全 文 ：Vol. 35 No. 12
Dec. 2015
第 35卷 第 12期
2015年 12月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.12.004 http: //qks.csuft.edu.cn
收稿日期：2014-08-08
基金项目：国家“十二五”科技计划课题“涩柿种质资源收集评价与新品种选育”（2013BAD14B0502）
作者简介：傅建敏，副研究员 通讯作者：谭晓风，教授；E-mail：tanxiaofengcn@126.com
引文格式：傅建敏， 梁玉琴，孙 鹏，等 . 柿属植物叶绿体 DNA提取方法优化 [J].中南林业科技大学学报 , 2015, 35(12): 25-28, 33.
我国柿属植物有 58个种和变种（变型），其
中特有种 27个，主要分布在我国西南部至东南部，
其 中作为果树栽培的有柿 Diospyros kaki Thunb、
君迁子 D.lotus L.、油柿 D.oleifera Cheng、浙江柿
D.glaucifolia Metc.等，其中尤以柿经济价值最高，
栽培范围最广 [1-2]。我国是柿的分布中心和原产中
心之一，拥有丰富的柿种质资源，现有品种 1 000
多个 [3]。前人利用形态学、细胞学、生物化学和
分子标记等方法在柿属植物遗传多样性、亲缘关
系和种质鉴定等方面进行了研究，证实君迁子、
油柿、浙江柿均属于柿近缘 2倍体野生种 [4-5]，但
由于研究起步晚，技术水平低，加之柿属植物倍
性复杂，野生资源缺失等原因，致使柿这一天然
6倍体的遗传背景、起源演化进程等都没有得到统
一、准确的结论，严重制约了柿遗传改良、杂交
育种等工作的进行。
胞质基因组序列保守，相对于核基因组更小，
但其进化速度较快，胞质基因组序列分析，特别
是叶绿体基因组序列分析，在科内属间和属内种
间均可进行分子系统发育研究，甚至在某些植物
类群中可以进行种内遗传多样性检测 [6]。并且由
于其遗传为非孟德尔遗传方式，为母系遗传，对
于亲本不明确的植物，可以排除父本干扰，在系
统发育研究中具有独特优势，同时，其分析结果
可以为核基因组研究提供佐证，使得植物系统发
育重建更加准确 [7]。要进行叶绿体基因组研究，分
离得到叶绿体是第一步，获得高质量的 cpDNA是
后续各项分子生物学研究的前提 [8-10]。柿属植物叶
柿属植物叶绿体 DNA提取方法优化
傅建敏 1，梁玉琴 1，孙 鹏 1，姬燕晓 2，谭晓风 3
（1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉
430072； 3.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004）
摘 要：利用 Percoll密度梯度离心法，对 4种柿属植物君迁子 D. lotus L.、油柿 D. oleifera Cheng、浙江柿 D.
glaucifolia Metc.、金枣柿 D. kaki spp.进行叶绿体 DNA（cpDNA）提取方法的优化，结果显示优化后的柿属植物
cpDNA提取方法具有高效、简便、重复性好、稳定性高的特点；经检验，利用此方法提取的 cpDNA质量好，
浓度与纯度均较高，能够满足后续叶绿体 PCR扩增、基因组测序等分子生物学试验。
关键词：柿属植物；叶绿体；DNA提取；Percoll密度梯度离心
中图分类号：S718.46；S665.2 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2015)12-0025-04
Optimization of method for extracting chloroplast DNA in Diospyros
FU Jian-min1, LIANG Yu-qin1, SUNn Peng1, JI Yan-xiao2, TAN Xiao-feng3
(1.Non-timber Forestry Research & Development Center, Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China;
2.College of Life Science of Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China; 3. Key Lab of Non-wood Forest Products of Forestry
Ministry, Central South University of Forestry & Tech nology, Changsha 410004, Hunan, China)
Abstract: In order to optimize the method of extracting chloroplast DNA（cpDNA）from Diospyros lotus L., D. oleifera Cheng, D.
glaucifolia Metc. and D. kaki spp., the technology of Percoll density-gradient centrifugation was used. The results show that the cpDNA
of Diospyros could be quickly, simply, repeatedly and steadily extracted by t he method. The quality of the cpDNA which was isolated
by this method was determined through the technology of agarose gel electrophoresis, which indicated that the purity, concentration and
quality of cpDNA was good enough for further PCR amplifi cation and genomic sequencing analysis.
