全 文 ：园　艺　学　报　2003 , 30 (4):394 ～ 398
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:2002-11-19;修回日期:2003-03-07
基金项目:国家自然科学基金项目 (39970081)
＊通讯作者 , 邓秀新 (dxxwwlj@public.wh.hb.cn), 胡春根 (chungen@mail.hzau.edu.cn)
致谢:中国农业科学院柑橘研究所陈竹生研究员为本研究提供了大部分的材料 , 在材料的收集过程中还得到李喜庆 、 江东及湖
南省农业科学院园艺所卜范文等先生的帮助 , 谨致谢意。
枳属 36份特异种质的 AFLP指纹图谱构建与分析
庞晓明　邓秀新＊　胡春根＊
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 国家农作物育种中心 , 武汉 430070)
摘　要:从 40 个 PstI/MseI 酶切的AFLP引物对中筛选出多态性高的 7 个 , 对 36 份枳属特异种质进行
了指纹分析。7 个引物对共获得 539 条带 , 其中 146条带具有多态性。各种质材料之间的遗传相似性在 0.23
～ 0.98 之间 , 只需结合其中的 3 个引物对即可区分所有的材料。根据 7 个 AFLP 引物对所得谱带的 UPGMA
聚类分析表明 , 聚类结果与地理来源没有明显的联系 , 这可能正反映了近时间内地区之间枳资源的频繁交
流。
关键词:枳;DNA指纹;AFLP;银染
中图分类号:S 666　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2003)04-0394-05
枳属包括两个种———枳 (Poncirus trifoliate Raf.)、富民枳 (P.polyandra S.Q.Ding et al.)和 1
个变种 ———飞龙枳 (P .trifolita var.monstrosa Swingle)〔1 ,2〕。枳原产我国 , 极耐寒 , 抗速衰病 、 脚腐
病 、 流胶病 , 耐柑橘线虫 , 被广泛用作柑橘的砧木 , 也是柑橘植物抗性基因的重要来源 。各国的研究
者选出了不少优良的枳选系 , 我国已经鉴定出大叶大花 、 大叶小花 、小叶大花 、小叶小花 、 多倍体枳
类型〔3～ 5〕 , 日本也鉴定出大叶系 、中叶系 、小叶系 、曲针系 、单胚系及四倍体枳等多种类型〔5 ,6〕。
枳不同选系在抗病性〔7〕和抗旱性〔8〕上差异明显 , 嫁接在不同枳选系上的柑橘植物在生长结果特性
上也表现不一〔9 ,10〕 , 这就要求特定的柑橘种类和品种采用特定的枳选系作砧木。然而枳选系确切的形
态划分标准较难确立 。方德秋等分析了我国 6种枳选系的 7 种同工酶 14个基因位点上的基因型 , 但
仅在GOT-1 , GOT-2和 POX 等 3个位点上有多态性 , 不能将 6 种枳选系区分开来〔11〕。 RFLP〔12 ,13〕、
SSR 、 RAPD〔13〕都难以区分不同的枳选系。 ISSR标记虽然比上述方法更有效但也不能区分所有的枳选
系〔9〕 。AFLP〔14〕是一种相对较新的标记 , 以其高效率和较高的稳定性 , 被用于众多植物的指纹图谱构
建 , 如苹果〔15〕、 葡萄〔16〕等。本研究利用 AFLP 技术构建了 36份枳属种质的指纹图谱 , 以期提高其种
质鉴定效率 , 为其进一步收集和利用提供新的工具。
1　材料与方法
供试材料包括枳属的两个种———枳和富民枳及变种———飞龙枳 , 共 36份种质 (表 1)。对 1 ～ 32
号种质 , 采集单株的幼嫩叶片 3 ～ 4 g 用常规的 SDS 方法提取总 DNA〔17〕 , 对 33 ～ 36号种质取 7 cm左
右高的试管播种幼苗用微量法提取总 DNA〔18〕 。所有的接头和引物由生工生物工程公司 (中国上海)
合成 , 引物和接头的序列见表 2。
酶切:反应总体积为 20 μL , 其中包括:DNA 250 ng , Pst I和 MseI (MBI)各 2.5 U , 0.5×反应
Buffer (缓冲液)。37℃温浴 3 h , 然后 65℃温浴 2.5 h。
连接:酶切反应后 , 每个DNA样品加入20 μL连接混合液 , 包括复性的 Pst I双链接头 (5 μmol/L)
