全 文 ：� 3629 �中华中医药杂志(原中国医药学报)2013年 12 月第28卷第12期 CJTCMP , December 2013, Vol .28, No. 12
阿魏属4种药用植物总DNA提取方法比较
盛萍1,2，苗莉娟1，姚蓝1,2，王飒1
（1新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，乌鲁木齐 830011；2新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 830011 )
摘要：目的：对阿魏属4种药用植物基因组总DNA提取方法进行比较，建立阿魏属药用植物总DNA的最佳
提取方法，为下游分子生物学实验提供依据。方法：利用3种不同的DNA提取方法提取阿魏属4种药用植物的总
DNA；用核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳方法检测所得总DNA的浓度和纯度；用ISSR分子标记的方法检测所得
总DNA的质量。结果：试剂盒法提取的总DNA纯度最高，质量最好，能够将所有样品扩增出丰富而清晰的条带。
所需时间短，操作简单。改良的CTAB法与SDS法提取的总DNA纯度及质量均次于试剂盒法，所需时间长，操作复
杂。结论：试剂盒法为提取阿魏属4种药用植物总DNA的最佳方法，能够直接用于下游分子生物学实验。
关键词： 阿魏属； DNA提取方法；ISSR
基金资助：国家自然科学基金（No.81060364），新疆自治区重点学科（No.XYDXK50780338），新疆自治区
名医名方与特色方剂学重点实验室（No.XJDX0910-2009-13），新疆自治区高校科研基金（No.XJEDU2009S57）
Comparative research on genomic DNA extraction methods from four traditional
medicine, belongs to the genus Ferula
SHENG Ping1,2, MIAO Li-juan1, YAO Lan1,2, WANG Sa1
( 1Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formulae, Urumqi 830011, China; 2School of Traditional
Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China )
Abstract: Objective: For providing the basis for downstream molecular biology experiments, to determine the optima
extraction method of genomic DNA from four traditional medicine, which belong to the genus Ferula by comparing the diff erent
extraction methods, genomic DNA Kit method, the improved CTAB method and improved SDS method. Methods: Genomic DNA
was extracted by three diff erent methods and the purity and concentration of DNA were compared by UV and gel electrophoresis.
The qualities of DNA were analyzed by ISSR. Results: Genomic DNA Kit method was higher than the improved CTAB method
and improved SDS method with more quality, more clear bands, shorter time and more simple operation. Conclusion: Genomic
DNA Kit method is the optimal method for plant medicines which belonged to the genus ferula and can be used directly in
downstream molecular biology experiments.
Key words: Ferula; DNA extraction methods; ISSR
Fund assistance: National Natural Science Foundation of China (No.81060364), Key Disciplines of Xinjiang
Autonomous Region (No.XYDXK50780338), Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formulae of
