flowen，Chinese Academy 0厂Agricultural Sciences，Bering 100081，China； Tianjin Kernel Vegeta—
ble Research Institute，Tianjin 300384，China； Department Biological Technology，Bering University Q厂Agriculture，Bering
102206，China)
Abstract：Primers were designed based on LTR reserve region of Bare一1 and Ttol in tobacco and barley．
Fourteen varieties of eggplant were used as experimental materials for PCR amplification．Agarose and polyac—
rylamide gel electrophoresis were adopted to detect amplifcation products and the technique of IRAP and RE—
MAP molecular marker were constructed．Polymorphic fingerprints were obtained using two methods(IRAP
and REMAP)，new methods were developed for variety appraisal and fingerprint in eggplant．
Key words：eggplant；molecular marker；retrotransposon；IRAP；REMAP
反转录转座子广泛存在于植物基因组中，是目前所知数量最大的一类可活动因子 (McAlister&
Werren，1997)，根据是否具备长末端重复序列 LTR (1ong terminal repeat)可分为 LTR型和非LTR型
反转录转座子 (陈志伟和吴为人，2004)，目前研究较多的是 LTR型反转录转座子。近年来，几种基
于反转录转座子的分子标记技术在遗传多样性 (Elis et a1．，1998)、品种鉴定 (Breto et a1．，2001)
和连锁图谱构建 (Manninen et a1．，2000)等方面得到了广泛应用。
IRAP和 REMAP是 Kalendar等 (1999)基于大麦的反转录转座子首先开发出来两种检测效率高、
重复性强的分子标记方法。REMAP根据反转录转座子两端的 LTR保守序列和微卫星序列设计引物，
检测反转录转座子与简单重复序列之间的多态性。IRAP根据反转录转座子两端的 LTR保守序列设计
引物，检测相邻同一家族的反转录转座子插入位点间的多态性。
植物反转录转座子具有较高的相似性，相同类型的反转录转座子保守性较强。然而同一植物内相
同类型的反转录转座子又具有高度的异质性。因而本研究中参照茄科作物或其它作物的反转录转座子
收稿日期：2008—03—04；修回日期：2008—08一l】
基金项目：农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目
通讯作者Author for corespondence(E-mail：yongchen．du@mail．caas．net．ca)
致谢：感谢中国农业科学院蔬菜花卉研究所徐东辉博士对本试验给予的指导和帮助。
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设计引物，进行茄子相关分子标记的研究。目前基于反转录转座子的分子标记技术在番茄、辣椒
(Sheh et a1．，2005)、烟草 (肖炳光和杨本超，2006)等茄科作物的遗传多样性研究中已有报道。育
种工作者先后用RAPD和 ISSR方法对茄子部分品种和资源进行了遗传多样性分析及亲缘关系鉴定
(封林林 等，2002；毛伟海 等，2006；陈杰，2007)，而基于反转录转座子的标记方法尚未见应用，
茄子中有关LTR型反转录转座子的全序列也尚未见报道。
作者试图通过 IRAP和REMAP方法构建部分品种的指纹图谱，为进一步开展茄子品种鉴定和遗
传多样性分析提供新的借鉴，同时为茄子反转录转座子的研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
试验于2006年10月_2007年4月在北京农学院生物技术系实验室进行。14份茄子材料 (表 1)
同时播种，长至7～8片叶时随机选取3—5株，各采 1片心叶混合，采用 CTAB法提取基因组 DNA。
表 1 材料编号及来源