和MseI双链接头 (50 μmol/L)各 1 μL , T4DNA连接酶 0.4 U (Promega , 美国), 1×连接 Buffer 。常温
过夜 , 连接产物稀释 10倍 , -20℃保存备用。
预扩增:20 μL的扩增体系包括:5 μL连接稀释液 , P00和 M00各 50 ng , 1×PCR Buffer , Taq酶
(MBI)0.4 U , dNTP (2 mmol/L)1 μL。在 PTC-200 (MJ RESEARCH 公司 , 美国)PCR仪上扩增:
94℃30 s , 56℃30 s , 72℃60 s , 共 20个循环。预扩增产物稀释 50倍 , -20℃保存备用 。
表 1 　枳属特异种质
Table 1　Poncirus accessions used in this study
编号
Code
名 称
Sample name
来　源
Possible origin
采样地点＊
Sampling place
1 旺苍大叶枳 四川 Sichuan CRICAAS
Wangcang large leaf
2 84-74 未知Unknown CRICAAS
3 84-83 未知Unknown CRICAAS
4 84-75 未知Unknown CRICAAS
5 84-80 未知Unknown CRICAAS
6 84-86 未知Unknown CRICAAS
7 84-79 湖北Hubei CRICAAS
8 84-77 未知Unknown CRICAAS
9 东湖二号枳 Donghu 2 湖北Hubei CRICAAS
10 莒南枳 Junan 山东 Shandong CRICAAS
11 84-72 未知Unknown CRICAAS
12 泸溪枳 Luxi 湖南Hunan CRICAAS
13 穿城一号枳 Chuancheng 1 未知Unknown CRICAAS
14 厚皮枳 Thick-skin 福建Fujian CRICAAS
15 东海枳 Donghai 江苏 Jiangsu CRICAAS
16 皱皮枳 Crinkle-skin 江苏 Jiangsu CRICAAS
17 日本枳 Japanese 未知Unknown CRICAAS
18 5号小花枳 Small f lower 5 未知Unknown CRICAAS
19 薄皮枳 Thin-skin 福建Fujian CRICAAS
20 84-81 未知Unknown CRICAAS
21 唐河枳 Tanghe 河南Henan CRICAAS
编号
Code
名 称
Sample name
来　源
Possible origin
采样地点＊
Sampling place
22 灌云一号枳Guanyun 1 江苏 Jiangsu CRICAAS
23 襄阳枳 Xiangyang 湖北Hubei CRICAAS
24 85-1 未知Unknown CRICAAS
25 飞龙枳 Fly dragon 墨西哥 Mexican CRICAAS
26 澳洲枳Australian 澳大利亚 Aust ralia 湖南永州市
Yongzhou , Hunan
27 大叶枳 Large leaf 湖南省 Hunan IHRAASH
28 畸形枳Abnormal 湖南省 Hunan IHRAASH
29 矮化枳 Dwarf 湖北省 Hubei CRIHAU
30 小叶枳 Little leaf 湖南省 Hunan IHRAASH
31 早实枳 Early-bearing 湖北宜昌 湖北宜昌市
Yichang , Hubei Yichang , Hubei
32 富民枳 Fumin 云南省富民县 云南昆明市
Fumin , Yunnan Kunming , Yunnan
33 English dwarf 美国 the US 美国佛罗里达
Florida , the US
34 Rubidoux 美国 the US 美国佛罗里达
Florida , the US
35 Towne 美国 the US 美国佛罗里达
Florida , the US
36 Yamaguchi 美国 the US 美国佛罗里达
Florida , the US
　　＊CRICAAS.中国农科院柑橘研究所Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science (Chongqing);IHRAASH.湖南省