Key words: Diospyros; chloroplast; cpDNA extraction; Percoll density-gradient centrifugation
傅建敏，等：柿属植物叶绿体 DNA提取方法优化26 第 12期
片中多糖、酚类等物质含量较高 [11]，叶绿体 DNA
提取较为困难，目前尚未见柿属植物叶绿体 DNA
提取的报道。
本研究利用 Pecoll密度梯度离心法，对君迁子、
油柿、浙江柿、金枣柿 4种柿属植物进行 cpDNA
提取方法优化，为后续叶绿体基因组研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
研究材料为柿属 4个种：君迁子、油柿、浙
江柿、金枣柿，于 5月中旬在中国林科院经济林
研究开发中心原阳资源圃，分别采集 4个样品枝
条顶端、健康无病虫害、刚展开不久的正常绿色
幼嫩叶片，置于冰盒内冷藏保鲜，带回实验室备用。
试验过程中每种样品都进行 3次生物学重复。
1.2 试验所用试剂
缓冲液 A：0.4 mol山梨醇；5 mmol EDTA；0.1
mol Hepes-NaOH(pH 7.5)；使用前加入 2.5% (w/v)
PEG-8000；2% (w/v) PVP-40；1% (w/v) BSA；
10 mmol 抗坏血酸。
缓冲液 B：0.25 mol蔗糖；10 mmol MOPS(pH
7.2)；
裂解缓冲液：100 mmol Tris-HCl，pH值 8.0；
50 mmol EDTA；100 mmol NaCl；1%SDS；使用
前加入 20 μg/mL RNase A。
Percoll分离液梯度设置及配置见表 1。
表 1 Percoll分离液配置
Table 1 The gradients of Percoll
Constituent
/%
Percoll
/mL
1mol Sucrose
/m L
1 mol MOPs
/mL
ddH2O
/mL
合计
/mL
60 60 25 1 14 100
30 30 25 10 44 100
18 18 25 1 56 100
1.3 方 法
1.3.1 叶绿体分离与纯化
叶绿体分离纯化所有步骤均需在 4 ℃ 条件下
进行，具体操作如下：
（1）取大约 50 g嫩叶，加入 400～ 500 mL
预冷缓冲液 A，组织研磨仪进行研磨；然后将匀
浆经 4层Mira滤布和 2层纱布过滤，滤液分装到
2个 500 mL的离心瓶中。
（2）滤液 1 000×g 离心 5 min，上清液转入
2 个干净的 500 mL 离心管中，18 000×g 离心
30 min，弃上清液留沉淀。
（3）每管中加入 500 mL缓冲液 B，用湿刷
子小心地将沉淀物重新悬浮于溶液中，1 000×g
离心 5 min。
（4）移液管将上清液转入 2个干净的离心管
中，18 000×g 离心 20 min以得到叶绿体粗提物。
（5）得到的叶绿体沉淀中加入 16 mL缓冲液
B，将液体分为 3份，完全混匀使其悬浮，然后分
别在 18%、30%、60% Percoll分离液中，进行超
高速密度梯度离心。
（6）40 000×g 离心 60 min后，即可在管中
液面中下部观察到叶绿体沉淀。
（7）将叶绿体层吸取出转移至 1.5 mL的离心
管中，加入 2体积的缓冲液 B，台式 离心机 4 ℃
条件下，30 000×g 离心 20 min，得到超纯叶绿体
颗粒。
（8）将叶绿体重新置于新的离心管中，加入
500 μL缓冲液 B，20,000×g 离心 20 min，完全去
除 Percoll分离液。
1.3.2 cpDNA提取与纯化
（1）将叶绿体颗粒重新悬浮于 0.2～ 0.5 mL
的缓冲液 B中，200 μg/mL DNase 和 10 mmol MgCl2
冰浴 1 h，以去除核 DNA污染。
（2）冰浴结束后，加入 9 mL缓冲液 B（含
10 mmol EDTA），18 000×g 离心 20 min，促使
叶绿体沉淀。
（3）裂解液重新悬浮颗粒，60 ℃ 水浴 30 min，
期间振荡数次。
（4）加入 1/3体积预冷的 5 mol乙酸钾，轻
轻混匀后冰浴 30 min，促使蛋白、脂类、S DS络
合物沉淀，冰浴期间不时将液体振荡混匀。
（5）20 000×g 离心 20 min，轻轻将上清液转
移至新的离心管中，20 000×g 再次离心 10 min，
去除残留悬浮碎片。
（6）取上清液至一干净离心管中，加入 1/2
体积异丙醇，1/20体积 5 mol 乙酸铵，轻轻颠倒混
匀后 -20 ℃ 保存过夜。
（7）20 000×g 离心 15 min，得 DNA沉淀，
70%乙醇洗涤 DNA沉淀 2次，弃乙醇，DNA风
干 5～ 10 min。
（8）200 μ L TE 缓 冲 液（50 mmol Tris、10
mmol EDTA， pH 8.0）溶解 DNA，转入Microfuge
