全 文 ：收稿日期:2009-06-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30660224)作者简介:吴家红(1962-),女 ,实验师 ,大专 ,从事化学分析工作。
通讯作者:徐文芬。
HPLC法测定秋海棠属药材中 β —谷甾醇的含量
吴家红 ,徐文芬 ,文　雯 ,杨　亮 ,高　杰
(贵阳中医学院药学系 ,贵阳　550002)
摘要:目的:建立了秋海棠药材中 β —谷甾醇的含量测定方法 ,对秋海棠药材不同种类 、不同产地 、不同部位进
行质量对比研究。方法:对不同种类 、产地 、药用部位的秋海棠药材样品 , 采用 HPLC 法分别测定其 β —谷甾
醇含量。结果:12 种秋海棠药材因种类 、产地 、药用部位不同 ,其 β —谷甾醇含量有较大差异 ,多数种类以地上
部分>根茎>全草。为秋海棠药材质量标准提升研究及其资源的的可持续利用提供了实验依据。
关键词:秋海棠药材;β—谷甾醇;含量;HPLC 法
中图分类号:R284.1　文献标识码:B　文章编号:1005-5320(2009)06-0024-03
　　秋海棠为秋海棠科秋海棠属多年生肉质草本植
物 ,具有清热解毒 、散瘀消肿的功效 。贵州省中药
材 、民族药材质量标准(2003年版)收载的品种为盾
叶秋海棠(Begonia cavalerei Lév l.)、裂叶秋海棠
(Begonia palmata D .Don),在其标准中未收载有效
成分的含量测定项 ,质量标准尚不够完善[ 1] 。查阅
有关文献资料 ,秋海棠根茎中主要含有强心苷 、黄酮
类 、鞣质 、酸性成分 、谷甾醇 、三萜类 、皂苷等化学成
分[ 2 ～ 5] 。本实验对不同种类 、不同产地 、不同部位
秋海棠药材进行质量对比研究 ,首次采用高效液相
色谱法测定了秋海棠药材中 β—谷甾醇的含
量[ 6 ～ 13] ,旨在为秋海棠药材质量标准的提升研究 ,
合理开发利用秋海棠药材资源提供理论依据 。
1　仪器和材料
1.1　仪器
Agilent1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公
司),安捷伦液相色谱系统化学工作站;微孔滤膜φ
=0.45μm(进口);AG135型电子天平(瑞士Mettler
-Toledo 公司);CSF -1B超声波清洗仪(上海超声
波仪器厂)。
1.2　对照品及试剂
β—谷甾醇对照品(中国药品生物制品检定所
批号:110851—200202)。乙腈为色谱纯 ,氯仿为分
析纯 ,水为重蒸水。
1.3　样品来源
实验样品均采自贵州省不同产地秋海棠药材 ,
经贵阳中医学院何顺志研究员鉴定为盾叶秋海棠
B.cavalerei 、掌裂叶秋海棠 B.grandis 、周裂叶秋
海棠 B .circum lobata 、中华秋海棠 B .grandis
subsp. sinensis 、 红 孩 儿 B .palmata var.
bowringinan 、一点血 B.wilsoni i 、槭叶秋海棠 B.
digyna 、赤水秋海棠 B .chishuiensis 、歪叶秋海棠 B.
augustine 、水晶秋海棠 B .crystal lina 、独牛 B.
henryi 、秋海棠 B .grandis ,阴干或晒干 ,粉碎过 40
目筛 ,置干燥器中备用 。
2　实验方法
2.1　色谱条件　色谱柱:ZORBAX SB-CN(4.6
mm×250 m ,5 μm);流动相:乙腈-水梯度洗脱;柱
温:25℃;检测波长:205 nm;流速:0.8 ml/min;进样
体积:20 μl。流动相系统配比的梯度洗脱程序见表
1。
表 1　流动相系统配比的梯度洗脱程序表
T(min) Flow rate(ml/min) B(%) A(%)
0 ～ 5
5 ～ 18
18 ～ 20
0.8
0.8
0.8
75
78
78
25
22
22
2.2　对照品溶液的制备　精密称取 β —谷甾醇对
照适量 ,加乙腈溶解并制成每 1 ml含 105.6 μg 的
对照品溶液 ,作为储备液备用。
2.3　供试品溶液的制备　取样品粉末适量(地下部
分 0.5 g ,地上部分 0.2 g),精密称定 ,置 50 m l具塞
锥形瓶中 ,加氯仿 25 ml ,超声提取 30 min ,过滤 ,残
渣用氯仿洗涤两次 ,合并滤液 ,置于水浴锅上蒸干 ,
残渣加乙腈溶解 ,转移至 10 ml量瓶中 ,加乙腈至刻
度 ,即得 。
2.4　测定方法　精密吸取上述对照品溶液和供试
品溶液各 20μl ,注入液相色谱仪测定 ,记录色谱图。
2.5　标准曲线的绘制　精密取 β—谷甾醇对照品