农科院园艺所 Institute of Horticultural Research of the Academy of Agricultural Science of Hunan (Changsha);CRIHAU.华中农业大学柑橘研究
所 Citrus Research Institute of Huazhong Agrucultural University (Wuhan), 编号下图表同。
表 2　AFLP 分析所用的接头及引物序列
Table 2　Sequences of adapters and primers used for AFLP analysis
代 号 Code 说 明 Function 序 列 Sequence
Pad1 PstI 接头 1 Pst I adapter 1 5′-CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA-3′
Pad2 PstI 接头 2 Pst I adapter 2 5′-GTT ACG CAG TCT AC-3′
Mad1 MseI 接头 1 MseI adapter 1 5′-GAC GAT GAG TCC TGA G-3′
Mad2 MseI 接头 2 MseI adapter 2 5′-TAC TCA GGA CTC AT-3′
P00 PstI 预扩增引物Preamplifi cation primer 5′-CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA-3′
M00 MseI 预扩增引物Preamplification primer 5′-GAC GAT GAG TCC TGA GTAA C-3′
P01 选择性扩增引物 Selective primer 5′-GAC TGC GTA CA TGCAG CAA-3′
P02 选择性扩增引物 Selective primer 5′-GAC TGC GTA CA TGCAG GTT-3′
P03 选择性扩增引物 Selective primer 5′-GAC TGC GTA CA TGCAG AGT-3′
P04 选择性扩增引物 Selective primer 5′-GAC TGC GTA CA TGCAG CAC-3′
M01 选择性扩增引物 Selective primer 5′-GAT GAG TCC TGA GTAA CAG-3′
M02 选择性扩增引物 Selective primer 5′-GAT GAG TCC TGA GTAA CCA-3′
M03 选择性扩增引物 Selective primer 5′-GAT GAG TCC TGA GTAA CAT-3′
M04 选择性扩增引物 Selective primer 5′-GAT GAG TCC TGA GTAA CGA-3′
3954 期　　　　　　　　　　庞晓明等:枳属 36 份特异种质的 AFLP指纹图谱构建与分析　　　　　　　　　　　
　　选择性扩增:20μL 的扩增体系包括:5 μL 预扩增稀释液 , Pst I 引物 30 ng , MseI 引物 60 ng ,
dNTP (2 mmol/L)2 μL , Taq酶 (MBI)1.0 U , 1×PCR Buffer。PCR扩增程序:94℃ 30 s , 65℃30 s ,
(每循环降低 0.7℃), 72℃60 s , 12个循环后变为:94℃30 s , 56℃30 s , 72℃60 s , 23个循环 。
电泳:扩增反应结束后 , 取 4μL扩增产物在 1.5%的琼脂糖胶上检测 20 ～ 30 min , 如果产物为一
条横跨溴酚蓝的弥散 (Smear)则继续下一步试验。在 6.0%的变性聚丙烯酰胺凝胶 (含 0.5 倍的
TBE)上分离 , 恒定功率 60 W , 电泳 2 h左右 (二甲苯氢指示剂距离凝胶底部约 1/3处)。
银染:电泳结束后 , 分开两块玻璃板 , 将带胶的玻璃板放入 10%的冰乙酸固定液中 , 轻轻摇动
至指示剂颜色褪去。用超纯水冲洗胶板 2次 , 每次 3 min。将冲洗后的胶板放入染色液 (2 L 水中加入
2.0 g硝酸银 、 3.0 mL 37%甲醛)中 , 轻轻摇动 32 min。将染色后的胶板放入超纯水中漂洗 5 ～ 10 s
后立即转入装有1 L显影液 (2 L水中加入60.0 g 的无水碳酸钠 , 用前加 3.0 mL 37%的甲醛和400 μL
