全 文 ：书江西农业学报 2014，26(5) :76 ～ 79
Acta Agriculturae Jiangxi
基于白木香 ESTs的沉香属 SSＲ分子标记引物筛选
杨 云1，2，张 争1，2，陈 波1，孟 慧1，2*
收稿日期:2013 － 12 － 31
基金项目:国家科技支撑计划(2011BAI01B07)。
作者简介:杨云(1981─)，男，助理研究员，博士研究生，主要从事南药生物技术研究。* 通讯作者:孟慧。
(1．中国医学科学院、北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所 /海南省南药资源保护与开发重点实验室，海南 万宁 571533;
2．中国医学科学院、北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)
摘 要:通过对白木香样品的 454GS FLX Titanium高通量测序，获取了大量白木香 EST序列，从中搜索出 956 个 SSＲ，
根据引物设计标准，设计了 44 对 EST － SSＲ引物。在合适的 PCＲ反应体系下，以海南白木香样品的 DNA为模板，对设计的
EST － SSＲ引物进行筛选，发现有 22 对 EST － SSＲ引物能较好地扩增出产物。在沉香属 3 个种 9 份样品中进一步对这些可
扩增的引物进行多态性初步验证，所筛选引物均可在所有沉香属样品中使用，为后续白木香居群及沉香属植物遗传多样性
分析奠定基础。
关键词:白木香; EST － SSＲ标记;多态性引物;筛选
中图分类号:S569 文献标志码:A 文章编号:1001 － 8581( 2014) 05 － 0076 － 04
Screening of SSＲ Molecular Marker Primer in Aquilaria
According to ESTs of Aquilaria sinensis
YANG Yun1，2，ZHANG Zheng1，2，CHEN Bo1，MENG Hui1，2*
( 1． Hainan Branch，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical
College; Hainan Provincial Key Laboratory of Conservation and Development of Southern Medicine Ｒesources，Wanning 571533，
China; 2． Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Bei-
jing 100193，China)
Abstract: A large amount of Aquilaria sinensis ( Lour． ) Gilg EST sequences were obtained through high － throughput sequen-
cing by 454GS FLX Titanium． From these EST sequences，956 SSＲs were selected． Forty － four pairs of EST － SSＲ primers were
designed to amplify flanking SSＲs from 956 selected SSＲ － ESTs． Twenty － two pairs of primers were confirmed to be efficient in A．
sinensis． The preliminary validation of the polymorphism of these 22 pairs of primers was further carried out in 9 samples of 3 species
in Aquilaria，and the results showed that all these primers could be used in Aquilaria． This work lays a foundation for the consequent
family analysis of A． sinensis and genetic diversity analysis of plants in Aquilaria．
Key words: Aquilaria sinensis; EST － SSＲ marker; Polymorphic primers; Screening
简单重复序列(Simple Sequence Ｒepeat，SSＲ)广泛
分布于生物体基因组的不同位置，由于重复次数不同
及重复程度不完全造成每个位点的多态性。序列两端
多为相对保守的单拷贝序列，因此可以通过两端序列
设计特异引物开发分子标记引物。开发并筛选一套综
合特性好的通用 SSＲ 核心引物，对一个物种种质资源
鉴定、杂种优势群划分、遗传多样性分析、品种纯度及
真实性检测、品种 DNA指纹数据库构建等均具有重要
的价值［1］。早期 SSＲ引物主要是从基因组文库或者微
卫星富集文库开发的，开发成本高且费时费力。随着
高通量测序技术的进步，一次可对几十万到几百万条
DNA分子进行序列测定。通过高通量测序相当于建立
