全 文 ：利用 RAPD技术对桃属植物亲缘关系的分析
孙　萍1 ,李　唯2 ,姜寒玉1 ,姚建春1
(1.甘肃农业大学农学院 ,甘肃 兰州　730070;2.甘肃农业大学生命科学技术学院 ,甘肃 兰州　730070)
　　摘要:利用 RAPD技术对 44 个桃品种的 DNA 进行扩增 , 从200 条 10 bp 长短的随机引物中筛选出 22 条引物共扩
增出 256 条带 ,其中多态性带 169条 ,占 66 %, 通过聚类分析 ,将 44 个供试材料共分为 7 类:其中 ,冬熟独自聚为一类;
与大久保有关系的 7 个品种及早霞露 、春蕾 、日本红等共 14 个品种聚为一类;而北京 15 号 、重阳红 、红雪桃 、秋玉 、北京
七号与千年红聚为一类;早美与早露蟠聚为一类;筑波 84 与陇蜜 9 号聚为一类;垂直桃 、甘选 3 号聚为一类;其余 17 个
品种聚为一类。
　　关键词:桃;亲缘关系;RAPD
　　中图分类号:S 662. 1 , Q 943　　　　　文献标识码:A　　　　　　文章编号:1003-4315(2005)05-0586-05
Analy sis of genetic relationship among cutlivars of
Prunus persica using RAPD markers
SUN Ping1 , LI Wei2 , JIANG Han-yu1 , YAO Jian-chun1
(1. Co lleg e of Ag ronomy , Gansu Ag ricultural Univer sity , Gansu , Lanzhou 730070;2. Co llege of Life
Sciences and Techno lo gy , Gansu Agricultural Univer sity , Gansu , Lanzhou 730070 , China)
　　Abstract:The genetic rela tionship of 44 cul tivars of peach w as analy zed by using RAPD markers. 22
prime rs w ere screened out f rom 200 arbi trary 10bp-primers , amplified 256 DNA bands ,169 o f w hich were
po lymo rphic(66 %). 44 cul tivars w ere separated into 7 g roups by using cluste r analy sis. Dong shu w as
clustered a g roup by itself;14 cultiv ars induding Zao x ialu ,Chunlei ,Ri Benhong etc w ere clustered toge th-
er;Bei jing No. 15 , Chong yanghong , Hong xuetao , Qiuyu , Bei jing No. 7 and Qian Nianhong we re in one
group;Zaomei and Zao Lupan w ere clustered to gether;Zhubo and Longm i No. 9 clustered togethe r;chui
Zhi tao and Ganxu No. 3 clustered together;the o ther 17 cul tivars w ere in one g roup.
　　Key words:peach;genetic relat ionship;RAPD
　　桃〔Prunus persica(L. )Ba tsch〕起源于我国西部地区 ,经过长期的自然选择和人工驯化栽培 ,现已具
有多种品种 ,具有丰富的种质资源 。在桃的资源分类方面 ,过去主要从形态学[ 1 ～ 3] ,细胞学[ 4] ,孢粉学[ 5 ～ 7] ,
同工酶[ 8 ～ 10]等方面进行研究 ,对桃属植物种间的亲缘关系进行了一定分析 ,但是 ,这些分类方法不仅缺乏客
观性及准确性 ,而且在分类方法上也存在着很多制约点。目前 RAPD技术在分类研究 、品种鉴定 、系谱分
析 、遗传图谱构建 、基因标记等方面得到了广泛应用[ 13 ～ 17] 。在桃的研究方面 ,Warburton M L 等[ 18] 用
RAPD技术分析了 136个桃品种的遗传多样性 ,认为美国桃的种质资源有限 ,遗传背景比较单一 ,而亚洲桃
作者简介:孙　萍(1979- ),女 ,甘肃兰州人 ,在读硕士研究生 ,研究方向为作物种质改良及组织培养。
资助基金:甘肃省科技厅专项(编号:2GS035 - A41 - 001 - 05)