离心管中，20 000×g 离心 10 min，去除未溶解的
细胞碎片，重新将上清液转入新的离心管中，4 ℃
保存备用。
27第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
1.3.3 cpDNA检测
利用 1.5%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度
计对所提取的 cpDNA浓度与纯度进行检测，并
利用通用引物对 trnH-trnK基因间隔区进行 PCR
扩增 [12]，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，其
中琼脂糖凝胶电泳上样量均为 3 μL。
2 结果与分析
2.1 叶绿体的分离与纯化
图 1显示 3种不同浓度 Percoll分离液对君迁
子叶绿体的分离效果，可以看出 60%的 Percoll分
离液分离效果最好，能够较好的将 叶绿体分离开。
图 2为君迁子叶绿体在 60%的 Percoll分离液中的
最终分离结果，其中A为脂质层，B为破碎细胞层，
C为叶绿体层，D为杂质层，各成分分层明显，分
层之间液体清晰透明，说明 60%Percoll分离液分
离效果好，能够将叶绿体很好的分离出来，得到
较纯的叶绿体颗粒。油柿、浙江柿和金枣柿叶绿
体也是在 60%的 Percoll分离液中分离效果最好。
2.2 cpDNA提取
琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 3，可以看
出利用上述提取方法，4个样品均可得到较纯
cpDNA，电泳条带清晰整齐，无杂带，无拖尾现象，
点样孔中无杂质，所提取的 DNA完整，纯度较高。
且对比Marker中标准条带的明亮程度（500 bp条
带为 100 ng/μL），可知四个样品 cpDNA浓度均
高于 100 ng/μL，其中君迁子和浙江柿 DNA浓度
略高于油柿和金枣柿。
1～ 3浓度分别为 18% 、30%、60%，且油柿、浙江柿和金枣柿的分离效
果同此。
图 1 君迁子叶绿体在不同浓度 Percoll 分离液中的分离效果
Fig.1 The results of chloroplast of D.lotus in different
Percoll gradients
A-脂质层，B-破碎细胞 层，C-叶绿体层，D-杂质层。
图 2 君迁子叶绿体在 60%的 Percoll分离液中的最终分离
效果
Fig.2 The fi nal isolation result of chloroplast of D.lotus in
60% Percoll
M-100 bp DNA Ladder；1-君迁子 cpDNA；2-油柿 cpDNA；3-浙江柿
cpDNA；4-金枣柿。
图 3 cpDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig.3 cpDNA determined with agarose gel electrophoresis
表 2为紫外分光光度计检测各样品 DNA浓
度及纯度，结果显示 4个样品所提取的 cpDNA的
A260/A280值在 1.90左右，说明 DNA中蛋白质等
大分子杂质少，纯度较高；A260/A230的值均大于
2.0，说明DNA中无多糖等杂质；4个样品相对比，
君迁子、浙江柿 DNA纯度比油柿、金枣柿要稍微
高些，但差别不大。浓度大小显示，浙江柿最高为
1 210.50 ng/μL，其次为君迁子 1 139.21 ng/μL，油柿
为 1 034.52 ng/μL，最低的为金枣柿 870.76 ng/μL，
结果与琼脂糖凝胶电泳结果基本一致，进一步说
明优化后的 DNA提取方法能够有效去除柿属植
物叶片中的多酚、多糖等物质，得到较高纯度的
cpDNA，并且此方法适用于柿属不同植物叶片叶
绿体 DNA提取，方法稳定可靠。
2.3 PCR扩增检测
图 4为 PCR扩增结果，可以看出 4个样品
经过 PCR扩增均能得到大小为 1 500 bp左右的单
一清晰目的产物，说明所提取的 DNA为叶绿体
傅建敏，等：柿属植物叶绿体 DNA提取方法优化28 第 12期
片柔软，表面密被绒毛；而金枣柿叶片质地脆硬，
表面光滑、有金属光泽，且叶脉明显主脉基部有
腺体；君迁子、浙江柿叶片形态特征较为相似，
叶片纸质柔软，表面绒毛少，不同的叶片结构，
特别是质地与绒毛多少，可能对提取效果有一定
影响。此外，根据已有报道，4种植物叶片中次
级代谢产物含量存在较大差异，金枣柿叶片中维
生素 C等次级代谢物含量较高 [18]，这可能影响了
DNA提取得率，具体影响因素还需进一步的试验
加以验证。
参考文献：
[1] 李树钢 . 中国植物志 (第 60卷第 1分册 ) [M]. 北京 : 北京科
学出版社 , 1987: 84.