浓度为 10 mg/mL 的硫代硫酸钠)的塑料盒中 , 轻轻摇动至第 1 条带纹出现 , 更换另 1 L 显影液继续
显影至带纹清晰 。放入前述固定液中 , 轻轻摇动约 2 min。用超纯水冲洗 2次 , 即可室温下自然干燥。
拍照或扫描成电子图片保存。
清晰且易于辨认的多态性带记录为 “1” , 空缺时记录为 “0” 。以 NTSYS-pc 2.10e 软件进行分析。
计算各种质之间的 Jaccard相似系数 S=a/ (a+b+c), a 为两份种质共有带数 , b表示其中一份种质
特有带数目 , c为另一份种质特有带的数目。用 UPGMA方法进行聚类 。
2　结果与分析
2.1　AFLP标记的多态性
为了提高试验的效率 , 以东湖 2号 、 莒南
枳 、 小叶枳 、富民枳和峡江枳 (不是枳选系未纳
入指纹图谱分析)等 5份差异较大的枳属种质为
模板 , 筛选了 40个 PstI/MseI引物对。从中选取
了7个谱带清晰 、带型分布均匀并且多态性高的
引物对。7个引物对扩增得 539条带 , 平均每个
引物对扩增出 77条带。其中 146条为多态性带 ,
平均多态性比率为 27.09%。不同的引物对多态
性差别较大 , 多态性最高的为 P04M01 , 高达
41.67%, 最低的 P01M01多态性为 16.13% (表
3)。
表 3　AFLP引物对的多态性比较
Table 3　Polymorphism of different AFLP primes combinations
引物组合
Primer
combination
总带数目
Total
bands
多态性带数目
Polymorphic
bands
多态性比例
Polymorphic
rate (%)
P01M01 93 15 16.13
P04M04 62 17 27.42
P02M04 77 23 29.87
P02M02 90 20 22.22
P03M04 90 22 24.44
P04M01 60 25 41.67
P04M03 67 24 35.82
总计 Sum 539 146 —
平均 Mean 77.0 20.9 27.09
2.2　指纹图谱构建
所分析引物对中 , P04/M03能区分其中的 25份种质 , P04M01能区分其中的 23份种质 , P03M04
能区分其中的 15份种质 。东海枳和皱皮枳只有 P03M04能区分。P04/M01结合 P03/M04则可区分 34
份种质 , 仅东海枳和 Yamaguchi不能区分。P04/M01和 P03/M04再结合 P01M01或 P04/M03则 36份种
质都有独特的带型 , 可作为各份种质鉴定的依据 。图 1是引物对 P01M01的扩增带型。
2.3　聚类分析
利用以146条多态性 AFLP 带所得的遗传相似性矩阵 , 经过聚类分析构建供试材料的亲缘关系树
状图 (图 2), 其中 , 东海枳和皱皮枳相似系数达 0.98 , 说明了它们之间的遗传差异很小 , 这与二者
的形态差异也甚微是相符的 。富民枳和 84-79枳的相似系数为 0.23 , 其他种质之间的相似系数介于
0.23和 0.98之间 。
相似系数和聚类结果表明 , 富民枳与各枳选系之间相似性很低 。另外 , 富民枳具有 13条特异性
的AFLP 带 , 表明了其在枳属植物中地位的特殊性 , 与形态学和其他分子方法得出的结论〔1 , 19 ,20〕一致 。
396　　　　　　　　　　　　　　　　　园　　艺　　学　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　30 卷
小叶枳 、 84-79枳和畸形枳与其他种质的相似性也较低。其他种质可为分两大类 , 第一大类包括旺苍
大叶枳 、 84-74枳 、东湖二号枳 、 84-72枳 、 矮化枳 、 84-83枳 、 84-80枳 、 84-75枳 、 5号小花枳 、 84-
81枳 、 大叶枳等 11份枳选系 , 第二大类则包括其余的 21份枳选系。各大类往下还可划分为若干小
类 , 但由于其它资料的缺乏 , 我们不清楚这些种质聚成一类的意义 , 因此亟待对这些种质进行进一步
的形态 、 生理生化和农艺性状等方面的鉴定 。澳洲枳和日本枳分别是从澳大利亚和日本引入的 , 它们
与东海枳的相似性都较大 , 可能表明这两份选系是在更远的时候从中国的江苏省传播过去的 。
另外从聚类图上还可以看出 , 各种质的聚类结果与地理来源没有明显的联系 , 来自同一地区的枳
