全 文 ：第二十一卷第三期
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内象古大学学报( 自然科学版 》
人引比 Sd e nt 妞川 .a N比 .如 mJ [ 叫卜创目恤山 加t 叔肋叫扣从翅 .
9 9 10年 7月
J u l
。
199 0
几种野生豆科锦鸡儿属( 。 ” 卿朋F ar b .)植物离体培养过程
中器官分化和内源植物激素含量的关系 ’
高 玫 李天然
( 生物系 )
摘 要 通过对内蒙古自治区三种野生豆科锦鸡儿属植物— 柠条( c .k or s` s nk 的 、 狭叶锦鸡儿
( c
·
t s eo n内yu a )和黄刺条( C .fu rtx e)的组织培养 , 从它们的上胚抽 、 下胚轴 (或幼茎 ) 上直接诱导
出芽并获得了幼苗 , 从后两种植物的胚轴 (或幼茎 )的愈伤组织中也诱导出芽 . 并使其生根 , 获得
再生小植株 . 本文着重研究了激素对这三种植物的愈伤组织生长和分化的影响 . 并对脱分化和 已
有器官分化的两个时期的愈伤组织的内深生长家和细胞分裂素的活性进行了测定 , 发现两个时期
愈伤组织中内谏激素系统有明显不同 . 推测这种变化与愈伤组织的诱导和分化有一定的关系 .
关键词 器官分化 , 离体培养 ; 锦鸡儿属 , 内源植物激素
引 言
植物细胞和组织培养作为一种快速繁殖手段一直得到很高的重视 , 尤其对一些具有重要经济
意义的植物通过组织培养方法进行快速无性繁殖的研究更显重要 . 大多数豆科植物都是具有很高
经济价值的植物 , 但是豆科植物的组织培养和植株再生被公认为是比较困难的 , 尤其木本豆科植
物的体外培养更为困难 , 培养材料很易变褐坏死 . 本文中三种锦鸡 ; l渗属 植物均为野生木本豆科植
物 , 到 目前为止国内外均未见到有关锦鸡儿属植物组织培养方面的报道 .
对内源激素系统在组织培养中的变化及内 、 外源激素的相互关系的研究尚不多见 . 李天然等
曾在胡萝 卜的体细胞胚胎发生研究中讨论了内源生长素和细胞分裂素在胚胎发生过程中的动态变
化〔’ 〕 . 本文就此三种锦鸡儿属植物离体培养中内源植物生长物质在脱分化和分化过程中的动态变
化规律进行了初步探索 .
1 材料和方法
L l 植物材料
将三种植物的种子 〔柠条采自瞪口 (巴彦高勒 ) 沙生植物试验站 , 其它两种均由内蒙林科院
莎仁老师提供〕 先在 70 %酒精中浸泡半分钟 , 再在 0 . 1%升汞中消毒 15 分钟 , 无菌水冲洗 4~ 5
次 , 无菌条件下在含 卫习大量和微量的固体培养基中萌发 , 一星期后取幼苗的上胚轴 、 子叶 、 下胚
轴 (包括子叶节 ) 和幼茎 (黄刺条 ) 〔旧 . 作为外植体材料 .
L Z 组织培养方法
将外植体切成约 I c m 长的切段接种在含 0 . 8%琼脂及不同激素组成和配比的 M S 或其它培养
· 贺润根 . 舒兰云二位同学参加了部分组织培养工作 , 在内漂植物激京的测定上台得到征荣同志的大力协助 , 内蒙林科
院莎仁老师提供种子 , 在此表示感谢 .
[注〕黄刺条幼苗的胚轴极短 , 上 、 下胚轴与子叶节均无法区分 , 因此取幼茎与胚报之间部分作为外植体材料包含上 、 下
胚轴和子叶节 , 文中以胚轴表示 .
收稿日期 : 1 9 8 9一 0冬 2 8
内 策 古 大 学 学 报 1 0 9 9年
基上 , 1 0 0 0 L u X 光下 , 25 ~ 28 ℃培养 , 每 30 天继代一次 .
1
.
