全 文 ：第 33卷 第 5期
2008年 10月　　
林　业　调　查　规　划
Forest　Inventory　and　Planning
Vol.33　No.5
　 Oct.2008
金叶含笑叶片基因组 DNA提取方法的比较
曹国艳 1 ,陈少瑜2 ,司马永康 2 ,吴 涛2 ,郝佳波 2
(1.西南林学院资源学院 , 云南 昆明 650224;2.云南省林业科学院林木遗传育种实验室 ,云南 昆明 650204)
摘要:以金叶含笑叶片为实验材料 , 分别采用 CTAB法 、改良 CTAB法 、简易提取方法 、高盐沉淀法和 SDS法 5种方
法提取金叶含笑叶片的基因组 DNA, 并通过琼脂糖凝胶电泳 、紫外分光光度计及 ISSR扩增 3种方法对所提取的
DNA样品进行检测.DNA纯度 、含量比较以及扩增结果表明:5种方法中简易提取法和 SDS法提取的 DNA纯度较
高 , 高盐沉淀法得到的 DNA产量较高.5种方法提取的 DNA用于 ISSR扩增 , 其扩增结果基本一致.简易提取方法
操作简单 , 省时省力 ,是用于 ISSR扩增的金叶含笑基因组 DNA提取的最佳选择.
关键词:金叶含笑 ;基因组 DNA;DNA提取方法
中图分类号:Q943.2　　文献标识码:A　　文章编号:1671-3168(2008)05-0033-03
ComparisonofMethodsforExtractingGenomeDNAfromMicheliafovedata
CAOGuo-yan1 , CHENShao-yu2 , SIMAYong-kang2 , WUTao2 , HAOJia-bo2
(1.FacultyofResources, SouthwestForestryColege, KunmingYunnan650224, China;
2.ExperimentalUnitofForestTreeGeneticBreeding, YunnanAcademyofForestry, KunmingYunnan650204, China)
Abstract:FivemethodsnamelyCTABmethod, improvedCTABmethod, simpleextractionmethod, a
methodofhighsaltsedimentationandSDSmethodwereadoptedtoextractgenomeDNAfromtheleaves
ofMicheliafovedata.Andthreemethodsincludinggelosegelelectrophoresis, ultravioletspectrophotome-
terandISSRamplificationwereusedtomeasureextractedsampleDNA.Withregardtopurityandquan-
tityofgenomicDNA, theresultsindicatethatthesimpleextractionmethodandSDSmethoddisplaythe
higherpurityofgenomeDNA, andthemethodofhighsaltsedimentationshowsthehigherquantityofge-
nomeDNA.ExtractedgenomeDNAsbyfivemethodsisamplifiedbyISSR, whereassimpleextraction
methodiseasytooperate, savinglaborandtime, anditisthebestmethodforextractinggenomeDNA
fromMicheliafovedata.
Keywords:Micheliafovedata;genomeDNA;amethodforextractingDNA
收稿日期:2008-04-21
基金项目:国家级科研基础研究项目(C020604).
作者简介:曹国艳(1982-),女 ,内蒙古赤峰人 ,硕士研究生 ,主要从事林木遗传育种的研究.
通讯作者:陈少瑜 , Email:shery9872@yahoo.com.cn
　　金叶含笑(Micheliafovedata),木兰科含笑属常
绿乔木 ,树干通直圆满 ,高大挺拔 ,树形端庄秀美 ,叶
色奇特 ,花大芳香 ,果实中种子鲜红欲滴 ,材质优良 ,
观赏价值高 ,在园林中均已得到应用 ,享有 “园林新
秀 ”的美称 ,为我国珍稀树种[ 1] .金叶含笑分布广
泛 ,主要分布于我国湖北 、湖南 、江西 、广东 、广西 、云
南 、贵州等省区 ,但种群个体数量少 ,多零星散生于
其它树种中 ,少有纯林 [ 2] .因此 ,应加强对金叶含笑
天然林保护 ,以防止金叶含笑的遗传基因资源的流
失 ,同时需进一步对金叶含笑进行较系统 、深入的研
究 ,以利于保护 、发展和利用这一珍稀树种资源.本
研究采用 5种 DNA提取方法提取金叶含笑基因组
DNA,并分析 、对比了提取效果 ,筛选适于金叶含笑
DNA提取的最佳方法 ,对这一珍稀树种进一步的分
子遗传研究具有重要意义.
1材料与方法
1.1材料
金叶含笑嫩叶采自云南省林业科学院树木园 ,
采回后在 -30℃条件下保存.
林 业 调 查 规 划
1.2试剂及缓冲液
2 ×CTAB提取缓冲液:100 mmol/LTris-HCl
(pH8), 20 mmol/LEDTA(pH8), 1.4 mol/LNaCl,
2%(质量分数)CTAB, 1% (质量分数)PVP, 1%(体
积分数)β -巯基乙醇.