Xinjiang Province (No.XJDX0910-2009-13), Higher Education Scientific and Research Fund of Xinjiang Municipality
(No.XJEDU2009S57)
通讯作者： 盛萍，乌鲁木齐市新医路393号新疆医科大学中医学院中药资源教研室，邮编：830011，电话： 0991-4362253
E-mail：xjsphwy@163.com
·研究报告·
伞形科阿魏属全世界约有150余种，主要分布在欧洲南部
地中海地区和非洲北部，还有伊朗、阿富汗、苏联及印度、巴
基斯坦等地。我国有26种1变种，产于新疆的有21种[1]。药用阿
魏种类较多，其中，新疆阿魏Ferula sinkiangensis和阜康阿魏
F. fukanensis收载于《中华人民共和国药典》中，其药用部位为
根或油胶树脂，作为中药阿魏在全国使用。主要用于治疗肉食
积滞，瘀血痞块，虫积腹痛等症[2]。维吾尔医用来驱虫、治疗白
癜风。阿魏中还有一些药用植物，如多伞阿魏[F. ferulaenides
（Steud.）Kornv.]在新疆民间用作中药阿魏的代用品[3]。
阿魏属药用植物植株外部形态较相似，仅靠植物外部形
态、传统性状和显微鉴别方法不易解决分类学上的问题，需要
引入一种更先进的、科学的、稳定的分子标记技术来开展阿魏
属药用植物研究成了当务之急。目前阿魏属药用植物DNA分子
标记技术在国内外未有相关报道，其中，如何有效地提取高质
量的植物DNA是进行任何分子生物学工作的前提和基础，也
是最关键的一步[4-5]。因此本试验旨在建立阿魏属药用植物总
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DNA提取方法，探索如何提取高质量的植物总DNA，将为阿魏
属药用植物的种类鉴定提供分子生物学理论依据。
材料
1. 药材 试验材料于2011年5月从新疆不同产地采集，由
新疆医科大学中医学院中药资源教研室盛萍教授鉴定，其种
类、产地及编号，见表1。
2. DNA的检测方法
2.1 核酸蛋白测定仪浓度测定 分别取1μL上述3种方法提
取的基因组DNA，用核酸蛋白测定仪测定总DNA的浓度以及计
算A260/A280比值。
2.2 总DNA电泳检测 分别取300ng与1μL 6×Loading
Buffer混匀。用1%的琼脂糖凝胶（含0.5μL/mL EB）进行电泳检
测，于凝胶成像系统下检测和拍照。
2.3 ISSR-PCR分析 所用引物参照加拿大哥伦比亚大学
公布的第9套ISSR引物序列由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。从20条ISSR引物中筛选出3条带型丰富的作为扩增
引物，分别为881（序列GGG TGG GGT GGG GTG），866（序列
CTC CTC CTC CTC CTC CTC），822（序列TCT CTC TCT CTC
TCT CA）。PCR反应体系为50μL，组分浓度分别为34.65μL
ddH2O、5μL 10×Taq Buffer、2.5mmol/L Mg2+、0.4mmol/L dNTP
0.6μmol Primer、1.75 U Taq Polymerase和50ng模板DNA。反应
程序为：95℃预变性7min，95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延
伸90s，45个循环，72℃延伸10min。4℃保存。PCR产物在2%琼
脂糖凝胶中电泳55min，凝胶成像系统中拍照。
结果
1. 核酸蛋白测定仪检测不同的提取方法对提纯DNA效果
的影响 见表2。从阿魏属4种药用植物总DNA提取方法所得
A260/A280比值及浓度可知，提取的DNA纯度：试剂盒法>改良
SDS法>改良CTAB法。总DNA浓度：改良SDS法>改良CTAB法>
试剂盒法。
表1 阿魏属4种药用植物材料种类及来源信息表
样品号 种 类 采集地 采集时间
1 多伞阿魏 Ferula ferulaeoides（Steud.）Korov. 新疆沙湾县 2011.5
2 多伞阿魏 F. ferulaeoides（Steud.）Korov. 新疆清河县 2011.5
3 准噶尔阿魏 F. songorica Pall.ex Spreng. 新疆额敏县 2011.5
4 新疆阿魏 F. sinkiangensis K.Mshen. 新疆伊宁县 2008.5
5 托里阿魏 F. krylovii Korov. 新疆托里县 2011.5
2 . 试剂 北京天根生产的Plant G enom ic DNA K i t
（TIANGEN BIOTECH）（离心柱型）试剂盒。改良的十六烷
基三甲基溴化铵（CTAB）提取缓冲液。改良的十二烷基硫酸钠
（SDS）提取缓冲液。
方法
1. 总DNA提取方法
1.1 天根离心柱型试剂盒法 本实验采用北京天根生产的
Plant Genomic DNA Kit（TIANGEN BIOTECH）（离心柱型）试
剂盒。DNA提取步骤按其试剂盒提供的方法进行。为提高DNA
的得率，用80μL洗脱缓冲液洗脱2次（将第1次洗脱后的溶液
重复利用）。
1.2 改良CTAB ①在1.5mL离心管管中加入1.2mL改良
