全 文 ：·生物技术· 北方园艺 2010(13):116～ 119
第一作者简介:尹长虹(1988-),女 ,硕士, 研究方向为观赏植物种
质资源。 E-mail:zangdk@sdau.edu.cn。
通讯作者:臧德奎(1966-),男 ,博士 ,教授 ,现从事园林植物方面的
教学研究工作。E-mail:zangdk@sdau.edu.cn。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30972406);山东省优秀中
青年科学家奖励基金资助项目(2004BS06003)。
收稿日期:2010-03-22
木瓜属植物 AFLP分析体系的建立与应用
尹 长虹 , 马 　燕 , 臧 德奎
(山东农业大学林学院,山东泰安 271018)
　　摘　要:以29个木瓜属品种为试材 ,研究该属植物基因组 AFLP 反应体系的建立。通过检
测AFLP 分析中的 DNA提取、酶切及连接 、预扩增和选择性扩增的结果 ,对影响 AFLP分析的主
要因子进行探讨 ,建立了木瓜属植物的AFLP 分析体系 ,并利用该体系筛选出 E-AAG+M-CAA 、
E-ACA+M-CAA 、E-AAG+M-CAC 、E-AAG+M-CAG 、E-AAG+M-CAT 、E-AAG+M-CTG 、E-
ACA+M-CTT 和 E-ACG+M-CTT 共 8对引物组合 ,对供试品种进行扩增 ,获得的条带清晰可
辩 ,说明所建立的反应体系适合于该属植物进行 AFLP分析。
关键词:木瓜属;AFLP;DNA提取;引物组合
中图分类号:S 667.9　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)13-0116-04
　　AFLP(Amplified fragment length polymorphism)即
扩增片段长度多态性[ 1]是一项新的 DNA 指纹技术 ,结
合了 RFLP和PCR技术的特点 ,具有RFLP技术的可靠
性和 PCR技术的高效性。该技术采用同位素标记放射
自显影方法 ,稳定性好 ,条带也清晰 ,已被广泛用于检测
遗传多样性 、指纹图谱和品种鉴定 、基因定位、遗传作
图、天然居群的遗传结构与保护生物学研究等方面 ,成
为遗传多样性和品种分类研究的有效手段[ 2-4] ,如在紫
丁香 、蔷薇 、野生兰 、牡丹 、紫薇等多种园林植物的遗传
多样性研究中均取得了较好效果[ 5-9] 。
木瓜属(Chaenomeles)植物属于蔷薇科 ,是重要的观
赏和药用植物 ,目前尚无该类植物的 AFLP 分子标记方
面的研究。该研究对木瓜属植物 AFLP分析体系进行
了分析和优化 ,摸索出适合该属植物的 AFLP 体系和试
验方案 ,获得了清晰的 DNA指纹图谱。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料取自山东农业大学木瓜种质资源圃(泰安
市)和山东临沂市河东区汤河镇 ,共 29个品种(表 1)。
取1 a生枝条上刚露尖未展叶或刚展叶时的健康嫩叶 ,
洗净后置-70℃冰箱内备用。
1.2　DNA提取
在常规的 CTAB 法[ 10] 提取 DNA的基础上进行了
适当改进。
1.3　AFLP分子标记技术流程
1.3.1　模板 DNA制备　DNA 酶切及人工接头连接 ,
采用双酶切目的 DNA ,选用 EcoRⅠ/Mse Ⅰ2种酶 ,再用
T4DNA连接酶 ,酶切和连接一步完成。在 0.5 mL离心
　　表 1 供试木瓜属品种
编号 品种名
1 `猩红与金黄 C.× superba
2 `长寿乐 C.× superba
3 `报春 C.S peciosa
4 `绿宝石 C.× superba
5 `多彩 C.speciosa
6 `紫衣 C.× superba
7 `凤凰木 C.speciosa
8 `红星 C.speciosa
9 `大富贵 C.× superba
10 `红宝石 C.× superba
11 `复长寿 C.× superba
12 `单白 C.japonica
13 `碧雪 C.× superba
14 `单粉 C.japonica
15 `日落 C.japonica
16 `红霞 C.speciosa
17 `醉杨妃 C.cathayensis
18 `罗扶 C.cathayensis
19 `长俊 C.cathayensis
20 `一品香 C.cathayensis
21 `夕照 C.speciosa
22 `沂红 C.× superba
23 `矮红 C.japonica
24 `粉蝶 C.× superba
25 `红舞 C.× superba