了一个庞大的 EST 文库，可获得大量的序列信息。因
此，通过高通量测序手段获取 SSＲ 成为 SSＲ 引物开发
的一条捷径。
沉香属植物主要分布在马来西亚、印尼、越南、柬
埔寨等东南亚各国及我国南部地区，其所有种均可生
产沉香。中国有 2 个沉香属物种分布，分别为白木香
［Aquilaria sinensis (Lour．)Gilg］和云南沉香(Aquilaria
yunnanensis S． C． Huang) ，均为我国特有种。国内已报
道的文献主要侧重在白木香的遗传多样性分析，晏小
霞等［2］通过 AFLP方法分析了白木香种质资源遗传多
样性;刘军民等［3］对白木香不同种质类型开展了 ＲAPD
分析;申彦晶等［4］开展了白木香的遗传差异分析研究
并进行了 ISSＲ 分子鉴定。国外的研究主要侧重在沉
香属不同种甚至临近属之间的分析，Nurita 等［5］通过
AFLP方法分析了沉香属和拟沉香属间的遗传变异。
Lee等［6］对来自马来西亚的沉香种质开展了 ＲAPD 和
SCAＲ标记分析． SSＲ标记具有共显性、操作简便、重复
性好等优点，目前关于白木香 EST － SSＲ序列建立及利
用白木香 EST － SSＲ序列在沉香属植物中遗传多样性
分析还未见报道。本研究利用 454GS FLX Titanium 高
通量测序获得的白木香 EST 序列，对其进行 SSＲ 搜索
并设计引物，建立 EST － SSＲ 标记，并对所筛选引物在
白木香、云南沉香、越南沉香中的通用性进行了初步验
证，为后续遗传多样性分析等工作奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 试验用白木香叶片、云南沉香叶片、
越南沉香叶片均采自中国医学科学院药用植物研究所
海南分所南药园，经南药引种专家陈伟平研究员鉴定。
其中，白木香于 2008 ～ 2009 年从海南、广东等地引种，
云南沉香于 2009 年从云南西双版纳景洪引种，越南沉
香于 2010 年从越南河内引种(表 1)。所有叶片材料均
现采现用。
表 1 9 份沉香属植物材料
编号 样品名称 学名 样品来源
1 白木香 Aquilaria sinensis(Lour．)Gilg 海南儋州
2 白木香 Aquilaria sinensis(Lour．)Gilg 海南演丰
3 白木香 Aquilaria sinensis(Lour．)Gilg 海南屯昌
4 白木香 Aquilaria sinensis(Lour．)Gilg 海南万宁
5 白木香 Aquilaria sinensis(Lour．)Gilg 广东电白
6 白木香 Aquilaria sinensis(Lour．)Gilg 广东中山
7 白木香 Aquilaria sinensis(Lour．)Gilg 广东湛江
8 云南沉香 Aquilaria yunnanensis S． C． Huang 云南西双版纳
9 越南沉香 Aquilaria． crassna Pierre ex
Lecomte
越南河内
1． 2 主要试剂 CTAB、EDTA、Tris饱和酚、氯仿、异戊
醇均购自上海生物技术工程公司，Taq 酶、dNTP 为 MBI
产品，琼脂糖产自西班牙，其余常规试剂均为国产分
析纯。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 DNA的提取方法及 PCＲ 扩增体系建立 参考
杨云等［7］的方法。
1． 3． 2 PCＲ引物筛选 选用 1 份白木香样品的 DNA
作为模板，运用已获得的最佳 PCＲ 反应体系对本试验
中合成的 44 对 SSＲ引物进行筛选。
1． 3． 3 引物种间通用性验证 以沉香属 9 份 DNA 样
品为模板，对筛选的引物开展多态性验证。选取条带
清晰、多态性好的引物。
1． 3． 4 PCＲ产物的检测 对 PCＲ 产物通过 3%的琼
脂糖凝胶电泳分离(80 V)，或者 8%变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳(1700 V，45 ～ 70 W) ，硝酸银染色。
2 结果与分析
2． 1 DNA提取结果 采用改良 CTAB 法提取的白木
香基因组 DNA 经琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪
检测，无 ＲNA 污染，无降解现象，基因组 DNA 浓度在
100 ～ 300 μg /mL之间，OD260 /OD280比值介于 1． 8 ～ 2． 0
之间。说明具有较高的纯度，无蛋白质、酚类、多糖和
盐等杂质的污染，可以直接用于 SSＲ － PCＲ反应。
2． 2 EST － SSＲ 扩增程序优化 通过优化影响白木
香 SSＲ － PCＲ的主要参数，确立适合沉香属植物的 SSＲ
－ PCＲ反应体系和扩增条件:在 20 μL 反应体系中，模
板 DNA、引物、Mg2 +、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶等 5 种
主要成分的最适浓度分别为 2． 5 ng /μL、1 μmol /L、2
mmol /L、0． 2 mmol /L、1． 2 U。SSＲ － PCＲ 扩增程序为:
94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 45 s，72
℃延伸 1 min，35 个循环，72 ℃延伸 10 min。
2． 3 SSＲ多态性引物的筛选 选用 1 份白木香样品
的 DNA作模板，对本试验中合成的 44 对 SSＲ 引物进
行筛选，大部分引物对白木香 DNA 模板能扩增出清晰
条带，引物筛选结果见图 1。本研究以条带清晰、多态
性丰富为引物筛选原则，44 对引物中能有效扩增的引
物为 32 对，占 72． 73%。
2． 4 引物多态性检测及种间通用性验证 用上述筛
选出的 32 对引物对 9 份样品材料进行 PCＲ扩增，其中
22 对引物在 7 份白木香样品中可获得带型丰富且清晰
可辨的电泳图谱，占所有引物的 50%。其中 10 对引物
在沉香属 3 个种的 9 份样品中均能获得多态性条带
(表 2)，占所有引物的 22． 73%，可进一步用于沉香属
植物的遗传多样性分析等方面的研究，部分扩增结果
见图 2。
表 2 10 对引物序列及退火温度
引物编号 引物序列 退火温度 /℃
contig01380 AGCTTTTCAACAAAATaCAG 48
AATACCAGGATGCTACAG
F569I4001AWJ21 CAAATCTCATCTTCTGACAT 49
AAAATGAAAACCATAGACAA
F569I4001CDDP4 ATGAATTCTAGCTGACAAAA 50
AGCTCAAATTCCTTCTATCT
F569I4001BQQO9 GCTTCTCTTTGTTTCTCTCT 50
GTTATTTCCCCAACCAC
F569I4002DHD65 TGATTTTCTTTTCTTTCTTG 50
CATTCAAAGACGGTATTAAA
F569I4002DIFB0 AAAGTGAATGTGCATTAGAG 50
TCAGCAGTGATTTTAGTCTT
F6PSＲSJ02DVZGS TTAACTGATGGAAGAATGAC 50
CTATGATCACACCTCGTAGT
F6PSＲSJ02EIEC3 TCGGAAGAAGTATGAACTAA 50
GATCGTAGAGGTCAGAAGAT
F6PSＲSJ02DZ722 ACAGTTTCAGAGGTTGTATG 50
CATACACCAAGAACAAGAAT
F6PSＲSJ02DKZOB AGAAGGAAGAAATCTGACTC 50
GTGATGATGATGATGCTAGT
775 期 杨云等:基于白木香 ESTs的沉香属 SSＲ分子标记引物筛选
1 ～ 44:引物扩增结果;M:DNA Marker
图 1 SSＲ多态性引物筛选的凝胶电泳
contig01380、F569I4001AWJ21:两对不同引物;M:DNA分子量标准;9 份沉香属植物样品从左到右依次为白木香
(海南儋州、海南演丰、海南屯昌、海南万宁、广东电白、广东中山、广东湛江) ，云南沉香，越南沉香
图 2 9 份沉香属植物样品的部分引物筛选
3 讨论
从 SSＲ标记的发展历程来看，开发 SSＲ 引物的方
法有经典的文库方法、微卫星富集法、省略筛库法和数
据库搜索法等 4 种［8 － 10］。文库法必须对每个克隆进行
筛选鉴定，该方法工作量大，且获得阳性克隆的效率很
低;微卫星富集法较文库法大大提高了筛选效率，但操
作过程仍较为繁琐;省略筛库法省去了筛库的繁琐过
程，运用 5锚定 PCＲ使得筛选有用 SSＲ 标记的效率非
常高，且 SSＲ引物的开发成本也大大降低;在各种数据
库 EST序列增加的基础上，通过数据库搜索法获得
EST － SSＲ的报道也越来越多。本研究基于新一代高
通量测序技术 454GS FLX Titanium获得的白木香 ESTs
文库，设计 44 对白木香 EST － SSＲ引物。通过筛选，其
中 22 对引物在 7 份白木香样品中可获得带型丰富且
清晰可辨的电泳图谱，占所有引物的 50%;10 对引物
在沉香属 3 个种的 9 份样品中均能获得多态性条带，
占所有引物的 22． 73%，可用于进一步分析沉香属植物
的遗传多样性。研究表明:高通量测序能获得大量
EST序列，该技术在开发 SSＲ引物方面具有高效、快速
等特点，为 EST － SSＲ 引物开发提供了一条新的
途径［11 － 12］。
利用 SSＲ引物序列的保守性，李春等［13］研究了板
87 江 西 农 业 学 报 26 卷
栗微卫星引物对近缘属植物栲树的适用性，Chatchawan
等［14］利用石斛兰属和舌兰植物的微卫星引物进行五
唇兰属植物 EST － SSＲ 的开发，Wen 等［15］通过木薯中
SSＲ序列筛选同属大戟科的麻风树和橡胶树 EST －
SSＲ序列。以上的研究均证明 SSＲ 引物在同科不同属
或者更近的物种间具有较高的通用性。本研究通过开
发沉香属植物白木香的 EST － SSＲ引物，并初步验证了
其在同属植物中的通用性，为后续沉香属植物的遗传
多样性分析提供依据。
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( 责任编辑: 许晶晶
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( 责任编辑: 曾小军)
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