通讯作者:李　唯(1955- ),教授 ,博士生导师 ,主要从事植物生理及发育生物学研究。
收稿日期:2005- 01- 13
2005 年 10月
第 5 期 586～ 590
甘　肃　农　业　大　学　学　报
JOURNA L OF GANSU AGRICU LT URAL UNIVERSITY
第 4 0 卷
双 月 刊
DOI牶牨牥牣牨牫牬牫牪牤j牣cnki牣jgsau牣牪牥牥牭牣牥牭牣牥牥牫
种质资源则比较多样 ,而在亚洲 ,印度桃和日本桃都是先后从中国引进的 ,因此对中国桃资源及其亲缘关系
的研究就显得非常重要。
　　甘肃是中国桃的主要生产基地之一 ,同时也是桃的起源地之一 。据 1999年统计 ,全省就有 34个县区
种植桃 ,其中主要分布在秦安 、皋兰 、北道 、西固 、安宁 、秦城 、环县等地 。本研究选取的试材来自甘肃省的主
产桃区———安宁区 ,共计 44个品种 ,占甘肃省主栽品种的大部分 ,具有一定的代表性。通过 RAPD标记技
术对不同品种的桃的多态性进行研究 ,可在分子水平上来探讨桃的种质亲缘关系 ,验证目前甘肃栽培广泛
的桃属的分类地位 ,推测其进化历程 ,以期为科研生产提供理论依据 。
1　材料与方法
1. 1　材料
　　供试材料均来自甘肃省兰州市安宁区兴隆苗圃(表 1)。
表 1　供试材料
Tab 1　Experiment materials
编号 品种 类型 原产地 编号 品种 类型 原产地
1 秋玉 毛桃 中国 23 91—2 油桃 美国
2 千年红 油桃 中国 24 雨花露 水蜜桃 中国
3 早美 毛桃 中国 25 甘选 3 号 毛桃 甘肃
4 北京 7 号 毛桃 北京 26 仓方早生 毛桃 日本
5 重阳红 毛桃 中国 27 锦秀 黄肉桃 上海
6 冬熟 毛桃 育成品种 28 晚蜜 水蜜桃 野种
7 春蕾 水蜜桃 上海 29 短枝早宝 油桃 中国
8 华光 油桃 中国 30 垂直桃 观赏桃 中国
9 艳光 油桃 中国 31 早油 118 油桃 甘肃
10 早乙女 毛桃 日本 32 早红宝石 油桃 中国
11 筑波 84 毛桃 日本 33 早凤王 毛桃 中国
12 早霞露 毛桃 中国 34 莱山蜜 水蜜桃 山东
13 早露蟠 蟠桃 浙江 35 秋香 水蜜桃 中国
14 白凤 毛桃 中国 36 北京 15 号 毛桃 北京
15 陇蜜 9 号 毛桃 日本 37 日本红 毛桃 日本
16 中国沙红 毛桃 中国 38 红甘露 毛桃 中国
17 大久保 水蜜桃 日本 39 中华寿桃 毛桃 中国
18 新红早 蟠桃 育成品种 40 熊岳 毛桃 辽宁
19 瑞蟠 4 号 蟠桃 育成品种 41 河南水蜜 水蜜桃 河南
20 布木早生 毛桃 日本 42 马红桃 红肉桃 中国
21 日金油桃 油桃 中国 43 早油蟠 蟠桃 中国
22 红雪桃 毛桃 中国 44 哈太雷 油桃 美国
1. 2　方法
1. 2. 1　DNA的提取　DNA提取方法根据分步离心法 ,结合 SDS 法 ,参照张开春等的改良 CTAB法[ 20] 进
行 ,其中主要改进了提取缓冲液的成分 。它们分别是:提取缓冲液 Ⅰ , 100 mmo l /L Tris-HCl(pH 8. 0),50
mmo l /L EDTA(pH 8. 0),500 mmo l /L NaCl ,10 mmol /L β -巯基乙醇 ,3 %SDS ,30 g /L PVP ,0. 53 %抗
坏血酸;提取缓冲液 Ⅱ ,62 mg /mL 葡萄糖 ,2 mg /mL PVP , 80 mmol /L β -巯基乙醇。其操作方法主要根据
分步离心法。本方法提取的 DNA 纯度高 ,保存效果好。
1. 2. 2　随机引物的筛选　利用 200个 Sangon公司的 10碱基随机引物 ,用秋玉和千年红 DNA 作为模板 ,
在相同条件下进行 PCR后 ,选择了品种间存在多态性 ,扩增效果良好的 22个引物。这些引物的编号及碱
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基顺序如表 2所示。
1. 2. 3　PCR扩增及电泳分析　采用25μL 反应体系 ,其中含 10×PCR缓冲液 ,2 μL;MgCl2(25 mmol /L),
2μL;dN TP(10 mmol /L)2μL;Taq酶 ,1U;引物(6. 6 ng /μL)1 μL ;DNA(20 ng /μL)2 μL。反应液混匀后 ,
表 2　 RAPD分析中选用的引物
Tab 2　Primes w ith a rbitra ry sequence in RAPD analy sis
编号 核苷酸序列 编号 核苷酸序列 编号 核苷酸序列
S21 CAGGCCCTTC S51 AGCGCCAT TG S366 CACC TTTCCC
S23 AGTCAGCCAC S60 ACCCGGTCAC S441 GGCACGTAAG