26 `日本红 C.japonica
27 `沂橙 C.× superba
28 `骄阳 C.× superba
29 `四季红 C.japonica
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北方园艺 2010(13):116 ～ 119 ·生物技术 ·
管中加入限制性酶切及连接反应体系混合液(按表 2配
制),混匀离心数秒 ,37℃保温5 h ,8℃保温 4 h ,4℃过夜。
1.3.2　预扩增反应　在0.5或0.2 mL离心管中加入预
扩增混合液(按表 3配制),混匀 ,按下列参数进行 PCR
扩增:94℃变性 2 min;94℃变性 30 s ,56℃复性30 s ,72℃
延伸 80 s ,循环 30轮;72℃延伸 5 min。
1.3.3　选择性扩增反应　首先用TE buffer按1∶20稀
释样品 ,作为选择扩增模板。其次需要选择引物对 ,
AFLP引物盒中总共有64对引物 ,随机选择引物对。再
在0.5或 0.2 mL 离心管中加入选择性扩增的混合液
(按表 4配制),混匀 ,离心数秒 ,按下列参数 PCR循环:
94℃2 min;一轮扩增参数:94℃30 s , 65℃ 30 s , 72℃
80 s;以后每轮循环退火温度递减 0.7℃或 1℃,扩增 12
轮;接着按下列参数扩增 23 轮:94℃30 s ,55℃30 s ,
72℃80 s;最后延伸 72℃5 min。
1.3.4　引物的筛选和变性 PAGE 凝胶的制备　从
AFLP试剂盒中的64引物中随机选出8物组合分别为:
E-AAG+M-CAA ,E-ACA+M-CAA ,E-AAG+M-CAC ,
E-AAG+M-CAG ,E-AAG+M-CAT ,E-AAG+M-CTG ,
E-ACA+M-CTT 和E-ACG+M-CTT。用 4.0%的丙烯
酰胺胶 100 mL 加入 10%过硫酸铵 500 μL 和 TEMED
100μL制胶。用BioRad 3000电泳系统110 W恒定功率
电泳 2.5 h。干胶后 , MD Storm-820系统压磷屏 、扫磷
屏、检测 、压片 、冲片 、照相 、冲印相片。
表2　AFLP限制性酶切及连接反应体系(总体积20μL)
组分 体积/μL
DNA模板(浓度:50 ng/μL) 4
Adapter 1
EcoRⅠ/MseⅠ(4 U/μL) 2
10×Reaction buffer 2.5
ATP(10 mmol/L) 2.5
T4 Ligase(4 U/μL) 1
AFLP-Water 7
　表 3　AFLP预扩增 PCR反应体系(总体积25μL)
组分 体积/μL
模板 DNA(来自酶切连接的) 2
pre-amplification 1
dNTPs 1
10×PCR buffer 2.5
Taq DNA polymease(2 U/μL) 0.5
AFLP-Water 18
表4　AFLP 选择性扩增 PCR反应体系(总体积25μL)
组分 体积/μL
预扩增稀释样品 2
dNTPs 2.5
10×PCR buffe r 0.5
EcoRⅠ引物(prime) 1(共8种 ,按需要挑选 1种)
MseⅠ引物(荧光标记) 1(共4种 ,按需要挑选 1种)
Taq DNA polymease(2 U/μL) 0.5
AFLP-Water 17.5
2　结果与分析
2.1　用于酶切的基因组DNA的量
基因组 DNA的酶切和连接是后续预扩增和选择性
扩增的基础。若酶切不完全 ,则不能充分反映 DNA中
酶切位点和酶切片段长度的多态性。因此 ,基因组DNA
的完全酶切是多态性得以检出的根本保证 ,而影响酶切
是否完全的一个重要因素就是用于酶切的 DNA的量。
过多容易导致酶切不完全 ,过少则模板浓度太低。研究
比较了基因组 DNA不同用量的酶切效果。结果表明 ,
300～ 400 ng基因组 DNA酶切后 ,最终得到的谱带少 ,
且谱带多集中于测序胶的上部;50 ～ 150 ng 基因组DNA
用于酶切时 ,预扩增得到的模板浓度过低;采用 200 ng
既可酶切完全 ,又能在预扩增后得到合适浓度的模板。
因此确定在20μL 酶切—连接体系中以 200 ng 基因组
DNA为宜。
2.2　酶切连接步骤的选择
AFLP是对酶切 DNA 片段进行选择扩增 ,因此
AFLP分析过程中酶的选择至关重要。限制性核酸内切
酶同其它酶类一样 ,反应系统应包括酶 、底物和反应缓
冲液 ,并且还需要合适的反应温度。影响限制性内切酶
反应的因素很多 ,DNA 制品中的污染如 PVP 、酚 、氯仿、
乙醇 、EDTA 、高盐浓度等均可抑制酶切活性。其抑制可
通过增加酶作用单位数 ,增大反应体积以稀释可能的抑