3 内谏生长素和细胞分裂素的提取和含里的测定
生长素的提取和测定 : 采用 L . eB n der 等 .1[ t[] 所改进的 oP w e l ` E . 方法 .lt 〕 , 由上述三种植物
外植体脱分化及具芽分化的愈伤组织用 甲醉 , 醋酸乙酷 , 二抓甲烷等分步提取并纯化后 , 以 5一澳
叫 噪 乙酸 ( 5一Br o m e 一 in do lea ce at et ) 作 内标物 , 用双 (三 甲基 硅烷 ) 三氛乙酞胺 (班汀 F A = B is 一
( tr im e ht yl isl yl )
一
itr fl uo ar ce at m id ) 硅院化 ,用岛津 cG 一 16 A 气相色谱仪分析测定内源生长素的含量 ·
色谱条件 : 不锈钢填充柱 . o r o m os o r b .w (白色硅藻土载体 ) , 6 0~ 8 0 目 , ^ W D MCS , 加 5 0%
的 s E 3O. F I D 检测器 , 量程 = l , 极性为 l , 柱程序升温 140 ℃ ~ 2 50 ℃ . 以高纯氮为载气 , 流速为
30 d / m in
, 纸记录速度为 1 0~ / m .in细胞分裂素活性测定 : 在前述生长素提取过程中醋酸乙醋抽提后的有机相减压浓缩至少量 ,
乙醇洗脱 , 热风吹干后 , 采用 aP l u se k K . 和 K 一 H N eu m an n[ , `〕用测定胡萝 卜根韧皮部愈伤组织生长
量的生物试法测定细胞分裂素的活性 .
2 实验结果
2
.
1 外源激素对愈伤组织形成的影响
我们对三种植物的不同外植体在含有四种不同激素组合的四种基本培养基中 ( sM 〔 , ’〕
,
sL
〔” 〕 ,
s H 〔 , 6 ]和 B l a y d es 〔S J )进行 T 诱导愈伤组织的对比实验 , 四种组合为 : ( l ) N ^ A 0 . sm g / L + 6一 B A
0
.
sm g / L ; ( 2 ) N A A Zm s / L + 6
一
B A 0
.
s m s / L , ( 3 ) 2
.
4一 D 0 . s m g / L+ 6一 B A 0 . s m s / L ; ( 4 ) 2 . 4一 D
Zm g L/ + 6
一
BA 0
.
s m g / L
. 结果发现 2 . 小 D 诱导愈伤组织效果好 . 愈伤组织生长量多 , 形 态多为白
色 , 疏松 , 而含 N A A 的培养基中愈伤组织的生长量相对较少并易变褐 . 图一为三种植物的子叶和
下胚轴在 SL 附加四种激素组合的培养基中培养一个月后愈伤组织鲜重增加的情况 :
图一表明 2 . 4一 D 适于对三种植物不同来源的外植体愈伤组织的诱导 , 而且柠条子叶外植体表
现得特别敏感 , 而 N A A 的诱导效果较差 .
我们在柠条中也进行了生长素和细胞分裂素的浓度在诱导愈伤组织中的作用实验 . 在附加
。 . :了 乙众全, 4
颤酬毓心.!.卫,且IJ-`,`.0.0
图 1 来源于三种植物的子叶和下胚轴 (或幼茎 )
. 一子叶 口一下胚轴
- 一一` 艺` . 2 沙曰匕` 仁上 J se
西
外植体在 LS 附加不同激素的培养基中愈伤组织的生长量比较
a)
. 柠条 b) . 狭叶锦鸡儿 c) . 黄刺条
纵坐标 : 愈伤组织鲜重增加 ( 盯块外植体 )
F论. 1 Cb m 脚” 加 n of 沙 lds of co yt lde o n a n d h y p以为 lyt ( or y o u n朗 r st o m ) 口」l su of U甘“ p场 n 侣扭蓝ut 记 in is m de lum
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第三期 高 玫等 几种野生豆科锦鸡儿属 (已则卯彻 a Fr b. )植物离休培养过程中器官分化和内源植物激素含量的关系妮 9
L入 A和 6一 B A(l , 10 和 20 m叮 )L 不同组合的 s H 培养基上培养一个 月后的子叶和下胚轴外植体上
发现 , 两种外植体都在 L入A l m s/ L + 6一BA I Om g / L 的培养基上愈伤组织鲜重增加最多 . 但 认A 浓
度的影响并不很大 (如图 2 , 3 ) , 而细胞分裂素的浓度对愈伤组织诱导影响确是肯定的 (图 4 , 5) ,
1 10 20 6一 B人 ( m名l/ )
图 2 I A人浓度对柠条下胚轴诱导愈伤组织的影响
① IA A : l m g / L ② I A A : 1 0 0 9 / L ③ IA A :
Zo gm / L 横坐标 : 6 一B A (gm / )L
纵坐标 : 愈伤组织鲜重 ( g /块外植体 )
iF s
.
2 1七e e ft eC t o f IA A co n ce n t r a t io n o n th e ca l su
i n d u Ct jo n f r o m h y侧又 o ty l of .C 么了目肠囚该
1
.
IA A l m g / L 2
.
I A A 10m g / L 3
.
I A A
2 0m g / L
A比 c i , 进 in山 ca t es 6一 B A (m g /L )
o r id n a记 In dj aC res aC】l us f r es h w e助 t ( g c/ x p达 n t )
1 1 0 20 6一 B ^ (呢 / l )图 3 认 A 浓度对柠条子叶诱导愈伤组织的影响
① I^ ^ : l m s / L ② I A A : 1 0毗 / L ③ I人 ^ : Z o m g / L
横坐标 : 6一 B A ( m s / L )
曰 8 . 3 T七e el f ce t o f I A A co n 邝 n t r a t jo n o n t h亡 ca l lus
i n d u e t io n f r o m co ty lde
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.
