全 文 ：1997-01-31收稿。
* 国家自然科学基金资助项目部分内容。
华北农学报 1998, 13(2) : 122～ 126
Acta Ag ricul tu rae Boreali-Sinica
用过氧化物酶同工酶对中国葡萄属野生种
分类和亲缘关系的研究*
马之胜　　　　　　　　　　　　贺普超
(河北省石家庄果树研究所 ,石家庄　 050061)　　　　 (西北农业大学园艺系 ,陕西杨陵　 712100)
摘　要　用聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE)对我国葡萄属 (Vitis) 12个野生种和变种进行了过氧化
物酶 ( POD)同工酶的研究。结果如下: 绘制了葡萄属的基本酶谱 ,共分离出 35条酶带 ,用过氧化物
酶同工酶酶谱可把供试材料分为三组。 综合同工酶谱和聚类分析的结果 ,认为刺葡萄、秋葡萄、复
叶葡萄 、瘤枝葡萄和华东葡萄是葡萄属中较原始的类型 ,山葡萄、燕山葡萄、 和麦黄葡萄是较
进化的类型 ,种的分组与进化和地理分布有关。
关键词　葡萄属　过氧化物酶同工酶　基本酶谱　聚类分析
我国是葡萄属植物最重要的原产地之一 [ 1] ,种类多 ,分布广 ,具有抗寒、抗真菌病害等许多宝贵
性状 [2～ 4 ]。一些研究者对我国葡萄属植物进行过一些分类和亲缘关系的探讨 [5 ] ,但还存在某些争论
和不明确的地方。本研究的主要目的是利用过氧化物酶同工酶分析的方法 ,对起源于我国的一些葡
萄属野生种进行分类 ,并探讨它们之间的亲缘关系 ,为有效地利用这些资源提供依据。
1　材料和方法
1. 1　材料
供试材料取自西北农业大学野生葡萄种质资源圃 ,共 12个种和变种的 76个株系 ,所有种
类为 8～ 10年生嫁接苗 ,砧木为欧洲种。各供试材料的种名及株系数如下 (秦巴野葡萄和麦黄
葡萄是未定名的野生种 )。
刺葡萄 ( V. dav idii ( Roman) Fo ex. ): 7个株系 ;复叶葡萄 ( V. piasezkii Maxim. ): 11个株系;
秋葡萄 ( V. romanetii Roman. ): 9个株系 ;瘤枝葡萄 (V . davidii va r. cyanocarpa( Gang. ) Sa rg. ):
3个株系;华东葡萄 ( V. pseudoreticulata W. T. Wang ): 7个株系 ;毛葡萄 (V . quinquangularis Re-
hd. ): 12个株系;秦巴野葡萄 ( V . ssp): 9个株系;华北葡萄 (V .bryoniifol ia Bunge. ): 3个株系;山
葡萄 ( V . amurensis Rupr. ): 3个株系; 葡萄 ( V .adstricta Hance. ): 3个株系; 麦黄葡萄
(V . ssp): 7个株系;燕山葡萄 ( V. yeshanensis ): 2个株系。
1. 2　方法
1. 2. 1　样品制备　供试样品均用 pH8. 0的 Tris-HCl缓冲液。具体方法是:进行过氧化物酶
同工酶基本酶谱研究时 ,采集不同发育时期的叶片、枝条皮层、卷须、叶柄、花蕾、果实等器官 ;
进行分类和亲缘关系研究时 ,只采集生长健壮的功能叶片。采后用蒸馏水冲洗数次 ,滤纸吸干 ,
然后称取 1g ,加入 2m l样品提取液 ,在冰冻研钵上研至匀浆 ,四层纱布过滤 ,滤液于 5 000rpm
室温离心 10min,取上清液备用。
1. 2. 2.　采用聚丙烯酰胺不连续垂直板凝胶电泳　分离胶浓度为 7. 2% , pH8. 9,浓缩胶浓度
为 4. 0% , pH6. 7,电极缓冲液为 Tris-甘氨酸系统 , pH8. 3。稳压 220V ,电流为 40～ 20m A, 4℃
冰箱中电泳约 6h。
图 1　葡萄属野生种过氧化物酶酶带和基本酶谱
1.刺葡萄 ; 2. 秋葡萄 ; 3— 1～ 4.复叶葡萄 ; 4.麦黄葡萄 ; 5. 华东葡萄 ;
6.瘤枝葡萄 ; 7— 1, 2.华北葡萄 ; 8— 1, 2.毛葡萄 ; 9— 1, 2. 葡萄 ;
10. 山葡萄 ; 11— 1, 2.秦巴野葡萄 ; 12燕山葡萄。