制物或延长反应时间来加以克服。进行 AFLP分析时 ,
DNA限制性内切酶为双酶消化 ,即采用稀有碱基切点
酶(识别位点4个碱基)和常见碱基切点酶(识别位点 6
个碱基)同时进行酶切 ,酶切完全 ,酶切产物及连接后的
产物经 1.0%琼脂糖电泳检测 ,结果显示 DNA酶切充分
(图 1),酶切产物片段大小符合AFLP 分析对酶切片段
的要求[ 11-12] 。表明酶切彻底 ,连接完全 ,可用于下一步
的试验。
图 1　酶切连接产物检测
2.3　预扩增
由图 2可看出 ,预扩增反应弥散带分散均匀且连续
成一片。预扩增反应起着承上启下的作用 ,既反映酶切
和连接效果的好坏 ,又直接影响着选择性扩增的电泳结
果及所获得的预扩增产物。
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图2　预扩增图
2.4　引物筛选
引物的设计是 AFLP 技术中重要的步骤。引物的
改进是 AFLP 较 RAPD、PCR最主要的变革。AFLP试
剂盒提供 EcoRⅠ引物为:E-AAC 、E-AAG 、E-ACA 、
E-ACT 、E-ACC 、E-ACG 、E-AGC 和 E-AGG共 8对;Mse Ⅰ
引物为:M-CAA 、M-CAC 、M-CAG 、M-CAT 、M-CTA 、
M-CTC 、M-CTG 和 M-CTT 共 8 对。EcoR Ⅰ引物与
Mse Ⅰ引物可组合成 64对引物组合 ,用于 AFLP 分析的
选择性扩增。然而 ,对于具体植物而言 ,并非所有 64对
引物组合都是适宜的 ,必须筛选出适于具体植物的引
物对。
该试验选取引物组合的主要标准是:总扩增条带数
适中 ,既不能太多也不能太少;条带分布的疏密程度均
匀。经研究 ,筛选出来可用于荧光的 8 对引物对分别
为:E-AAG+M-CAA 、E-ACA+M-CAA 、E-AAG+M-CAC 、
E-AAG+M-CAG 、E-AAG+M-CAT 、E-AAG+ M-CTG 、
E-ACA+M-CTT 、E-ACG+M-CTT。该 8对引物组合
均具有扩增位点较多 ,带型质量好 ,分辨率较高 ,条带疏
密合适 ,分布均匀等特点。如引物 E-AAG+M-CAT 扩
增出183条带 ,不仅总条带数适中 ,而且条带分布较均匀
(图 3)。
图 3　AFLP扩增图(引物 E-AAG+M-CAT)
2.5　选择性扩增反应
高浓度的引物可能导致非特异性扩增;反之 ,引物
浓度不足则导致 PCR的效率极低 ,扩增产物的产量不
足[ 13] 。研究采用 25 μL 反应体系中含 EcoR I primer
(4.0U/μL)1.0μL 和MseI primer(4.0 U/μL)1.0μL较
为适宜。选择性扩增引物的碱基数目直接影响 AFLP
扩增位点的数目。碱基数越少 ,扩增条带数越多 ,能获
得较多的信息;但若条带过于密集则不利于读取。反
之 ,碱基数越多 ,扩增条带数目越少 ,信息量太小。该研
究所筛选的 EcoR I-AGC+Mse I-CAC均为 3个选择性
碱基的引物组合 ,对 29个木瓜属品种进行的扩增得到
了清晰的带型(图 3),共扩增出 1 095条谱带(70 ～
500 bp),其中 1 035条具有多态性 ,占 94.52%,平均每
对引物扩增出 137条可统计的带 ,其中 129条具有多
态性。
3　讨论
木瓜属植物的叶片含有较多的多糖 、酚类 、蛋白质 ,
这些物质是污染DNA的主要次生代谢产物[ 14] 。在 2%
CTAB 提取缓冲液中加人 PVP 、β-巯基乙醇可有效去除
植物组织中的多糖 、酚类物质 ,从而减少次生代谢物质
的污染 ,试验结果显示 AFLP分析效果好。
AFLP对起始模板浓度不太敏感 ,当模板 DNA在
25 pg ～ 25 ng 的 1 000倍范围内变化时其带型完全相
同 ,只有当模板量低于 2.5 pg时 ,带型才发生改变(变弱
或缺失)。因此在不减少内切酶用量的情况下模板DNA
用量可少至100 ng 。为了确保酶切完全 ,延长酶解时间
也有一定作用。基因组模板 DNA通过限制性内切酶产
生连接反应和扩增反应的亚片段 ,所以基因组的充分酶
切是 AFLP成功的另一关键。在使用限制性内切酶水
解基因组时 ,一定要彻底[ 15-16] 。同一 DNA样本完全酶
切与不完全酶切形成的 AFLP 指纹分布方式不同 ,而这
并不代表真实的DNA多态性。不完全酶切的产物扩增
后在电泳凝胶上会出现额外的条带 ,主要是一些高分子
量的带型[ 17-19] 。
引物筛选结果表明 ,引物不同 ,对 DNA模板的结合
力不同 ,模板不同 ,对引物的反应力也不同 ,则扩增产物