1^ ^ l m s / L 2
.
IA A 1 0m 8 / L 3
.
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ZOm g /L
A比c ias in id ca tes 6一 B A (gm / )L
Or d s
n a t o idn 立ca tes ca l l此 f r es h w e吵 t ( g /。 x P达 n t )
1 1 0 2 0 1 ^ ^ (邺 / l )图 4 6一队浓度对柠条下胚轴诱导愈伤组织的影响
① 6 一 B A : l m g /L ② 6一 B A : 1 0m g / L ③ 6一 B A :
ZOgm / L
横坐标 : 认 A ( m g / L )
纵坐标 : 愈伤组织鲜重 (哪块外植体 )
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4 T七 e e f f侧比 o f 6一 B A co n ce n t r a t1O n o n t加 。 JluS
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A h犯治叨 in id ca tes I A A ( n堪 / L )
O r id an et i
n山 ca est 。 目】us fr . 上 w e i劝 t ( g八 x p扭 nt )
1 1 0 2 0 6一 I人 ^ ( m` /一)
图 5 6一 B人浓度对柠条子叶诱导愈伤组织的影响
① 6一 B A : l吨 /L ② 6一 B A : 10 gm /L ③ 6一 B A ;
2 0m 8 / L
横坐标 : IA A ( m g / L )
iF g
.
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6
一
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.
6
一
B A 1 0m g / L
3
.
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一
B A Z如 8 / L
A比 c l泌 加山 ca t es l人人 ( m g / L )
O r id n a t e 五n id ca t es ca l lus f r es l l w e吵 t ( g / e x幽 n t )
内 旅 古. 大 学 学 报 l 牙9 0年
6 一 BA 在 l1 ~ 0mg 邝 范围较适合下胚轴愈伤组织的诱导 , 20 m叮L 却明显不好 , 而子叶在 10 一 20
m g / L 范围内诱导效果明显好于 I lgn / L
2
.
2 外源激素对器官分化的影响
2
.
2
.
1 芽的诱导 : 三种植物在诱导愈伤组织过程中 , 都发现有从胚轴 、 子叶节或幼茎 (黄刺条 )
上直接发生芽现象 . 外植体接入培养基 5~ 6 天后膨大 , 在长出愈伤组织之前有些胚轴切 口处裂开
长出不定芽 〔图版 l 〕 , 有些材料直接从切 口处长出不定芽 〔 图版 2 〕 , 这些不定芽继续发育形成
小苗〔图版 3 〕 , 幼苗可长至 6一 c7 m . 这种发生芽的方式只在培养早期可以见到 , 待外植体大量长
出愈伤组织或经过几代继代培养后便不再以这种方式发生芽 . 柠条的芽分化仅限于此种方式 , 狭
叶锦鸡儿和黄刺条除以这种方式产生不定芽外 , 还可以从愈伤组织分化出芽 . 后种分化芽方式愈
伤组织长期继代培养后 ( 已近一年 ) 仍有分化能力 .
我们以 M S 为基本培养基附加不同浓度的 N A A 和 6一B A 对柠条进行诱导芽分化实验 , 接种外
植体材料 15 天后观察结果发现 , 子叶没有分化芽的能力 , 而下胚轴分化芽能力很强 , 尤其是带有
子叶节的下胚轴切段 , 芽多发生在子叶节处 , 上胚轴也有芽发生 . (见表 l)
表 1 激素对柠条上 、 下任轴外植体诱导芽的影响 (每种培养基总外植体数为 12 块 )
aT b l
e 1 T l l e e f里ec . o f h o r n l o 们 e co n忱 n . r a .全。 n 叨 s h o 卜 b u d f o n n a 通l o n 宜or m e Pl co t y l .耐 h y 侧盆 o t y l e x p l a n . of
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. 血了 , 访绍垃 ( hT e r e . r e 阅 u al n u m be r e x p la n . ae e h if as k )
培养荃 ( M s )
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上胚轴发生芽的外植体数
n u m比 x of 已x p场 n扭 r o r m j明
,坛扣 t 一 b u d f r o m 幼 io r y匕
下胚轴发生芽的外植体数
n u m阮 r o f e xP la n r s 加 r而明
, b。的七 u山 f or m by 户丈 O t y is
N A ^
( m s / L )
6
一 B A
m吕/ L
单生芽
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丛生芽 总 数 单生芽
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丛生芽 总 数
r O6 e t t e b u山 t仪姆 t t e b Ud , t o t al
0
.
0 1 0
.
5 0 0 0 1 0 1
.0 1 0 5
1 0
.
5
0
。
0 1 1
0
.