的CTAB提取缓冲液，于恒温水浴锅中65℃提前预热30min；
②用钥匙称取约0.1g植物样本（叶片）置于液氮预冷的研钵
中，迅速加入液氮充分研磨至极细的粉末，将研磨好的样
品迅速转移至65℃预热的离心管中（需提前加入1%β-巯基
乙醇），迅速颠倒充分混匀；③于65℃恒温孵育45min，每隔
5-10min颠倒混匀；④ 取出离心管，冷却至室温，12 000r/min，
离心15min；⑤小心吸取上清液加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇
（V/V/V=25:24:1），充分混匀，12 000r/min离心5min。⑥小心
吸取上清液至另一干净灭菌离心管中，加入氯仿/异戊醇（V/
V=24:1），充分混匀，12 000r/min离心5min。重复此步骤；⑦
小心将上清液转移至新的离心管中，加入2.5倍预冷的无水
乙醇，-20℃放置30min，12 000r/min离心5min。⑧弃去上清
液，加入1mL预冷的70%乙醇漂洗沉淀，小心倒掉70%乙醇。
⑨12 000r/min离心2min，用枪头小心吸取残留溶液，离心管
置于超净工作台室温放置5min，加入150μL TE，用枪头吸打
溶解沉淀。⑩加入RNase A（10mg/mL），使终浓度为50μg/mL，
37℃放置30min。
1.3 改良SDS法 提取方法和提取步骤同改良CTAB法，第1
步加入900μL 10%SDS提取缓冲液。
表2 3种不同方法提取4种药用阿魏总DNA比较
提取方法 试剂盒法 改良CTAB法 改良SDS法
A260/A280（x-） 1.80 1.74 1.75
DNA纯度 纯度高，无降解 纯度较高 纯度较高
DNA浓度（x-，μg/g） 6.480 22.864 27.314
ISSR分析 均可扩增出条带，
且条带丰富
大部分有条带，
条带较少
大部分有条带，
条带较少
操作时间 2h左右 6h左右 6h左右
提取总DNA颜色 均无色 不同程度褐色
浅褐色
不同程度褐色
浅褐色
复杂程度 操作简单，对实
验人员要求较低
操作繁琐，
要求较高
操作繁琐，
要求较高
成本方面 高 低 低
2. 琼脂糖凝胶电泳检测不同提取方法对提纯DNA效果的
影响 见图1。图1结果表明：3种方法在相同的上样量情况下，
均得到了质量较好，纯度较高的条带，而试剂盒法提取的总
DNA条带亮度最高，纯度最高。
3. ISSR-PCR分析不同提取方法对提纯DNA效果的影
响 见图2。3种方法中，试剂盒法对4种不同种类的阿魏都能
够扩增出条带最多，且最清晰的条带，而改良的CTAB法与SDS
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法在881、866引物下分别对1、3号样品没有扩增出条带；在822
引物下，改良的CTAB法对1号样品扩增出了极微弱的条带，SDS
法对3号样品依然未扩增出条带。
4. 不同方法对药用阿魏总DNA提取的综合比较　见表2。
对不同提取方法对药用阿魏总DNA进行比较，试剂盒法提取的
总DNA的A260/A280平均比值最高，为1.80，而改良的CTAB法
与SDS法所提总DNA的A260/A280基本相同，平均比值分别为
1.74和1.75，均小于1.8。试剂盒法提取的总DNA不仅纯度高，而
且无降解。同时筛选出的引物对3种方法提取的4种药用阿魏
总DNA ISSR扩增电泳图也可看出，试剂盒法均可扩增出条带，
且条带丰富，而改良的CTAB法与SDS法所提总DNA大部分有条
带，或条带较少。
讨论
在改良CTAB法以及改良SDS的提取方法过程中，所用试剂
的量以及是否加入某些试剂做了很多次的尝试和实验，最初所
用的提取缓冲液中加入10%PVP，PVP能够有效地避免酚类物质
的介导[6-7]，但在提取缓冲液过程中却产生大量泡沫，对后续实
验的定量误差较大。经过参考了大量文献[8-9]，最后本实验采取
不加入PVP，把β-巯基乙醇的量加大，从而起到较好的效果。
观察3种不同方法提取总DNA的提取液颜色来看，试剂盒
法提取的总DNA为白色沉淀，极易溶解，溶解液为无色透明。
而改良的CTAB法与SDS法提取的总DNA均带有不同程度的褐
色。这也解释了虽然改良的CTAB法与SDS法所测得的总DNA浓
度较高，但电泳图的主带却比试剂盒法提取的总DNA的条带明
显较弱的原因。说明改良CTAB法与改良SDS法提取总DNA仍然
含有一定的杂质，不能反映真实的DNA浓度。因此，评判DNA提
取质量的优劣，应该通过琼脂糖凝胶电泳或ISSR等分析手段多
方面进行检测。
参 考 文 献
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Bulletin,2010(6):100-106
（收稿日期：2012年12月9日）
注：A. 试剂盒法；B. 改良CTAB法；C. 改良SDS法；M. DL2000
DNA Maker；1-2. 多伞阿魏；3. 准噶尔阿魏；4. 新疆阿魏；5. 托里
阿魏。图2同。
图1 3种不同方法提取的4种药用阿魏DNA的琼脂糖凝胶电泳图
A B C
图2 引物UBC881对3种方法提取的4种药用阿魏基因组DNA
的ISSR扩增电泳图谱
A B C