SDS提取缓冲液:10 mmol/LTris-HCl(pH8),
50 mmol/LEDTA(pH8), 500 mmol/LNaCl, 10%(质
量分数)SDS, 1%(体积分数)β -巯基乙醇.
1×CTAB沉淀缓冲液:100 mmol/LTris-HCl
(pH8), 10 mmol/LEDTA(pH8), 1%(质量分数)
CTAB.
TE缓冲液:10 mmol/LTris-HCl(pH8), 1
mmol/LEDTA(pH8).
10%(质量分数)CTAB:10%(质量分数 )
CTAB, 0.7mol/LnaCl.
TaqDNA聚合酶和 dNTP购自上海申能博彩生
物科技有限公司.
引物 ISSR19,序列为 GGAGTGGTGGTGGTG,由
上海生工合成.
1.3基因组 DNA的提取方法
1.3.1 CTAB提取法 [ 3 ～ 4]
①称取 1 g新鲜叶片 ,加入少量石英砂和 PVP
研磨至细粉.②迅速倒入装有 5mL经 65℃预热的 2
×CTAB提取缓冲液和 50μLβ -巯基乙醇的 10 mL
离心管中 ,于 65℃水浴保温 30min.③12 000rpm离
心 5 min,取上清 ,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶
1), 12 000 rpm离心 10 min.④取上清 ,加入 1/10体
积 10%的 CTAB和等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),
12 000 rpm离心 10 min.⑤取上清 ,加入等体积 1%
的 CTAB沉淀缓冲液 ,轻轻摇晃至形成 DNA絮状沉
淀 , 5 000rpm离心 5min,加入 0.8mL1.0mol/LNaCl
及 10μLRNase置于 56℃水浴中过夜.⑥加入 1.0
mL预冷的 95%冰乙醇使 DNA沉淀 ,挑出 DNA置
于 1.5mL的离心管中.⑦用 70%的酒精清洗 2次 ,
再用 95%的乙醇洗 2次 ,风干 ,溶于 100μLTE中 ,
4℃保存备用.
1.3.2改良 CTAB提取法[ 3, 5 ～ 7]
①②③同 1.3.1,其中 ③重复 3次.④取上清 ,
加入 4倍上清体积的 1×CTAB沉淀缓冲液 ,混匀 ,
室温静置 30 min.⑤12 000 rpm离心 5 min, 挑出
DNA沉淀 ,悬浮于 4 mL1.0 mol/LNaCl溶液中.⑥
加入 2.5倍上清体积的 -20℃的无水乙醇 , 12 000
rpm离心 5min.⑦用 70%乙醇漂洗沉淀 2次 ,风干 ,
溶于 100μLTE中.⑧加入 10μL10 mg/mLRNaseA,
37℃保温 1 h, 乙醇沉淀 ,风干 ,溶于 100μLTE中 ,
4℃保存备用.
1.3.3 简易提取法[ 3]
①②③同 1.3.2.④取上清 ,加入 2.5倍上清体
积的 -20℃的无水乙醇 , -20℃静置 1 h.⑤挑出
DNA沉淀 ,用 70%乙醇漂洗沉淀 3次 ,风干 , 溶于
100μLTE中 , 4℃保存备用.
1.3.4 高盐沉淀法[ 3]
①②③④同 1.3.3.⑤挑出 DNA沉淀 , 溶于
100μLTE中.⑥加入 4 mol/LNaCl,使溶液中 NaCl
的终浓度增加至 2mol/L.⑦用 -20℃的无水乙醇沉
淀 DNA,用 70%乙醇漂洗 2次 ,风干 ,溶于 100μLTE
中 ,加入 10μL10 mg/mLRNaseA, 37℃保温 1h,乙醇
沉淀.⑧沉淀溶于 100μLTE中 , 4℃保存备用.
1.3.5 SDS提取法[ 3 ～ 4, 7 ～ 8]
①同 1.3.1.②迅速倒入装有 5 mL经 65℃预热
的 SDS提取缓冲液和 50μLβ -巯基乙醇的 10mL离
心管中 ,于 65℃水浴保温 30 min.③12 000rpm离心
5min,取上清 ,加入 1mL5mol/L的醋酸钾 ,剧烈振
荡 ,冰浴保温 30 min.④12 000 rpm离心 10 min,取
上清 ,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1), 12 000
rpm离心 10 min.⑤取上清 ,加入 2/3上清体积的异
丙醇 , -20℃静置 30 min.⑥12 000 rpm离心 5 min,
用 70%乙醇洗涤 3次.⑦风干 ,溶于 100μLTE中 ,加
10 ul10 mg/mLRNaseA,在 37℃水浴中保持 20 min.