1 1
实验结果表明 : 6一 BA 浓度高、 N A A 浓度低对诱导芽分化有利 . 对上述两种外植体的诱导 , 6 -
BA 为多m g / L 诱导效果最好 , 对下胚轴而言 N A A 为 d. 0 l m刁 L 和 0 . 1 m g / L 时诱导效果比 l mg L/
的好 .
狭叶锦鸡儿和黄刺条在诱导愈伤组织培养基中 , 初期有大盆芽直接从上 、 下胚轴 (或幼茎 )
外植体上发生 . 表 2表明从 LS 的四种不同激素组合的培养基中发生芽的总外植体数 (每种培养基
中接种的总外植体为 16 块 ) .
第三期 高 玫等 几种野生豆科锦鸡儿属( 。训户 .F 的 r.) 植物离体培养过程中器官分化和 内谏植物激素含t 的关痴 3 1
表 2激素对狭叶锦鸡几和黄刺条任轴和幼茎直接发生芽的影响
介l be 2l h e efl 。日f oh om n 旧目c en o咖t r妇n o佣d 笼代d 由O 吸健份a I ud n oI r 0I u喇c ot 户 , h y p洲” ylt .时 y佣 n g 别enI
ex p肠 n . oI .C 目. “创甲如 a耐 .C 介“ 招
、盈经 狭叶锦鸡儿 黄刺条C . 目助幻户户 .C f , 山络上胚轴 下胚轴 共 计 幼 茎 胚 轴 共 计即劝卿】 b习” 伪 t yl t o t公 y ou 昭 s t e rn。 七习冲的 t yl t o t a l
① N人 ^ 0 . 5 + 6一 B A 0 . 5 4 l 0 1 4 5 2 7
② N 人 A Z+ 6一 B ^ 0 . 5 l 5 6 4 4 8
③ 2 , 4一D 0 . 5 + 6一 B ^ 0 . 5 0 7 7 3 1 4
④ 2 , 4一n Z十 6一 B A 0 . 5 O 0 0 2 0 2
共计 ot alt 5 2 2 2 7 I 4 7 2 1
两种植物的不同部位的外植体在含有 N A A 的培养基上均 比在含 2 . 4一 D 的培养基上诱导芽的
效果好 . 对狭 叶锦鸡儿来说 , 生长素含量大不利于芽的诱导 , 而黄刺条却表现不同 , 生长素的浓
度对芽的诱导影响不大 .
这两种植物的胚轴或幼茎切段长出愈伤组织后经过半年多的继代培养仍具有分化能力 · 而且
愈伤组织分化芽能力很强 , 一块上可以分化出很多小芽 , 小芽可继续发育成苗 〔图版 4 , 5〕. 表 3
所示在诱导愈伤组织培养基中经长期继代培养的愈伤组织分化情况 . (其中 M S , LS , S H 和 lB ay de “
为基本培养基 , 每种培养基均包括如前所述的四种激素组合 )
从表 3 的实验结果可以看出两种植物的胚轴 (或幼茎 ) 的愈伤组织都能分化出芽 , 而子叶则
只有根的分化 . 从四种激素组合诱导出芽的情况看 , 狭叶锦鸡儿的愈伤组织在含 N A A 的培养基
中比在含 2 , 4一 D 的培养基中诱导分化效果好 . 而两种生长素对黄刺条胚轴愈伤组织芽分化的作用
差别不大 .
为了解激素的种类及浓度对狭叶锦鸡儿和黄刺条愈伤组织的分化的影响 , 我们将上述培养基
中的愈伤组织转移到通常诱导芽分化的培养基上 (生长素 /细胞分裂素的 比值低的培养基 ) 进行
诱导实验 . 以 M s 为基本培养基附加不同激素 , 它们是 : N A A (或 认 A ) (0 . 01 , 0 . 1 和 0 . 5 m g / L ) 十
6
一
B A (或 K T ) ( 1 , 3和 6 m s/ )L 共 36 种组合 . 接入的愈伤组织有两种形态 : ( 1) 黄白 、 疏松 , ( 2)
绿色 、 紧密 , 有绿色团块 . 转入新培养基后 , 第 ( 1) 种形态的愈伤组织没有分化芽的能力 , 而后者
能分化出芽 .
狭叶锦鸡儿转入 36 种不同激素组合的培养基后愈伤组织 只在表 4所列的培养基中有芽的分
化 . 表中看出 , 生长素用 N A A 和 认A 都可以诱导分化 , 细胞分裂素以 KT 代替 6一 B A 诱导分化效
果不好 . 表中还可看出只有下胚轴的愈伤组织 (多数是带有子叶节的材料 ) 在新培养基上有分化 .