属种质并没有首先聚在一起 , 这可能反映了近时间内地区之间枳属资源的频繁交流 。
图 1　36份枳属种质用 AFLP引物对 PO1M01扩增的带型
从左到右分别为样品 1～ 36号
Fig.1　Part of AFLP profiles of 36 Poncirus accessions obtained
by primer pair P01M01
The lane stands for sample 1 to sample 36 from left to right
图 2　基于 AFLP数据的 36份枳属种质的 UPGMA 聚类图
Fig.2　Dendrogram illustrating the genetic relationships among 36
Poncirus accessions based on UPGMA cluster analysis of AFLP data
3　讨论
本研究建立了一个成熟的枳属种质的AFLP标记分析系统 , 并用AFLP 标记技术区分了全部的 36
份枳属种质 , 其中包括了我国几个大型柑橘资源圃所有的枳属材料 (枳属杂种除外)。我们的研究发
现14份枳属材料的形态数据和AFLP数据存在着较高的相关性 , 证明了 AFLP 标记用于枳属种质鉴定
的可行性〔21〕 。但是 , 仅有分子数据还是远远不够的 , 分子鉴定是为了对资源进行更深入的评价 , 分
子鉴定后更重要的是继续进行形态学 、 生理生化和农艺性状等方面的鉴定 。
田间资源圃保存一份材料花费较大 , 因此 , 如何鉴定出重复的材料 , 提高资源保存的效率是今后
一个重要的课题 。理论上说来 , 除非完全测序 , 否则难以确证两份材料在遗传上是相同的〔22〕 。但是
分析一定数量的标记后 , 从统计上可以推断两份材料是否重复。例如在稻属种质资源鉴定上 , Virk
等〔22〕提出 , 如果一对被怀疑的样品经过 100个 RAPD标记的检测还未被区分开来 , 那么就可以确定它
们是重复样品。在枳资源研究中 , 我们也需要类似的研究来确立鉴定重复材料的标准。
3974 期　　　　　　　　　　庞晓明等:枳属 36 份特异种质的 AFLP指纹图谱构建与分析　　　　　　　　　　　
参考文献:
1 　丁素琴 , 张显努 , 暴卓然 , 等.中国枳属一新种.云南植物研究 , 1984 , 6 (3):292～ 293
2 　Davies F S , Albrigo L G.Citrus.London:CAB International , 1994.12～ 45
3 　重庆柑橘所砧木组.枳的调查简报.柑橘科技通讯, 1976 , 3:36～ 37
4 　陈全友 , 宋乃晶.灌云 1号四倍体枳的发现.园艺学报 , 1989 , 16(1):78～ 80
5 　郭天池 , 陈全友 , 叶荫民 , 等.枳 〔Poncirus trifoliata (L.)Raf.〕 的种质资源.中国南方果树 , 1996 , 25 (3):8～ 10
6 　Yoshida T , Kawase K , Nesumi H.Inheritance of thornlessness in trifoliate orange 〔Poncirus trifoliata (L.)Raf.〕.J.Jpn.Soc.Hort.Sci.,
1999 , 68 (6):1104～ 1110
7 　赵学源 , 何新华.八种来源不同的枳对黄环病的反应.中国南方果树 , 1997, 26 (4):9
8 　贾敬贤.中国果树种质资源目录 第二辑.北京:中国农业出版社 , 1998.117～ 121
9 　肖桂山 , 杨世杰.枳砧柑橘类不同嫁接组合亲和性研究初报.北京农业大学学报 , 1992 , 18(2):211～ 216
10　石健泉 , 沈丽娟 , 蒋运宁 , 等.沙田柚在不同砧木上的早期表现.中国南方果树 , 1998, 27 (3):3～ 6
11　方德秋 , 章文才 , 肖顺元.应用同工酶进行柑橘分类和进化研究.植物分类学报 , 1993, 31 (4):329～ 352
12　Komatsu A , Akihama T , Hidaka T , et al.Identifi cation of Poncirus strains by DNA fingerprinting.In:Hayashi T , Omura M , Scott N S ed.