Table 1 The varieties and their sources in the experiment
由于目前茄子相关遗传信息很少，还没有 LTR型反转录转座子全序列的报道，所以分别选用了
已报道的烟草和大麦的反转录转座子 Bare．1和Ttol的LTR保守区域设计引物 (表2)，两个反转录转
座子都是 Copia类型。IRAP根据 Ttol设计为单引物；REMAP为双引物，正向引物为简单重复序列
(GA)。C，反向引物根据 Bare．1设计，由上海生工生物工程技术有限公司合成。
表2 RAP和REMAP引物
Table 2 Prinlers of IRAP aⅡd REMAP
1．2 IRAP和 REMAP反应体系及PCR程序设定
IRAP和 REMAP两种标记方法的引物设计原则存在区别，但反应体系相同。因此本试验前期以
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9 期 王利英 等 ： 茄子 IR A P 和 R E M A P 分子标记 的开 发
IR A P 所设 计 引物进行体系优化 ， 并 应用两 种方法构建指纹 图谱 。 反应体 系确定 为 20 恤L 。 其中包括 ：
l× P C R 缓 冲液 ， 2． 5 m m o] ? L
～
M gC l， ， 0． 2 m m ol? L
～
dNT P ， 6 pm ol引物 ， 1 U T aq D N A 聚合酶 ，
模板 D N A 30 ng。 P C R 扩增 反应程 序设 定为 ： 94 ℃ 预变性 4 m in ， 94 cC 变性 30 s ， 退 火温度根据不 同
引物设 定 ， 时间为 30 S ， 72 ℃ 延伸 2 ra in ， 4 0 个循环 ； 循环结束后 72 cc延伸 10 ra in ， 4 ℃ 终止反应 。
1 ． 3 P C R 产 物检测
1 ． 5 ％ 琼脂糖凝胶 电泳 ， 上 样量 10 肚L (1 ttL 负载缓 冲液和 9 肛 P C R 产物 )， E B 染色 。 6％ 非变
性 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 ， 上 样量 3 txL (2 斗L P C R 产物和 1 IxL 负载缓 冲液 )， 银染检测 。 B io— R ad G el
D oc’” X R 凝胶成像系统采集图像 。
2 结果 与分析
2． 1 琼脂糖和 非变性聚炳凝胶 电泳的检测 结 果 比较
图 1 为引物 P 。。 对 14 份材料扩增产物采用 不 同方式凝 胶 电泳结果 。 琼脂糖 电泳共扩增 出 8 条带 ，
其 中 2 条为共有带 (图 1 ， A 中箭 头 所 示 )。 而 聚丙烯 酰胺 电泳共 显 示 出 22 带 ， 其 中 4 条 为共 有带
(图 l， B 中箭头所示 )。 在 500 ～ 1 000 bp 之 间聚丙烯酰胺凝胶上 检测到至 少 5 种琼脂糖凝 胶 电泳上
没有检测到的带型 ， 一 些 在琼脂糖凝 胶 电泳上 分辨不 清 的弱带在 聚丙 烯上 能够清楚地 显 示 。 以 3 号
D A N 为例 ， 聚丙烯酰 胺凝 胶 电泳在 250 ～ l000 bp 之 间检测到 了 5 条琼脂糖 电泳没有 显 示 的条带 。 所
以 ， 应采用 聚丙烯酰胺凝胶 电泳检测产物 。 L eigh等 (2003 ) 的研 究也 表 明 ， IR A P 扩增 出的带较 多 ，
琼脂糖凝胶很难检测 ， 宜 采用分辨率更 高的聚丙烯酰胺凝胶 电泳进行检测 。
bp
5 000
2 000
l000
750
500
250
lO O
图 1 琼脂 糖 和 聚丙 烯酰 胺 凝 胶 电泳结果 比较
引物 ： P 。。 A ： 琼脂糖凝胶 电泳结果 ； B ： 聚丙 烯 酰胺凝胶 电泳结 果 ； I ～ 14 品种名称 见表 1 。 箭 头示 共有带 ：
F ig． 1 C om parison ofelectrophoresis by agarose and polyacrylam ide gel
P rim er： P 8J ． A ： A garose gel； B ： P olyacrylam ide gel； 1 — 14 ． T he cuhivar nam es ale in T able 1 ． A rrow s show com m on bands
2． 2 不 同标记 方法对 14 份材料 的扩增结果
经 聚丙烯酰胺凝胶 电泳检测 ， R E M A P 和 IR A P 两 种方法在 14 份材料上 都扩增 出了多态性 丰富的
谱带 ， 每份材料都有其独特的指纹 图谱 ， 这 两 种分子 标记 可 以 应用 为茄子 指纹 图谱构建和 品种鉴 定 。
同时也 说明茄子 中存在 C opia 类 型 的反 转录转 座子 ， 且 具有高度的异质性 。