43 2
内 浪 古 大 学 学 报 0 1 9 9年
表3 两种植物外植体切段愈伤组织在长期继代培养中分化情况
a T. bl3 M. , 抽甲 n “ 妇心脚 n别沈 成 。山此 rI o n . eP lco t八 , 卜y , 洲” t少 .叻 . .户目湘 说 .C 创翻内两 . d
C
. 了六` , 恤 】佣十相口 . 功卜翔盆抽传
派律哭 狭叶铭鸡儿 黄侧条.,黔、攫` - .C 曲裁砂户 c. 介心留上胚轴 下胚轴 子 叶 上胚轴 下胚轴 子 叶印初作肠 h y P x ” ty 加 。以 y加匆 . 喇肋 t冲 b y拼心业y 匕 。 城 y肚心0 .
M S : 分化出芽 分化出根 分化出芽 分化出芽 分化出根
M S Z 七U山 忿O口恤 加山 bU dS 忿O O t日
M S : 分化出根
M S
心 r 0 0饱
分化出许多很
t弓洲〕臼
LS
. 分化出许多芽 分化出芽 分化出根 未
!
LS
, b Ud巨 b U山 它臼洲 . 统
LS
, 计
比刁 U n 己OU n t司
S H - 分化出芽 分化出芽 分化出报 5 个月后分化 5 个月后分化
S H艺 加鱿七 峨泊妞 出芽加 ds 出芽 加山
SH :
S H .
B场 y d曰 I 分化出芽 分化出许多芽 5 个月后分化 5 个月后分化
B肠对匕 . 加山 bU ds 出芽 加山 出芽 加山
石加 y do . 分化出芽和根 5 、 6个月后分化
几加 y d . ` 加山 助 d t o o t, 出芽 加山
分化出芽和许多根
b U山 助 d r 0 0 t日
第三期 高 玫等 几种野生豆科锦鸡儿属 (c ` 陌尸初F 的 r. )植物离休堵养过程中器官分化和内派植物激素含量的关系招 3
衰4 狭叶锦鸡儿的愈伤组织在诱导分化芽培并荃上分化情况
介城4 Bu l d dn` ofC .幽叼匆如c aU 山 如 m曰加 f o rbu dl n`
转人前所用培养墓 外植体来派 诱导分化培养荃 (M s 哪/ L)分化情况
示司帅 加丈。拍t ran山p 认t n记 , 。 u 了 c e of 饮川胡 它 m司】u m fo r d吐f亡 r即 t is t」o n d创笠. t e n t ar t l闭
B纽 dy se + N A A 0
.
5+ 6
一 B A 0
.
5 下胚轴+ 子叶节 I A A 0 . 0 1+ 6一 B A 3 不断分化出芽
M S + 2
,
4
一
D 0
.
5 + 6
一 B A 0
.
5 h yl ” co yt 臼 a 叻 n 《川e of c o t y led o朋 I A A 0 . 0 1+ K T 6 a 奴 成 加血
B协 y d es 十 N A A 0 . 5+ 6 一B A 0 . 5 下胚轴 L气A 0 . 5 + 6一 B A 3 不断分化出芽
S H + 2
,
4
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一 B A 0
.
5 h y侧义o t y 肠 N AA 0 . 5+ 6一 B A I a 】o t of b u ds
S H + N A A 0
.
5 + 6
一 B A 0
.
5 下胚轴+ 子叶节 N A A 0 . 5 + 6一 B A 3 不断分化出芽
M S + 2
,
4
一 D 0
.
5 + 6
一 B A I h y侧又 o yt 匕 a叻 n团 e o f o o t y lde o n , N A人 0。 5 + 6一 B A 6 a 10 ! o f b u ds
下胚轴+ 子叶节 分化出一个芽
b y p 洲为 , y卜 a耐 n冈 e o f 州 y 、de o sn on 玉y o n e b u d
下胚轴 不断分化出芽
h y户又 O t y IS 扭 】汉 o f b Uds
下胚轴十子叶节 .分化出一个芽
h y侧又 o t y肠 a dn n do e o f co r y l目 o sn o n ly o能 b u d
黄刺条愈伤组织在原培养基的继代培养过程中不断有芽的分化 , 但转入分化培养基后分化情
况不佳 , 只在 M S + 认A 0 . 1十 K T 3 组合中有芽分化 , 在 M S十 N A A 0 . 01 + K T I 组合中有根的分
化 .
总结狭叶锦鸡儿两种分化芽方式得出结论 : 生长素使用 N A A 和 认 A 比 2 , J 一 D 诱导分化芽效
果好 , 生长素用量在 0 . 01 ~ 0 . 5 m g / L 范围 , 超过这个范围效果不佳 . 细胞分裂素用 6一 B A 效果好 ,
用量在 0 . 5一 6 m s/ L 均能诱导分化 , 浓度高比浓度低诱导效果好 (见表 钓 .