1. 2. 3　同工酶在凝胶上的显现
　采用联苯胺 -过氧化氢系统。
1. 2. 4　电泳资料的统计分析　
相对迁移率 ( Rf )参照 Kuhns[6 ]的
方法计算 ;标准遗传距离参考
M. Nei
[7 ]的方法 ;依遗传距离用最
短距离法进行模糊聚类分析 ,绘
制动态聚类图。
2　结果与分析
2. 1　葡萄属过氧化物酶 ( POD)
同工酶的基本酶谱
通过对葡萄属 12个种和变
种不同的发育时期的叶片、枝条
皮层、卷须、叶柄、花蕾、果实等器
官进行跟踪生育期 POD同工酶
分析 ,经酶谱叠加 ,共得到 35条
酶带 ,即为葡萄属 POD同工酶的
基本酶谱 ,这是在所有葡萄同工
酶报道中分离出酶带数量最多
的。自负极端依次编号为 P1、 P2
…… P35。依酶带 Rf值大小、活性
及稳定性 ,将基本酶谱分为 6个区 (图 1)。 Ⅰ区 Rf范围 0. 044～ 0. 250,酶带分离不清晰 ;Ⅱ区
Rf范围 0. 291～ 0. 375,酶带活性较高 ;Ⅲ区 Rf范围 0. 400～ 0. 458,酶带活性较弱 ;Ⅳ区 Rf范
围 0. 500～ 0. 708,酶带分离清晰 ,活性强 ,其中 P21和 P24为两条活性极高又较宽的酶带 ;Ⅴ区
Rf范围 0. 740～ 0. 825,酶带分离不清晰 ;Ⅵ 区 Rf范围 0. 850～ 0. 916,酶带分离清晰 ,活性较
高 ,该区的 P32、 P33和 P34三酶带在所有种类、变种中均有且清晰可见 ,为葡萄属过氧化物酶同
工酶的特征酶带。
试验中发现 ,葡萄属的功能叶片中酶带最丰富 ,它包含了枝条皮层、叶柄、卷须、花蕾、果实
1232期 马之胜等:用过氧化物酶同工酶对中国葡萄属野生种分类和亲缘关系的研究
中的所有酶带 ,因此 ,在进行分类研究时只用功能叶片即可。
2. 2　葡萄属种内的同工酶差异
从图 1可以看出 ,葡萄属种内的过氧化物酶同工酶差异表现在酶带的数量和活性上 ,根据
此特点 ,把一些野生种内不同株系加以分组 (表 1)。由表 1可以看出 ,复叶葡萄株系之间差异
最大 ,华东葡萄、秋葡萄和刺葡萄次之 ,毛葡萄株系之间差异最小。 差异大说明种内的“多型
性”强 ,反之说明“多型性”差。试验中还发现属于不同种的个体 ,它们的酶谱却又相似的事实 ,
这说明种间种内的酶谱是极为复杂的 ,同时也反映出种内个体的分化和种间关联。
表 1过氧化物酶同工酶
对几个葡萄野生种种内分组
种 类 株系数 分 组 种 类 株系数 分 组
复叶葡萄 11 11 麦黄葡萄 7 3
华东葡萄 6 4 秦巴野葡萄 9 3
秋 葡 萄 9 5 毛 葡 萄 12 2
刺 葡 萄 7 4
2. 3　用过氧化物酶同工酶酶谱对供试材料分类
根据电泳酶谱结果 ,难于把每个供试种类单
独分开 ,依同工酶酶谱类型和酶带的活性 ,可把供
试材料分为以下三组:
第一组: 刺葡萄、秋葡萄、复叶葡萄、瘤枝葡萄
和华东葡萄。该组酶带丰富 ,酶谱类型多 ,均有 P21
和 P24两条酶带。
第二组: 华北葡萄、毛葡萄、麦黄葡萄、秦巴野
葡萄和 葡萄。 该组酶带较丰富 ,均不具有 P21和 P24两条酶带。
第三组: 山葡萄、燕山葡萄。 该组酶带少 ,其中少部分株系有 P21和 P24两条酶带。
第一组主要分布于华中、华东地区 ,有的延伸到华南、西南和西北地区 ;第二组主要分布于
华北、西北地区 ;第三组主要分布于东北、华北地区。 由此可见 ,组的划分与地理分布有关。
2. 4　葡萄属种间的亲缘关系
2. 4. 1　酶带表型频率　各酶带表型频率的差异形成了种间酶谱的差异。有些酶带在某些种内
有较高的表型频率 ,而在另一些种中则表现较低 ,甚至不表现。如 P35酶带除了在麦黄葡萄和
葡萄中不表现 ,在山葡萄中表型频率相对较低外 ,在其它供试种类中均有很高的表型频率。
P9、 P20、 P22和 P25酶带在瘤枝葡萄中没有显现 ,在其它种中表型频率都较高。其它酶带也有类似
情况。
2. 4. 2　标准遗传距离　依 N ei氏方法计算的标准遗传距离见表 2。标准遗传距离能反映葡萄
属种间的遗传差异和亲缘关系 ,遗传距离越大 ,亲缘关系越远 ,反之 ,遗传距离越小 ,亲缘关系