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溶液(105.6 μg/ml)2 、5 、10 、15 、20 μl ,自动进样 ,测
定峰面积。分别重复测定 3次 ,以其峰面积平均值
为纵坐标 ,其对应的 β—谷甾醇质量为横坐标 ,进行
回归计算 ,得到 β—谷甾醇的回归方程和相关系数
为:
Y=441.002971X +0.4168862 　r =0.99998
(n=5)
实验结果表明:本方法中 , β —谷甾醇在 0.2022
～ 2.022 μg 范围内与峰面积的线性关系良好 。
2.6　专属性考察　分别精密吸取 β—谷甾醇对照
品溶液和供试品溶液 20μl ,进样 ,记录色谱图 ,采用
二极管阵列检测器 ,对照品和供试品中 β—谷甾醇
峰的 UV 光谱图一致 ,表明该方法的专属性好。
2.7　精密度试验　精密吸取 β—谷甾醇对照品溶
液(105.6 g/ml), 1 d 内连续进样 6次 ,每次 20 μl ,
测定其精密度 , 结果得 β—谷甾醇的峰面积值的
RSD=0.42%,表明仪器精密度良好 。
2.8　重复性试验 　精密称取同一药材粉末样品 6
份 ,按“2.3”项下的方法制备供试品溶液 ,在上述色
谱条件下进行分析测定 ,结果得样品中 β—谷甾醇
含量的 RSD=1.09%,表明本法测定的重现性良
好。
2.9　稳定性试验 　精密称取同一药材粉末样品 1
份 ,按“2.3”项下的方法制备供试品溶液 ,分别于 0 、
2 、4 、6 、8 、10 、12 h 进行分析测定 ,结果得 β—谷甾醇
含量的 RSD=1.09%,表明供试品测定在 12 h内基
本稳定。
2.10　回收率试验　精密称取已知含量的同一药材
粉末样品共 6份 ,每份约 0.25 g ,分别精密加入 β —
谷甾醇对照品溶液(0.1011 mg/ml)2 ml ,按“2.3”项
下方法制备供试品溶液 ,在上述色谱条件下进行分
析测定 ,结果得芦丁平均回收率为 103.73%, RSD
为 0.94%,见表 2。
表 2　秋海棠药材中 β—谷甾醇的回收率
试验结果(n=6)
称样量
(g)
样品中
β—谷甾醇
含量(mg)
对照品
加入量(mg)
检出量
(mg)
回收率
(%)
平均回
收率(%)
RSD
(%)
0.2508
0.2514
0.2511
0.2508
0.2513
0.2514
0.1480
0.1483
0.1481
0.1480
0.1483
0.1483
0.2022
0.2022
0.2022
0.2022
0.2022
0.2022
0.3561
0.3602
0.3589
0.3561
0.3572
0.3603
102.9
104.8
104.2
102.9
102.8
104.8
103.73 0.94
　
2.11　实验结果　将不同种类 、不同产地 、不同部位
的秋海棠药材按“2.3”项下方法分别制备供试品溶
液 ,分别进样 20μl ,照上述色谱条件测定 ,测定结果
见表 3 、4。
表 3　不同种类 、不同产地 、不同部位秋海棠
药材中 β—谷甾醇的含量结果(n=4)
编号采收日期 种类 产地
β —谷甾醇含量(%)
地上部分 地下部分
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
08.9.5
08.7.18
08.7.28
08.10.18
08.8.3
08.8.3
08.9.2
08.9.14
08.8.2
08.8.4
08.9.2
08.10.13
08.7.11
盾叶秋海棠
盾叶秋海
盾叶秋海棠
盾叶秋海棠
赤水秋海棠
赤水秋海棠
周裂叶秋海棠
中华秋海棠
掌裂秋海棠
一点血
红孩儿
歪叶秋海棠
秋海棠
贵阳高坡
龙里湾寨
开阳南江峡谷
贵定栗木坪
赤水竹海
赤水红石野谷
榕江尧人山
威宁岔河乡
习水长嵌沟
仁怀盐津河
榕江尧人山
贵定云雾镇
施秉云台山
0.13
0.13
0.098
0.10
0.095
0.12
0.17
0.15
0.23
0.096
0.13
0.12
0.057
0.072
0.073
-
0.065
0.069
0.59
0.055
0.11
0.087
0.026
-
0.077
-
表 4　不同种类 、不同产地秋海棠药材全草中
β—谷甾醇的含量结果(n=4)
编号 采收日期 种类 产地 β—谷甾醇含量(%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
08.7.28
08.7.28
08.7.28
08.7.28
08.7.28
08.7.27
08.10.18
08.5.8
08.7.18
08.7.28
08.7.28
08.8.2
08.9.14
盾叶秋海棠
盾叶秋海棠