片段的大小 、分布 、紧密度都可能完全不同。因此 AFLP
分析体系中进行引物的筛选是必须的。AFLP引物中选
择性碱基的数目主要取决于研究对象基因组的大小[ 20] ,
拥有 3个选择性碱基的引物在扩增过程中错配率较低 ,
因此 AFLP引物(包括EcoRI的引物和 MseI的引物)中
常至少有一个含3个选择性碱基才能产生适宜的带型。
木瓜属植物基因组较为复杂 ,采用 E+3/M+3引物组
合适于 AFLP选择性扩增。该研究筛选出的 8对引物 ,
其多态性比例相当高 ,对木瓜属品种的区分能力强 ,具
有较大应用价值。
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利用建立的反应体系对 29个木瓜属品种进行的
AFLP反应 ,经4%的丙稀酰胺凝胶凝胶电泳检测结果
显示 ,条带清晰 ,不同品种间 DNA谱带多态性丰富 ,并
且能很好地把它们区分开来。研究试材来自木瓜属的
不同种类 ,取材广泛且具有代表性 ,证实该体系稳定可
靠 ,适用于该属植物基因组 DNA的AFLP 研究。
AFLP研究中尚有很多因素会对结果产生影响。
不同厂家及同一厂家不同批次的 Taq酶的活性存在差
别 , Taq酶的活性高 ,信号扩增强 ,反之则弱;同时 ,电泳
时温度太高 ,丙烯酰胺聚合不良 ,也会影响 AFLP 扩增
片段的质量。电泳前样品要充分变性 ,否则会加深泳道
的背景 ,而显影时间长短则是影响银染质量的关键。显
影液温度太低 ,胶板显带时间延长 ,会导致背景加深 ,条
带相对模糊;显影液温度太高 ,显影时间过短 ,则条带颜
色浅而不易分辨。研究表明 ,显影液温度以 6℃左右为
宜。此外 ,制备4%聚烯酰胺凝胶应尽可能采用新配制
的丙烯酰胺溶液(以4℃冰箱保存期不超6 d为宜),否则
引起条带变弱和背景加深而影响分辨。因此 ,AFLP实
验操作对试验结果的影响应引起足够的重视。
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Establishment of AFLP Analysis System and its Application in Chaenomeles
YIN Chang-hong ,MA Yan ,ZANG De-kui
(Forestry College, Shandong Agricultural University , Tai an , Shandong 271018)
Abstract:Twenty-nine cultivars in the genus Chaenomeles were used as materials to establish the AFLP(Amplified Frag-
ment Length Polymorphism)reaction sy stem for studying the relationship and genetic diversity in flowering quince
resources.The AFLP analysis system was established by detected the results of several reactions such as DNA extrac-
tion , enzymes rest riction , pre-amplification and selective amplification;the main factors w hich affected AFLP analysis
were analyzed.Eight pairs of primers , E-AAG+M-CAA , E-ACA+M-CAA , E-AAG+M-CAC , E-AAG+M-CAG ,
E-AAG+M-CAT , E-AAG+M-CTG , E-ACA+M-CTT , and E-ACG+M-CTT , were selected to selectively amplify
the genomic DNA of the cultivars , and clear amplification bands were obtained.The results suggested that the reaction
sy stem was good for Chaenomeles AFLP analysis.
Keywords:Chaenomeles;AFLP;extraction of DNA;primer combinations
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