总结黄刺条的两条发生芽途径看 , 与狭叶锦鸡儿不同 , 2 , 4一D , N A A 和 IA A 均可作为诱导芽
的生长素 , 并对生长素浓度要求较高 , N A A 为 2 m g / L 时 比 0 . 5 m g / L 诱导效果好 , 但对细胞分裂
素要求却低于常规 , 在 0 . 5 m g / L 时比 l , 3 或 6 m刁 L 分化效果都好 .
2
.
2
.
2 根的诱导 : 表 3 表明狭叶锦鸡儿和黄刺条分化出根的情况 . 狭叶锦鸡儿的下胚袖和子叶的
愈伤组织都有根的分化 , 它们都在含 2 , 4一D 的培养基中比含 N A A 的培养基中易分化根 , 可见 2 ,
4
一
D 有利于狭叶锦鸡儿的愈伤组织分化根 . 黄刺条幼茎和胚轴的愈伤组织都没有分化出根 . 只有
子叶在 M S 附加 N A A 0 . 5 m s / L , 6一 B A 0 . 5 m g / L 和 M S 附加 N A A 0 . 0 1 m g / L , K T 1 m s / L 培养基中
有根分化 , 与狭叶锦鸡儿不同 , N A A 诱导根的效果 比 2 , 4一 D 的好 . 柠条子叶的愈伤组织在 s H 附
加 N A A 2 0 9 / L , 6一 BA 0 . 5 m g / L 培养基中有根分化 ·
三种植物的子叶都比较容易诱导根的分化 .
我们对已成苗的材料进行了诱导生根试验 , 按通常组织培养中芽诱导生根的经验 , 采用 M S
的巧大量 、 微量元素 , 兄糖 , , 附加 N A A 和 6一B A 或不使用激素的培养基 , 经几代培养后狭叶锦鸡
儿在含兄sM + eF 的基本培养基上和兄M s + eF 十 N从 0 . 2 m g / L 的培养基上从丛生苗基部分出根 ,
形成小植株 . (图版 6)
2
.
3 内源生长素含里和细胞分裂素活性的测定
2
.
3
.
1
` 内源生长素含量的测定 : .从我们测定的色谱图上发现 (见图 6 , 7) 每个样品在 IA 人 峰前相
距大约 0 . 3分钟处都有一个较大的峰 , 根据 L . eB dn er .tJ 用同位素标记结果发现在 I A A 蜂的周围有
内 泉 古 大 学 学 报1 90 9年
五种含叫噪环的化合物 , 其中一种 : : 含 t 比 LAA 的高 . : , 与 认 A 两峰保留时间差相近 . 据此以 :
和 L八A 的含量之和来代表内源生长素的含 t . 三种植物的无分化愈伤组织和具分化能力的愈伤组
织内源 L入A 含量如表 .5
5 10 15 20 m i n 5 10
·
15 RE T E N T 10 N T IM E ( m i n )
图 6 标准样品色谱图 图 7 狭叶锦鸡儿愈伤组织时期样品色谱图
① 标准 I A A 峰 : 面积 : 12一8 9 8 2 时间 : 1 6. 8 4 5 ① I A A 峰 : 面积 : 15 5 2 时间 : 1 6 . 8刁2
② 5一 Br o m 一 I A A 峰 : 面积 : 刁5月55 7 时间 ; 18 . 7 8 7 ② 5一 B r o m 一 I A ^ 峰 : 面积 : 4 2 6 1 7 8 时间 : 一8 . 7 5 7
横坐标 : 保留时间 (分 ) ③ x 峰 : 面积 : l心7 38 8 时间 : 16 · 5
纵坐标 : 检测器反应值 横坐标 : 保留时间 (分 )
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·
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a t帷 r a ph y o f s at n da r d sa m沁 纵坐标 : 检测器反应值
1
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.
2 内源细胞分裂 素的活性 测定 : 结果 见表 5 . 表 5 中数据是 由在含 有 0 . IP p m 激动素 的
N L 3田〕培养基 中生长 21 天的胡萝 卜离体根每块材料的平均细胞数 目与生长于前述激动素提取物
的培养基中的每块材料的平均细胞数目比较而来 .
表 5 三种植物不同发育阶段的愈伤组织内源激紊含 t :
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o g e n o朋 . u x ln o n d e州。日 n ln con . e n . o f 玄w o d e v d叩耐川公 s . a go o f ca l u s In .h r e Pl . n st蒸燕樱 柠 条 狭叶祝鸡儿 黄朝条of bo r口冲比国 .c 翻, 曲汕目 .C 月助姆神户 C卜矛八幽叮
、戴浑墨~ _ ! 人人 C yt I^ ^ / C y t 】人人 C厂 I人人 / C yt L入A C界 卫人人 / C尹
. 脱分化愈伤组织时期 37 2 0 1 2。 4 8 3 0 4 / 1 12 8 0 1 13。 3 :厂: 5 1 2 0 2 7 。 8 18 4 一 ld倒吐 fe 犷侣n t协 t目 。 山
分化芽阶段 4 4 0 2 4 6。 8 2 . 1 4 4 3 0 1 4 2.6 3 3 : 1
山扛 . r . n t肠 tde 口川
第三期 高 玫等 几种野生豆科锦鸡儿属 ( 〔初恻冲目 a b Fr
.