S24 AATCGGGC TG S65 GATGACCGCC S452 CAGTGC TGTG
S27 GAAACGGGTG S125 CCGAATTCCC S1028 AAGCCCCCCA
S29 GGGTAACGCC S126 GGGAATTCGG S1041 ACGGGTCAGA
S33 CAGCACCCAC S133 GGCTGCAGAA S1053 CAGCCGTTCC
S34 TC TGTGCTGG S341 CCCGGCA TAA S1059 ACAGTGGCC T
S43 GTCGCCGTCA
在其上加一薄层矿物油。PCR仪为 MJ Research PTC-200 DNA Engine。
　　PCR扩增程序:94 ℃预变性 3 min ,93 ℃30s ,36 ℃35 s ,72 ℃ 70 s , 2个循环;94 ℃45 s ,37 ℃55 s ,
72 ℃85 s ,42个 循环 ,72 ℃10 min。
　　扩增完毕 ,在 1. 4 %的琼脂糖凝胶(BBI产)上电泳 ,以λHindⅢDNA 为 Marker ,用 EB 染色后 ,在凝胶
系统成像仪上照相。
1. 2. 4　数据记录　用λHindⅢDNA 作Marker ,确定扩增产物的位置 ,将 PCR扩增中出现的清晰的带记为
1 ,不出现的记为 0 ,最后用 SPSS 方法聚类 。
2　结果与分析
2. 1　44个桃品种的 RAPD标记多态性
　　从 200个随机引物中共筛选出 22个引物(见表 2),扩增出 256条 DNA 带 ,多态性带 169条 ,占 66 %。
不同引物扩增出的 DNA 条带在 3 ～ 13条之间 ,分子量大小在 250 ～ 3 500 bp 之间。S23 、S126 、S133所扩增的
图谱分别见图 1 、图 2 、图 3。
图 1　引物 S23扩增的 RAPD图谱
Fig 1　Products applified on primer S23 by RAPD
注:　上面的数字与表 1中 44个桃品种的编号相同
图 2　引物 S126扩增的 RAPD图谱
F ig 2　P roducts applified on primer S126 by RAPD
注:　上面的数字与表 1中 44个桃品种的编号相同
2. 2　44个桃品种的聚类分析
　　用 SPSS法建立 44个品种类型的遗传关系树状图(图 4),在 11距离值下将 44个品种类型分为 7类:
其中 ,冬熟独自聚为一类;与大久保有关系的 7个品种及早霞露 、春蕾 、日本红等共 14 个品种聚为一类;而
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北京 15号 、重阳红 、红雪桃 、秋玉 、北京 7号与千年红聚为一类;早美与早露蟠聚为一类 ,筑波 84与陇蜜 9
号聚为一类;垂直桃 、甘选 3号聚为一类;其余 17个品种聚为一类。
图 3　引物 S133扩增的 RAPD图谱
Fig 3　Products applified on primer S133 RAPD
注:上面的数字与表 1中 44个桃品种的编号相同
图 4　44 个桃品种的 RAPD 聚类分析树状图
Fig 4　Dendrogr am of cluster analy sis ba sed on
RAPD da ta for 44 peaches
3　讨论
　　1)经过 RAPD分析 ,可得到品种间的差异
带 ,进而分析桃种质间的亲缘关系 。本研究采用
了分步离心法来提取 DNA ,主要分两步 ,首先除
去大量杂质 ,再沉淀 DNA ,悬浮后抽提蛋白质等
杂质 。在提取缓冲液中加入 PVP 、V c等物质 ,
有效地防止了酚类物质的氧化造成 DNA 提取
的困难。
　　2)聚类结果表明 ,春蕾与早霞露的遗传关系较近 ,这与它们拥有相同的父本一致 ,同时可看到布木早生
与仓方早生及日金油桃和日本红也过早地聚在一起 ,说明从日本引进的品种较为单一 ,同时可看出 ,垂直桃
与甘选 3号关系较近 ,其中垂直桃是观赏桃 ,而甘选 3号是甘肃桃中的一种硬肉桃 ,说明观赏桃与硬肉桃的
关系较近 ,它们之间可能存在一个共同的平行进化关系 ,但由于本次试验所选的观赏桃材料偏少 ,此结果还
有待进一步分析 。再者 ,秋玉与北京 7号也早早聚在一起 ,这与它们父本母本相同一致 ,同时与它们在形态
学上的分类也一致[ 3] 。
　　3)冬熟是我省引进的改良品种 ,是一种极晚熟品种 ,从图中可知 ,它与其它品种的遗传关系较远 ,可独
自分为一类 ,这个新品种可能与毛桃或蟠桃的亲缘关系相近 ,可作为普通桃的一个生态分支 ,但鉴于其取样
的数量和代表性 ,其分类地位有待于进一步分析。
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