⑧加 100μL3 mol/L的醋酸钠和 2 mL无水乙醇 ,
12 000 rpm离心 2 min,风干 ,溶于 100μLTE中 , 4℃
保存备用.
1.4 DNA的检测方法
1.4.1 外观观察
通过观察 DNA的颜色和 DNA干燥后的状态 ,
初步判断 DNA的质量.
1.4.2 紫外分光光度计检测
5种方法所提取的 DNA样品按照 V样品
(10μL)∶VTE缓冲液(3mL)的比例稀释 ,紫外分光
光度计测定 230、260、280 nm波长处的吸收值 .根
据 A260 /A280和 A260 /A230值判断 DNA纯度.
1.4.3 凝胶电泳检测
用 0.8 %琼脂糖凝胶电泳 ,在紫外凝胶成像系
统下观察 DNA的电泳结果并照相.
1.4.4 ISSR扩增检测
以 ISSR19为引物进行 ISSR扩增 ,扩增产物在
2.0%琼脂糖凝胶电泳 , 紫外凝胶成像系统观察
照相.
·34· 第 33卷
曹国艳等:金叶含笑叶片基因组 DNA提取方法的比较
扩增体系:25μL体系中含有 17.175μLddH2O、
2.5μL10 ×PCRbufer、1.5μLMgCl2、0.625μLdNTP、
1UTaqDNA聚合酶 、1μLISSR19引物和 2μL(大约
含 80ng)模板 .
反应程序:94℃预变性 5min;94℃变性 1 min,
52℃退火 45s, 72℃延伸 2min, 45个循环;72℃延伸
5 min;4℃保存.
2 结果与分析
2.1外观观察结果
优质的 DNA沉淀为白色 ,风干后透明.如果风
干后仍然为白色 ,说明蛋白质含量较高;若风干后为
白黄色至棕色 ,则意味着含有较多的酚类杂质;胶冻
状 ,则常常含有多糖 [ 3] .本试验中只有改良 CTAB
法提取的 DNA为黄褐色絮状沉淀 ,其余 4种方法提
取的 DNA均为白色絮状沉淀 ,只有简易提取法和
SDS法提取的 DNA风干后是透明的(表 1).因此 ,
从外观上看 ,简易提取法和 SDS法提取的 DNA相
对较好.
表 1　DNA的外观观察结果
方法 DNA沉淀颜色 DNA风干后状态
CTAB法 白色絮状 不透明
改良 CTAB法 黄色絮状 不透明
简易提取法 白色絮状 透明
高盐沉淀法 白色絮状 不透明
SDS法 白色絮状 透明
2.2紫外分光光度计检测结果
由于核酸在 260nm处有一最大光吸收值 ,蛋白
质在 280nm处有一最大光吸收值 ,酚类及色素等杂
质在 230nm处有一最大光吸收值 ,比较 A260 /A280及
A260 /A230的比值可以估测提取 DNA的纯度.通常
1.8≤A260 /A280 <2, A260 /A230≥2时 DNA较纯 [ 3 ～ 4] .
表 2　5种提取方法所得 DNA样品的纯度和产量
分光值 CTAB法 改良CTAB法 简单法
高盐
沉淀法 SDS法
A260 /A280 1.27 1.31 1.90 1.45 1.95
A260 /A230 0.95 0.88 2.76 0.98 2.89
DNA含量(ug/ml) 782.6 767.55 602 926.6 865.4
将 5种方法提取的 DNA用紫外分光光度计进
行纯度和产量的检测 ,结果见表 2.由表 2可以看
出:简易提取法和 SDS法得到的 DNA纯度较高 ,
A260 /A280分别为 1.90和 1.95,位于 1.8和 2之间 ,
A260 /A230分别为 2.76和 2.89,都大于 2,但 SDS法
比较繁琐费时 ,简易提取法操作简单省时省力.尽管
高盐沉淀法提取的 DNA产量最高 ,但对 DNA量要
求不多的情况下简易提取法更为理想.
2.3凝胶电泳结果
提取的样品稀释 5倍后各取 2μL,在 2.0%含
EB的琼脂糖凝胶上 120V、200 mA稳压电泳 40 min
左右 ,凝胶成像系统成像 ,结果见图 1.
图 1　不同提取方法基因组 DNA凝胶电泳
注:1 ～ 6为 λDNA,分别为 100、 120、140、160、180、200ng;7 ～ 9为 CTAB法 3次重复 , 10 ～ 12为改良 CTAB法 3次重复 , 13 ～ 15
为简易提取法 3次重复 , 16 ～ 18为高盐沉淀法 3次重复 , 19 ～ 21为 SDS法 3次重复.
　　由图 1可以看出 , SDS法提取的 DNA条带最
亮 ,但是有明显的拖尾现象 ,可能是由于这种方法比
较繁琐 ,在提取过程中 DNA降解造成的.由 λDNA
的上样量及各条带的亮度可大致估算样品中 DNA
量值.