) 植物离体培养过程中器官分化和 内滚植物激素含量的关系 45 3
3讨 论
3
.
1激素对愈伤组织形成及分化的影响和内外源激素的相互关系
2
,
4一D 作为诱导脱分化的生长素早已有人提出。 月 , 并得到大量证实 .st 一川 . 本文所研究的三种
锦鸡儿属植物也证明了这一结论 . 通常认为在诱导愈伤组织中生长素的作用 比细胞分裂素的作用
重要 , 后者含量过高 (超过 5 P m ) 对愈伤组织生长有一定的抑制作用图 . 但柠条的试验结果却与
此不符 · 较低浓度的生长素和较高浓度的细胞分卑素对愈伤组织生长有利 , 这可能与它的内源激
素水平有一定的关系 . 从内源激素测定结果发现 , 柠条愈伤组织的内源生长素相对含量较高 , 而
细胞分裂素相对含量较低 认 A / yC t 的比值接近 3 0 0 / 1 , 比其它两种植物愈伤组织内的 认 A /仰 t . 比
值大得多 (如表 5) . 我们认为由于这个原因 , 所以在柠条组织培养中需求的外源细胞分裂素浓度
比生长素要大得多 .
关于生长素和细胞分裂素对分化的影响 , 早在五十年代 s ko og 和 iM l er 就提出芽和根的形成
主要受生长素和激动素两类物质之间相互作用的调节的概念 , 认为较高浓度的生长素利于根的形
成而抑制芽的形成 ; 相反 , 较高浓度的激动素则促进芽的形成而抑制根的形成 lt[ 〕 . 狭叶锦鸡儿外
植体芽的分化符合这个理论 . 但柠条外植体的愈伤组织用常规诱导方法很难诱导出分化 , 这可能
也是由于它的内源生长素 /细胞分裂素的比值过高所致 , 这还有待于深入研究 . 黄刺条外植体芽
的发生与常规诱导方法截然不同 , 它对生长素浓度的要求高 , 而对细胞分裂素的要求低 . 这可能
也与植物本身的内源激素水平有直接的关系 . 由测定结果看出狭叶锦鸡儿和黄刺条两种植物的愈
伤组织在从脱分化阶段向分化阶段发育过程中内源激素水平发生了很大的转变 , 在愈伤组织阶段
L A A / yC t 比值很高 , 但两种植物在分化期的愈伤组织中这个比值均降为 3一 2/ 1 . 狭叶锦鸡儿的愈
伤组织阶段 认 A / C yt . 比值比黄刺条小得多 . 前者更接近分化期的比值 , 这可能是它 用常规方法
易于诱导器官分化而黄刺条难诱导的原因 . 黄刺条具有分化芽能力的愈伤组织中的内源细胞分裂
素的含量与其它两种植脚相比急剧增加 , 可能 在分化阶段愈伤组织细胞内部合成细胞分裂素系
统活动强烈 , 合成大量细胞分裂素 , 因此对外源细胞分裂素需求量不大 , 而且由于细胞分裂素很
高 , 为了维持较恒定的生长素 /细胞分裂素的比值 , 则需要较多的外源生长素 . 这一推测还有待于
进一步研究证明 .
3
.
2 关于揭变问题
豆科植物在组织培养过程中常常发生褐变现象 , 致使组织培养无法正常进行继代培养 . 一般
认为褐变是由于组织中多酚氧化酶被激活 , 使细胞 中的代谢发生变化所致 . 酚类物质被氧化后产
生棕褐色的酿类物质 , 它们逐渐扩散到培养基中 , 抑制其它酶的活性 , 毒害整个外植体 , 使之不
能正常生长分化 . 唐惕在蚕豆培养川及 K u m ar 在木豆培养中a[] 均碰到了此类难题 .
我们曾采用一些方法企图解决培养过程中的褐变问题 :
( 1) 采用唐惕所述方法川 , 用培养液或无菌水多次冲洗柠条外植体切段的伤口 , 减低酚类物
质的褐变作用 , 但效果不明显 .
( 2) 采用在愈伤组织褐变前及时进行继代培养 , 此种方法只能稍微减轻 , 但不能根本解决褐
变问题 .