盾叶秋海棠
盾叶秋海棠
盾叶秋海棠
盾叶秋海棠
盾叶秋海棠
水晶秋海棠
中华秋海棠
中华秋海棠
槭叶秋海棠
一点血
独牛
龙里湾寨羊场
开阳南江峡谷
云南上偏岩
贵阳马场鬼架桥
龙里湾寨羊场
黔陶乡桐木岭
贵定昌明
云南老山
龙里湾寨
修文电站
云南上偏岩
习水长嵌沟
威宁岔河乡
0.087
-
0.092
0.058
0.088
0.13
0.10
0.092
0.13
-
0.087
0.038
0.053
3　结果与讨论
3.1　由表 3和表 4可知 ,不同产地秋海棠药材中
β —谷甾醇的含量有明显差异 ,以赤水红石野谷产赤
水秋海棠药材根茎中 β —谷甾醇的含量为最高;同
一药材的不同部位所含 β—谷甾醇也有明显差异 ,
多数种类以地上部分的 β —谷甾醇含量最高 ,全草
含量最低 ,根茎介于二者之间。本实验采用紫外检
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测器检测 β —谷甾醇含量 ,只是进行一个初步探讨 ,
今后还需采用蒸发光散射检测器作进一步研究。
3.2　供试品提取方法考察　本实验比较了连续回
流法与超声提取法 ,结果用连续回流法所提样品纯
度较差 ,峰面积较小 ,故选择超声提取法 。
3.3　供试品提取溶剂的选择　在实验中考察了乙
腈和氯仿两种溶剂的提取效率 ,结果为氯仿所提样
品峰面积略小 ,但分离度较好 , β —谷甾醇峰纯度高 ,
重复性与稳定性较好 ,故选择氯仿作为提取溶剂。
3.4　供试品提取时间的考察　在实验中考察了超
声15 、30 、45和 60 min的提取效率 ,结果为 45 min
>30 min>15 min>60 min ,故选择超声时间为 45
min。
3.5　色谱柱的选择　实验中考察了 5种色谱柱 ,分
别为 AgilentXDB C18(150 mm×4.6 mm , 5μm)、SB
C18(150 mm ×4.6 mm , 5 μm)、ZORBAX Ex tend-
C18(250 mm ×4.6 mm , 5 μm)、ZORBAX SB-CN
(250 mm ×4.6 mm , 5 μm), Diamonsil(钻石)C18
(250 mm ×4.6 mm , 5 μm),依利特 ODS2(250 mm
×4.6 mm , 5 μm), 结果显示 , ZORBAX SB -CN
(250 mm×4.6 mm , 5 μm)柱所测得的目标峰和杂
质峰的分离效果较好 ,故选择此柱进行测定。
3.6　流动相的选择　本实验考察了乙腈 —甲醇 —
异丙醇(90∶9∶1)、乙腈 —甲醇(不同比例)、乙腈
100%、乙腈-水(梯度洗脱),结果显示乙腈—水梯
度洗脱所得目标峰峰形好 、分离效果较好 ,且峰的纯
度高 ,故选择流动相为乙腈—水梯度洗脱。
3.7　流动相流速考察　本实验比较了 0.6 、0.8 及
1 ml/min 三种流速 ,根据峰形 、保留时间及分离效
果 ,选择流速为 0.8 ml/min。
3.8　进样量的选择 在实验中选择考察了 10 、15及
20μl ,结果为分离效果 15 μl>20μl>10 μl ,故选择
进样量为 15μl。
本实验通过建立秋海棠药材中 β—谷甾醇的含
量测定方法 ,对不同种类 、不同产地 、不同部位秋海
棠药材进行质量对比研究 ,为秋海棠药材质量标准
的提升研究 ,秋海棠药材资源的可持续利用提供了
理论依据。
参考文献:
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29.
·国际会讯·
第九届硒在生物学和医学中的作用国际研讨会(The 9th International Symposium on Selenium in Biology
and Medicine , Selenium 2010)将于2010年 5月 31 ～ 6月 4日在日本京都(Kyo to)举行 。会议网站为 http://
selenium2010.jp/ 。
[注:在上世纪 70年代 ,由于中国用硒有效预防了克山病 ,并提供了硒是人体必需微量元素的关键证据 ,
而得到世界赞誉 ,也因此获得两次硒会议举办权 。以往几届分别是:1966年第一届(美国);1980年 第二届
(美国);1984年第三届(中国);1988年第四届(德国);1992年第五届(美国);1996年第六届(中国);2000年
第七届(意大利);2006年第八届(美国)] 。
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所
夏弈明(国际组委会委员之一)供稿
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