2.4 ISSR扩增结果
用随机引物 ISSR19对 5种方法分离的 DNA进
行 ISSR-PCR扩增 (见图 2),均可扩增出条带 ,且
扩增的效果几乎相同 ,说明 5种方法提取的 DNA均
可有效地用于 ISSR扩增 ,同时也说明 ISSR分子标
记技术对 DNA的浓度和纯度要求不是很高.
3小结
5种提取方法得到的基因组 DNA在纯度和产
量上有所不同 ,在纯度上以简易提取法和 SDS法最
好 ,在产量上以高盐沉淀法最好.由于本次研究所提
取的基因组 DNA主要用于 ISSR扩增 ,而 5种方法
ISSR扩增结果几乎无差异 ,从省时省力和节约资源
的角度考虑 ,简易提取法应为最佳选择.另外 ,在实
验过程中还要注意几个问题: (下转第 39页)
·35·第 5期
姚罗根等:竹子果实形态及质量的观察和测定
麦的发芽率.料慈竹 (B.DistegiaChiaetH.L.
Fung)、黄竹 、巨龙竹 、勐养藤竹发芽率较高 ,分别达
到 91.3%、92.4%、96.5%、 96.7%.这是由于其种
子颗粒大 ,发育完善 ,营养物质丰富 ,种皮较薄所致.
实验过程中发现坚果和梨果容易被病菌感染 ,虽然
种子大型 ,营养物质丰富 ,但发芽率并不是特别高 ,
坚果发芽率一般在 80%左右 ,梨果为 67.5%.泡滑
竹 (Y.mitisYi)、红皮竹 (Ch.sp.)、永善方竹
(Ch.tuberculataHsuehetL.Z.Gao)的发芽率较高 ,
分别达到 92.8%、90.3%、98.9%.颖果和梨果的发
芽势都在 40%左右 ,坚果的发芽势在 60%左右.慈
竹(N.afinisKengf.)果期在 5月 ,本实验的慈竹种
子采集时间为 4月 ,种子成熟度不高 ,对它的发芽率
和发芽势造成一定影响.
实验室发芽势约为发芽率的一半 ,接近于场圃
发芽率.
3 结论
竹子是多年生禾本科竹亚科植物 ,由于生长周
期长 ,开花结实时间难以预测 ,并且结实率低 ,所以
对竹子果实的研究较少.通过对 13个属 40种竹子
果实的形态和质量进行观察和测定 ,在 40种竹子果
实中 ,颖果有 8个属 28个种 ,坚果有 4个属 11个
种 ,梨果有 1个属 1个种.带壳颖果(通常认作种
子)一般为椭圆形 、圆锥形 、卵圆形 ,颜色以灰褐色 、
紫褐色和黄褐色为主 ,长度 、直径和千粒重分别为
10 ～ 20mm、2 ～ 6 mm、20 ～ 40 g.去壳颖果一般为卵
形 、纺锤形 、椭圆形 ,颜色以黄褐色和紫褐色为主 ,长
度 、直径和千粒重分别为 5 ～ 9 mm、2 ～ 5 mm、15 ～
25 g.种子纯净度 、含水量 、病虫害感染度 、发芽率和
发芽势分别为 80% ～ 95%、 10%左右 、低于 10%、
60%～ 80%、40%.坚果一般为墨绿色和褐色 ,种子
长度 、直径 、大型坚果千粒重 、小型坚果千粒重 、纯净
度 、含水量 、发芽率和发芽势分别为 10mm以上 、10mm
左右 、500 g左右 、低于 200 g、 90%左右 、60%(较
高)、80%左右 、60%左右.梨果为绿色 、褐绿色 ,种
子长度 、直径 、千粒重 、纯净度 、含水量 、发芽率和发
芽势分别为 15 ～ 20 mm、 14 ～ 18 mm、大于 500 g、
90%左右 、60%左右 、70%左右 、40%左右.
参考文献:
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卷 [ M] .北京:中国标准出版社 , 2003:5-70.
(上接第 35页)①在加入提取液破碎细胞壁时应尽
量保持细胞的完整性 ,防止 DNA降解.②加入提取
液后适当地延长保温时间 ,使样品与提取液充分混
合.③在抽提过程中应尽量温和 ,避免剧烈振荡 ,防
止 DNA断裂.④用 RNase消化 RNA, 能达到纯化
DNA的目的.
图 2　5种方法提取的模板 ISSR扩增结果
注:1为 DNAMarker;2.3.4.5.6分别为 CTAB法 、改良 CTAB
法 、简易提取法 、高盐沉淀法和 SDS法提取的 DNA扩增结
果;7为空白对照.
参考文献:
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·39·第 5期