[2] 孙 鹏 , 傅建敏 , 周道顺 , 等 . 柿属植物种子表型多样性及
其萌发与幼苗生长研究 [J]. 中南林业科技大学学报 , 2013,
33(11): 19-25.
[3] 李高潮 , 杨 勇 , 王仁梓 . 中国原产柿品种资源 [J]. 中国种业 ,
2006, (4): 52-53.
[4] 郭大龙 . 几种分子标记技术的建立及其在部分柿属植物亲缘
关系研究中的应用 [D]. 武汉 : 华中农业大学 , 2006.
[5] ZhaobinJing, Xiaofeng Ruan, Renzi Wang, el al. Genetic
diversity and relationships between and within persimmon
(Diospyros L.) wild species and cultivated varieties by SRAP
markers [J]. Plant Systematics and Evolution, 2013, 8(299):1485-
1492.
[6] 李宏韬 , 赵淑青 , 张 慧 . 叶绿体基因工程简介 [J]. 遗传 ,
2003, 25(4): 495-498.
[7] 张韵洁 , 李德铢 . 叶绿体系统发育基因组学的研究进展 [J].
植物分类与资源学报 , 2011, 33(4): 365-375.
[8] 郝海叶 , 张 洋 , 那冬晨 . 景天属植物叶绿体 DNA与核 DNA
分步提取方法研究 [J]. 安徽农业科学 , 2013, 41(25): 10230-
10231.
[9] 朱海林 , 刘秀明 , 江 莺 , 等 . 苜蓿叶绿体 DNA的提取及其
Rbcl基因片段的克隆 [J]. 安徽农业科学 , 2011, 39(22): 13306-
13308.
[10] 牟少华 , 郄光发 , 彭镇华 , 等 . 部分箬竹属植物的叶绿体
DNA分析 [J]. 安徽农业科学 , 2010, 38(23): 12374-12376.
[11] Weijian Bei, Linquan Zang, Jiao Guo, et al. Neuroprotective
effects of a standardized fl avonoid extract from Diospyros kaki
leaves[J]. Journal of ethnopharmacology, 2009, 126(1): 134-142.
[12] Demesure B, Sodzi N, Petit R J. A set of universal primers
for amplification of polymorphic non-coding regions of
mitochondrial and chloroplast DNA in plants [J]. Mol. Ecol.,
1995, 4: 129-131.
M-500 bp DNA Ladder；1-君迁子 cpDNA；2-油柿 cpDNA；3-浙江柿
cpDNA；4-金枣柿。
图 4 PCR扩增产物检测结果
Fig.4 PCR amplifi cation results
DNA，质量较好纯度较高，能够满足后续分子生
物学试验，电泳图中可以预测 4个样品叶绿体基
因组中 trnH-trnK片段长度大小略有不同，此区域
序列可能存在小片段的插入或缺失，具体情况可
通过后续基因组测序进行验证。
3 结论与讨论
高盐低 pH法是分离提取植物 cpDNA的有效
方法 [13-15]，但是与之相比，Percoll密度梯度离心
法具有快速、高效的优点 [16]。有效分离叶绿体颗
粒，避免细胞核、线粒体等污染，是叶绿体 DNA
提取的关键，本研究利用 60%浓度的 Percoll分离
液对叶绿体进行分离，同时结合密度梯度离心法，
能够有效去除细胞核、线粒体及细胞碎片等，得
到较纯叶绿体，方法简单易行。柿属植物叶片中
富含黄酮、单宁等多酚类物质 [17]，在 DNA提取过
程中容易氧化，对 DNA提取造成一定困难，本试
验提取缓冲液中加入 PVP、抗坏血酸等试剂，能
够有效防止多酚氧化，确保 DNA提取质量，检测
结果显示所提取的 DNA完整，杂质少纯度高，能
够满足后续 PCR扩增、基因组测序等分子生物学
试验，优化的提取方法操作简单，稳定可靠，适
用于不同柿属植物叶绿体 DNA的提取。
DNA提取过程中发现，君迁子、浙江柿提取
效果较油柿、金枣柿要好，深入分析发现 4种柿
属植物叶片形态特征具有很大差异，其中油柿叶
表 2 DNA紫外分光光度计检测结果
Table 2 The results of ultraviolet spectrophotometer
样品名 A260/A280 A260/A230 浓度 /(ng·μL－ 1)
君迁子 1.94 2.34 1 139.21
油柿 1.87 2.12 1 034.52
浙江柿 1.93 2.45 1 210.50
金枣柿 1.90 2.01 870.76
（下转第 33页）
33第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
综述 [J].安徽农业科学 , 2009, 37(16): 7746-7750.