越近。 葡萄属种间的遗传距离大都集中于 0. 0400～ 0. 2500之间 ,说明其种间亲缘关系是很近
的。但不同种间的遗传距离差异也很大 ,秋葡萄和刺葡萄的遗传距离最小 ( 0. 0466) , 葡萄
和瘤枝葡萄的遗传距离最大 ( 0. 4698) ,两者相差近 12倍 ,这又说明 ,葡萄属植物种的分化历史
是比较远的。
2. 4. 3　模糊聚类分析　为了更好了解葡萄属种间的分类和亲缘关系 ,按最短距离法进行聚
类 ,得到葡萄属野生种动态聚类图 (图 2)。 从图中可以看出: ( 1)刺葡萄、秋葡萄、复叶葡萄、瘤
枝葡萄、华东葡萄和华北葡萄六者亲缘关系较近 ,而与其它一些种的亲缘关系较远。( 2)图 2中
从左到右基本上是葡萄属野生种地理分布的情况 ,左边的几个种分布于东北、西北和华北地
区 ,右边的几个种、变种主要分布于华中、华南和西南地区 ,有的延伸到西北地区 ,中部的几个
种主要分布于西北和华北地区 ,这说明种、变种的亲缘关系与地理分布有关。
124 华　北　农　学　报 13卷
表 2　葡萄属种间标准遗传距离
种类 ( 1) ( 2) ( 3) ( 4) ( 5) ( 6) ( 7) ( 8) ( 9) ( 10) ( 11) ( 12)
( 1)刺葡萄 0
( 2)秋葡萄 0. 0466 0
( 3)复叶葡萄 0. 0542 0. 0651 0
( 4)瘤枝葡萄 0. 1319 0. 1004 0. 0919 0
( 5)华东葡萄 0. 1415 0. 1034 0. 0953 0. 1248 0
( 6)华北葡萄 0. 1479 0. 1343 0. 1191 0. 2241 0. 0607 0
( 7)秦巴野葡萄 0. 1410 0. 1669 0. 1712 0. 3472 0. 2331 0. 1006 0
( 8)毛葡萄 0. 2147 0. 2283 0. 1993 0. 3583 0. 1594 0. 1167 0. 1070 0
( 9)燕山葡萄 0. 1352 0. 1227 0. 1338 0. 2337 0. 1233 0. 1966 0. 2298 0. 3373 0
( 10)麦黄葡萄 0. 1491 0. 1365 0. 1546 0. 3000 0. 2027 0. 1253 0. 1286 0. 1450 0. 2374 0
( 11) 葡萄 0. 2510 0. 3309 0. 2519 0. 4698 0. 2874 0. 1989 0. 1628 0. 2284 0. 2615 0. 1435 0
( 12)山葡萄 0. 1930 0. 2524 0. 2886 0. 3400 0. 1768 0. 2209 0. 1849 0. 2214 0. 3221 0. 1705 0. 1818 0
图 2　中国葡萄属野生种动态聚类图
　　依据同工酶进化理论 ,结合同工酶谱和聚类
分析的结果 ,认为刺葡萄、秋葡萄、复叶葡萄、瘤枝
葡萄、华东葡萄是葡萄属较为原始的类型 ,山葡
萄、燕山葡萄、 和麦黄葡萄为较进化的种。
3　结论与讨论
本试验分离出葡萄属过氧化物酶同工酶带
35条 ,这是在所有葡萄属同工酶报道中最多的 ,
绘制了基本酶谱 ,其中 P32、 P33、 P34为葡萄属的特
征酶带。基本酶谱的绘制有助于从整体上把握葡
萄属的酶谱特点。
葡萄属不同的种具有明显的种内“多型性” ,
复叶葡萄的“多型性”最明显 ,华东葡萄、刺葡萄、
秋葡萄等次之 ,毛葡萄最不明显 ,同时 ,不同种间
的株系酶谱又互相交叉 ,这意味着种内的分化和
种间的关联。
过氧化物酶同工酶是进行葡萄属野生种分类的亲缘关系研究较为理想的酶系。葡萄属种
间差异大于种内差异。 用过氧化物酶同工酶酶谱不能把供试的种类都单个分开 ,只能分为三
组 ,组的划分与地理分布有关。 葡萄属种间 Nei氏标准遗传距离较小 ,说明葡萄属野生种间亲
缘关系是很近的。
刺葡萄、秋葡萄、复叶葡萄、瘤枝葡萄和华东葡萄是葡萄属中较原始的类型 ,山葡萄、燕山
1252期 马之胜等:用过氧化物酶同工酶对中国葡萄属野生种分类和亲缘关系的研究
葡萄、 葡萄和麦黄葡萄是较进化的类型。种的亲缘关系与地理分布有关。
参 考 文 献
1　左大勋 ,袁小苇 .我国葡萄属植物资源的地理分布及利用 .见:南京中山植物园论文集 .南京:江苏科技出版