R E M A P 扩增范 围 为 4 00 ～ 2 000 bp， 在 750 ～ 1 700 bp 共 扩 增 出 了 29 种 带 型 ， 有 3 条 大 约 为
l700 、 1 000 和 500 bp 的共有带 ， 差 异 带率 为 89 ． 7％ ， 在 不 同材料 间扩增 出的带 数介 于 5 ～ 17 条 。
IR A P 的扩增范围为 300 ～ 3 000 bp， 共扩增 出了 30 种带型 ， 仅有 一 条大约 为 3 000 bp 的共有 带 ， 差
异带率为 96． 7％ ， 不 同材料间扩增 出的带数为 2 ～ 17 条 。
8号超九叶茄和 13 号京丰九叶茄是两 个植株长势 、 果形果色极为相似的晚熟品种 。 在 R E M A P 扩
增 图谱中 ， 8号和 13 号至 少有 5 条清晰 的共有带 ， 差 异带也 很 明显 ， 750 ～ 1 000 bp 之 间的带型 很 容
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1366 园 艺 学 报 35 卷
易将二 者区别开 。 在 IR A P 扩增 图谱 中 ， 两 个 品 种 在 1 000 ～ 3 000 bp 之 间有 4 条 带 共 享 ， 但 是 在
300 ～ 750 bp 之 间 8号 比 13 号带型 丰富 ， 两 个 品种 同样得到很好 区分 。
引物 R K 扩增 的条带较多 ， 且 片段 明显 集 中在 2 000 bp 以 下 ， 以 烟 草反 转 录转座 子设 计 的 IR A P
引物 x：同样扩增 出了 3 000 bp 左 右 的大 片段 。
3 讨论
bp
5 000
3 000
2 000
1 000
750
500
300
A B
图 2 R E M A P 和 IR A P 两 种标记 方 法 扩增结 果 的 比较
A ： R E M A P 引物 R K ； B ： IR A P 引物 X 2 ； 1 — 14 号 品种 名称 见表 1 。
F ig． 2 C om parison ofam plifcations ofR E M A P and IR A P in eggplant
A ： R E M A P ， prim er R K ； B ： IR A P ． prim er X 2 ； l 一 14 ．
‘rhe euhivar nam es are in T able 1
以往报道都是利用 同种植 物 内 G ypsy 或 C opia 进 行 引物设计 ， 比如 P etr (2006 ) 利用 豌 豆 中 5 个
G ypsy类 型 的反转 录转座子设计 IR A P 引物 ， 区 分开 了遗传背景极 为相似的豌 豆 品种 ， 并将 33 个 品种
依据 亲缘关 系进行 了分类 。 肖炳光和杨本超 (2006 ) 以 烟草 中 3 个 C opia 类 型 的反转 录转 座 子 设 计 引
物 ， 对 59 份烤烟 品种进行 了聚类分析 。 本试验 中以 大麦 中 C opia 类型 反转 录转座 子进 行 IR A P 和 R E —
M A P 引物设计 ， 引物筛选 比较 困难 ， 但 是 以 同属 茄科 的烟草 中相关序列 进行 引物设 计 筛选 则相 对 容
易 。 这说 明反转录转座 子 的 L T R 具有相对 的保守性 。
本试验 以标记 开 发为主 ， 两种方法对供试材料都得 到了多态性丰富的扩增谱带 ， 丰富了茄子指纹
图谱构建 、 品种鉴定 和遗传多样性分析 的分子标记 方法 ， 也 为今后 开 展 茄子 反转录转座 子 的相关研 究
奠定 了基 础 。 与其它传统分子标记 一 样 ， IR A P 和 R E M A P 都是 基 于 P C R 的反 应 ， 扩增结 果 受底 物浓
度 、 退 火温 度和 扩增程序等因素影 响 。 本试 验在优化反 应体系过程 中发现 ， 两 种方法对循环 次数要求
较高 ， 循环 达 到 4 0 次扩增 图谱才清晰正 常 ， 宜采用 聚丙 烯酰胺凝胶 电泳 ， 以提高对弱带 的分辨率 。
M iller 和 C apy (2004 ) 指 出 ， 反转 录转座 子较常规标记 具有灵 敏度高 、 基 因组 覆盖 度广和多态性
丰富等特点 ， 尤 其适 用 于 种 质 鉴 定 、 遗 传多 样 性 及 系统 发育 分 析 。 杜 晓 云 和 罗 正 荣 (2006 ) 利 用
IR A P 方法建立 了部分柿属植物的指纹 图谱 ， 并很 好 区 分 了应 用 R A P D 和 IS S R 不 能 区 分 的芽变 品种 。
B reto 等 (2001 ) 利用 IR A P 和 R E M A P 在 克里 迈 丁桔上 发 现 了很 多标记 ， 将用 R A P D 和 A L F P 不 能 区