Techniques on gene diagnosis and breeding in fruit trees.Okitsu , Japan:Fruit Trees Research Station , 1993.88～ 95
13　Fang D Q , Roose M L , Krueger R R , et al.Fingerprinting Trifoliate Orange germplasm accessions with isozymes , RFLPs , and inter-simple
sequence repeat markers.Theor.Appl.Genet., 1997 , 95:211～ 219
14　Vos P , Hogers R , Bleeker M , et al.A new technique for DNA f ingerprinting.Nucleic Acids Res., 1995 , 23(21):4407～ 4414
15　祝　军 , 王　涛 , 赵玉军 , 等.应用AFLP 分子标记鉴定苹果品种.园艺学报 , 2000, 27 (2):102～ 106
16　Cervera M T , Cabezas J A , Sancha J C , et al.Application of AFLPs to the characterization of grapevine Vitis vinifera L.genetic resources.A
case study with accessions from Rioja (Spain).Theor.Appl.Genet., 1998, 97:1～ 2 , 51～ 59
17　程运江 , 伊华林 , 庞晓明 , 等.几种木本果树 DNA的有效提取.华中农业大学学报 , 2001 , 20 (5):481～ 483
18　史永忠 , 郭文武 , 邓秀新.柑橘 RAPD 技术体系建立与体细胞杂种鉴定.园艺学报 , 1998 , 25 (2):105～ 110
19　庞晓明 , 胡春根 , 邓秀新.用 SSR标记研究柑橘属及其近缘属植物的亲缘关系.遗传学报 , 2003, 30 (1):81～ 87
20　Fang D Q.Intra and intergeneric relationships of Poncirus polyandra:Investigation by leaf i sozymes.J.Wuhan Bot Res., 1993 , 11 (1):34～
40
21　庞晓明.用分子标记研究柑橘属及近缘属植物的亲缘关系和枳的遗传多样性:〔博士学位论文〕.武汉:华中农业大学 , 2002.90
22　Virk P S , Newbury H J , Jackson M T , et al.The identification of duplicate accessions within a rice germplasm col lection using RAPD analysis ,
Theor.Appl.Genet., 1995 , 90:1049～ 1055
Construction of AFLP Fingerprint of 36 Poncirus accessions
Pang Xiaoming , Deng Xiuxin , and Hu Chungen
(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , China)
Abstract:AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)analysis system was established on Poncirus
accessions.Seven primer pairs with high polymorphism have been screened from 40 primer pairs.The screened
subset of primer pairs produced 539 bands , 146 of which were polymorphic.Genetic similarity among 36
accessions ranged from 0.23 to 0.78.All the 36 accessions could be clearly differentiated based on the bands
obtained from three of the seven primer pairs.This provided a first example to distinguish all tested Poncirus
accessions.The genetic distance was calculated and a dendrogram was constructed based on AFLP data of 7 primer
pairs.The separation of Poncirus accessions did not correspond to their geographical distribution , which may result
from the frequent exchange of seeds of Poncirus plants among different regions recently.
Key words:Trifoliate orange;AFLP;DNA fingerprinting;Silver staining
398　　　　　　　　　　　　　　　　　园　　艺　　学　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　30 卷