社 , 1981, 25～ 31
2　贺普超 ,牛立新 .我国葡萄属野生种抗寒性的研究 .园艺学报 , 1989, 16( 2): 81～ 88
3　贺普超 ,王国英 .我国葡萄属野生种霜霉病抗性的调查研究 .园艺学报 , 1986, 13( 1): 17～ 24
4　贺普超 ,王跃进 .中国葡萄属野生种抗白腐病的鉴定研究 .中国果树 , 1988, ( 1): 5～ 8
5　晁无疾 ,袁志发 .我国葡萄属植物分类和亲缘关系的探讨 .西北农业大学学报 , 1990, 18( 2): 7～ 11
6　 Kuhns L J, e t a l. Distingushing rose cultiv ar s by polyac ry tamide gel electr ophor esis　 I. Ex traction and
sto rag e of pro tein and ac tive enzymes fr om rise leaves. J Amer Sci, 1978, 103( 4): 503～ 508
7　 Nei M. Mo lecular Popula tion Gene tics and Evo lution. New Yo rk: Academic Press, 1975, 86
A Study on the Taxonomy and Relationship of Wild Vitis
Native to China with POD Isozyme
Ma Zhisheng
( Shijia zhuang Pomo lo gy Institute, Hebei Academy o f Ag ricultur al and Fo rest ry Sciences, Shijiazhuang 050061)
He Puchao
( No r thw estern Ag ricultural Univ ersity, Yang ling 712100)
Abstract　 Peroxidase ( POD) w as used tog ether wi th po lyacrylamide gel electrophoresis
( PAGE) in the tests of 76 clone of 12 w ild vi tis species and varieties nativ e to China. The re-
sul ts are as fo llow s: ① A basic zymog ram of POD isozyme was drow n ba sed on functiona l
leaves of vi tis , and 35 iso-POD bands w ere found in the zymog ram. ② 12 species and va rieties
w ere divided into 3 g roups on the basis of the POD iso zyme zymog ram.③ The analy sis o f the
isozyme zymog ram and the cluster analysis suggested tha t V . davidii , V. romanet ii , V .
piasezk ii and V . psedoret iculata belonged to the primitiv e categ ory , and V. amurensis , V .
yeshanensis and V . adstricta evolutional categ ory.④ The g rouping and evolution of species
w as related to thei r g eographical dist ribution.
Key words:　Vitis; Peroxidase ( POD) ; Iso zyme; Ba sic zymog ram; Cluster analysis
126 华　北　农　学　报 13卷