分 的 品种 区 分开 。 肖炳光 和杨本超 (2006 ) 利用 IR A P 标记 方法对 59 份烤烟 品种进 行扩增 ， 5 条引物
共扩增 出 15 1 条带 ， 其中多态性条带 14 5 条 ， 平均每个 引物扩增 多态 性 带数为 29 ． 0 条 ， 平 均 多态性
比率 96％ ， 远 高于 R A P D 和 IS S R 标记 的分析结果 。
理 论上 反转录转座子可 以任意方 向整合人 基 因组 中 ， 因此 同一 个反转录转座 子 家族 的两 个成员可
以 3 种形式相邻 ： 头对 头 、 尾 对 尾 和头 对 尾 。 应 用 IR A P 方 法 前 两 种 形 式 只需 一 个 单 引物 可 以 产 生
P C R 产物 ， 后 一 种形式则必 须用 5 ’和 3 ’L T R 两 个 引物 。 K alendar 等 (1999 ) 也 指 出 ， 由于 IR A P 标记
性极 高 ， 不 太适合种 间系谱研 究 ， 但在 栽 培 种 内则非 常有 利用 价值 。 IR A P 和 R E M A P 能 够追 踪 一 插
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b 5 1 — 2 1
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9期 王利英等：茄子 IRAP和 REMAP分子标记的开发 l367
人事件及其后世代，可广泛应用于种质资源的分类演化和遗传多样性分析。
反转录转座子在植物中分布广泛、高异质性 、种内种间具有丰富的序列和插入多态性，在逆境条
件下容易被激活从而产生新的突变，能够横向、纵向传递，从而使得基于反转录转座子的分子标记技
术逐渐受到重视。本研究初步建立了茄子 IRAP和 REMAP的分子标记技术体系，对进一步开展茄子
反转录转座子相关技术的研究和应用具有重要意义。
References
Breto M P，Ruiz C，Pina J A，Asins M J．2001．The diversification of Citrus clementina Hort ex Tan．，a vegetatively propagated crop species．
Molecular Phyfogenetics and Evolution，21(2)：285～293．
Chen Jie、2007．RAPD analysis of genetic relationship among the cultivated eggplant and wild relatives[M．D．Dissertation]．Shanghai：Shang—
hat Jiaotong University．(in Chinese)
陈 杰．2007．茄子种质资源的 RAPD分析 [硕士论文]．上海：上海交通大学．
Chen Zhi—wet，Wu Wet—ren．2004．Plant retrotransposons and their application．Hereditas，26(1)：122—126．(in Chinese)
陈志伟，吴为人．2004．植物中的反转录转座子及其应用．遗传，26(1)：122—126．
Du Xiao—yun，Luo Zheng—rong 2006．Establishment of the inter—retrotransposon amplifed polymorphism (IRAP)reaction system and constmc—
tion offingerprint in smile Diostoros spp．Journal ofAgricuhural Biotechnology，14 (6)：931—936．(in Chinese)
杜晓云，罗正荣．2006．部分柿属植物 IRAP反应体系的建立和指纹图谱构建．农业生物技术学报，14(6)：931—936．
Elis T H N，Poyser S J，Knox M R，Vershinin A V，Ambrose M J．1998．Polymorphism of insertion sites of Tyl—copia class retrotransposons
and its use for linkage and diversity analysis in pea．Molecular and General Genetics，260 (1)：9—19．
Feng Lin—lin，Qn Dong-yu，Lian Yong，Jin Li-ping，Wang Xiao—wu，Song Yan．2002．Analysis of genetic relationship among eggplant varieties．