( 3) 加入一些抗氧化物质如抗坏血酸 (2 m s/ L ) 、 半耽氨酸 (2 m s/ )L 、 谷脱甘肤 (2 m s/ )L 或活性
炭 (0 . s s/ )L , 但继代培养后愈伤组织仍褐变 ·
虽然我们没有能够很好地解决愈伤组织在培养过程中的褐变问题 , 但是我们发现柠条愈伤组
内 泉 古 大 学 学 报 19 90 年
织在s H 培养基上的褐变速度远比在含有较高浓度无机盐类的M S和L S培养基上要慢 , 其原因之
一可能是柠条本身酚类物质的含最及多酚氧化酶的活性高 , 而高浓度的无机盐会引起外植体酚类
物质的氧化 [’1 , 原因之二可能是由于 MS ( LS )培养基的硝酸钾与销酸钱的浓度高 , 人
.
s
.
K u m ar .1[ 认
为这两种物质浓度高可能是引起过早产生酚类物质的原因 .
狭叶锦鸡儿与黄刺条两种植物的愈伤组织在比 和 sM 培养基上一直生长很好 , 不发生褐化 ,
这可能是由于植物组织本身酚类物质含量及多酚氧化酶的活性低 , 再加上它们在这两种培养基上
细胞大量增殖 , 酚类的氧化受到抑制.1[ , 而在 s H 培养基上由于无机盐含量及氮的含量不能满足
快速生长的要求 , 使细胞增殖慢 , 酚的氧化作用加强 . 这也反映了这三种锦鸡儿属植物不同的生
态条件对它们在个体发育上的影响 .
4 结 论
在三种不同生态环境中生长的锦鸡属植物幼苗的不同外植体在体外培养中均可由外植体直接
诱导不定芽形成 , 但从脱分化的愈伤组织中诱导器官分化却表现不同 , 狭叶锦鸡儿和黄刺条较容
易诱导 , 而生长在环境比较恶劣的荒漠或草原化荒漠中的柠条却很难 . 对于狭叶锦鸡儿幼苗外植
体的愈伤组织可采用常规方法诱导不定芽的形成 , 但黄刺条则不同 , 需要采用较高浓度的生长素
与较低浓度的细胞分裂素的配比才容易诱导形成不定芽 . 对它们的内源激素测定发现黄刺条分化
期的愈伤组织内源生长素和细胞分裂素相对含量均很高 , 但细胞分裂素的含量比在未分化的愈伤
组织中的含量高得很多 (约为 53 倍 ) , 狭叶锦鸡儿的内源细胞分裂素却只是未分化期的二倍左右 ,
这可能是二种植物的外植体在器官分化时对外源激素要求不同的原因 .
内源激素测定结果表 明 , 未分化的愈伤组织中生长素 /细胞分裂素 比值较高 , 而处于分化期
的愈伤组织中这个比值比前个时期降低很多 . 进一步证明了愈伤组织时期生长素起决定作用 , 而
分化芽时期细胞分裂素更重要些的一般规律 .
参 考 文 献
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第三期 高 玫等 几种野生豆科锦鸡儿属( ` 叮呜四. Fa br. )植物离休培养过程中器官分化和内撅植物激索含且的关翩3 7
R e la t io n s h iPe bt we e n O r ga no ge ne s ia s n d n Ed
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lP a n ts o f C面,。卯加 aF b r . ( eL g u m in osa e ) 一C . 兀汾劝自诚落, C . 砚如即勺而 a n d C . 介以以 . R o o st w e r e in d u e ed
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e n o u s a u x in an d e y t o k in in s in o r g an o g
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e e n t r a t io n o f fr e e IA人 a n d e y to k in in a e t iv i ty i n tw o d i f fe r e n t d e v e l o Pm e n ta l s ta g es 一 u n d i f f r e n t ia t e d a n d
d i f f e r e n t ia t ed ca ll
u s o f t h r e e P l a n tS w e r e d e te e t e d
.
T h e r es u l t r e v e a l e d th a t t h e e n d o g e n o u s h o r m o n e s y s t e m
w as r e m a k a bl e id f fe r e n t in t w o s t a g es
.
K e y w o r ds o r阶 n o ge n es is , e n d o se n o u s Pl a n t h o r m o n e co n t en t ; 已汁口卯朋 凡 b r
附图说明 (见播页 1)
1
.
3 培养 15 天的柠条下胚轴切段 x 峨, 2 培养 15 天的柠条上胚轴切段 x 刁; 4 黄刺条愈伤组织分化出芽 , 有些
芽已长成苗义 4 ; 5 图 4放大示芽丫 9 . 1 , 6 狭叶锦鸡儿丛生苗诱导出根形成小植株 ; A . 外植体 B . 芽或苗
C
. 愈伤组织 D , 根
E %口a n a l乞on 01 th e P场吸es ( S e e A p叶n d l l )
P场 t e l , 3 15一血y 一。 d1 列 t u r e o f h y 户又 o ty l s es m e n st of C . k o sr hi ms 幻 1 4 X ;
P扭 t c 2 1 5一血 y一 ld c u lut r e o f 七 P i以 y l eS s m e n st o f C . ko 巧hi 璐劝 4 X
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