[2] 汪 丽 ,崔 彤 .林分调查中蓄积量测定方法的探讨 [J]. 内蒙
古林业调查设计 , 2013,36(1):56-57.
[3] Widlowski J L, Pinty B, Gobron N, et al. Detection and
characterization of boreal coniferous forests from remote sensing
data[J]. Journal of GeoPhysical Research- Atmospheres, 2001,
106: 33405-33419.
[4] Trotter C M, Dymond J R, Goulding C J. Estimation of timber
volume in a coniferous Plantation forest using LANDSATTM[J].
International Journal of Remote Sensing,1997,18(10): 2209-2223.
[5] Dong J R, Kaufmann R K, Myneni R B, et al. Remote sensing
estimates of boreal and temperate forestwoody, biomass: carbon,
pools, sources, and sinks[J]. Remote Sensing of Environment,
2003, 84: 393-410.
[6] Makela H, Pekkarinen A. Estimation of forest stands volumes by
LANDSATTM imagery and stand-level fi eld inventory data[J].
Forest Eeology and Management, 2004,196:245-255.
[7] 洪奕丰 ,林 辉 ,严恩萍 ,等 .基于偏最小二乘法的平南县森林
蓄积量估测模型研究 [J]. 中南林业科技大学学报 ,2011, 31(7):
80-85.
[8] 杨永恬 .基于多源遥感数据的森林蓄积量估测方法研究 [D].
北京 : 中国林业科学研究院 ,2010.
[9] 涂云燕 ,彭道黎 . 基于 RS的森林蓄积量主成分回归估测 [J].
东北林业大学学报 ,2012,40(10):75-77.
[10] 余坤勇 ,林 芳 ,刘 健 ,等 .基于 RS的闽江流域马尾松林分
蓄积量估测模型研究 [J]. 福建林业科技 , 2006,33(1):16-23．
[11] 黄伟平 ,谭三清 ,张 贵 , 等 .估测森林蓄积量的遥感因子选
择研究 [J]. 中南林业科技大学学报 ,2010,30(4):112-115.
[12] 马瑞兰 ,李卫忠 . 基于 SPOT5遥感影像选择森林蓄积估测因
子——以火地塘教学实验林场为例 [J].东北林业大学学报 ,
2011, 39(7):111-112,137.
[13] James M, Latt in J, Douglas Carroll, et al. Analyzing Multivariate
Data[M]. United Sates of America: Brooks/ Cole, 2007: 45-46.
[14] 孙道德 . 基于残差平方和的线性模型选择简单方法及其相合
性研究 [J] . 数学杂志 , 2006, 26( 6) :642-646.
[15] 刘志华 , 常 禹 , 陈宏伟 . 基于遥感、地理信息系统和人工神
经网络的呼中林区森林蓄积量估测 [J] . 应用生态学报 , 2008,
19(9): 1891-1896.
[本文编校：文凤鸣 ]
[13] 崔彬彬 , 李 云 , 冯大领 , 等 . 杨树叶绿体分离及叶绿体 DNA
提取方法的研究 [J]. 保定师范专科学校学报 ,2006,19(2):25-27.
[14] 龙 兴 , 曾继吾 , 黄秉智 , 等 . 香蕉叶绿体分离及叶绿体 DNA
提取方法 [J]. 江西农业大学学报 , 2008, 30(3): 534-542.
[15] 崔 杰 , 李滨胜 , 杨 谦 . 甜菜叶绿体 DNA分离纯化方法 [J].
中国糖料 , 2005, (3):29-31.
[16] 郑建树 , 喻春明 , 陈 平 , 等 . 苎麻叶绿体 DNA的提取及分
析 [J]. 中国麻业科学 , 2012, 35(5): 239-252.
[17] 费学谦 , 周立红 , 龚榜初 . 不同柿种柿叶维生素 C和酚类物
质的差异 [J]. 林业科学研究 , 2004, (05): 616-622.
[18] 张嘉嘉 , 孙 鹏 , 周道顺 , 等 . 高效测定柿叶中维生素 C的
反相液相色谱法 [J]. 计算机与应用化学 , 2013, 30(11): 1379-
1382.
[本文编校：文凤鸣 ]
（上接第 28页）