China Vegetables，(4)：35—36．(in Chinese)
封林林，屈冬玉，连 勇．金黎平，王晓武，宋 燕．2002．利用 RAPD分析部分茄子品种的亲缘关系．中国蔬菜，(4)：35～36．
Kalendar R，Grob T，Regina M，Suoniemi A，Schulman A．1999．IRAP and REMAP：Two new retrotransposon—based DNA fingerprinting tech—
niques．Theoretical and Applied Genetics，98 (6)：704—7 1 1．
Leigh F，Kalendar R，Lea V，Lee D．Donini P，Schulman A．2003．Comparison of the utility of barley retrotransposon families for genetic analysis
by molecular marker techniques．Mol Gen Genamies，269：464—474．
Manninen O，Kalendar R，Robinson J．Schulman A H．2000．Application of BARE一1 retmtransposon markers to the mapping of a major resistance
gene for net blotch in barely．Molecular and General Ge netics，264：325—334．
Mao Wet—hat，Du Li—ming，Bao Chong-lai，Hu Tian—hua，Zhu Qin·met．Hu Hat—jiao．2006．Genetic diversity and genetic relatives analysis of
southern long—eggplant germplasm based orl inter—simple sequence repeat(1SSR)．Acta Horticuhurae Sinica，33 (5)：1109—1112． (in
Chinese)
毛伟海，杜黎明，包崇来，胡天华．朱琴妹，胡海娇．2006．我国南方长茄种质资源的 ISSR标记分析．园艺学报，33(5)：1109一
l1l2．
McAllister B F．Werren J H．1997．Phylogenetie analysis of a retrotransposon with implication for strong evolutionary constraints on reverse tran—
eriptase．Molecular Biology and Evolution．14 (1)：69—80．
Miller W J，Capy P．2004．Mobile genetic elements：Protocols and genomic applications．Methods in Molecular Biology，260：146—171．
Petr Smyka1．2006．Development of an eficient retrotransposon—based fingerprinting method for rapid pea variety identifcation．Apple Genetic
， 47
(3)：221—230．
Sheh May Tam ，Corinne Mhiri，Aat Vogelaar．Marcel Kerkvekd，Stephen R
， Pearee，Marie-Angele Gandbastien．2005．Comparative analyses of
genetic diversities within tomato and pepper collections detected by retrotransposon-based SSAP， AFLP and SSR．Theor Appl Genet，llO：
819 —831．
Xiao Bing—guang．Yang Ben·chao．2006．Analysis of genetic diferences among flue—cured tobacco varieties by IRAP markers
． Acta Botanica
Boreali—Oceidentalia Sinica，26(6)：1119—1124．(in Chinese)
肖炳光，杨本超．2006．利用 IRAP标记分析烤烟品种间遗传差异．西北植物学报，26(6)：1119—1124．
维普资讯 http://www.cqvip.com