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收稿日期:2013 - 02 - 06
基金项目:国家公益性林业科研专项项目(201204312) ;安徽
高校省级自然科学研究重点项目(KJ2011A273)
作者简介:陈存武(1967) ,男,副教授,主要从事植物资源开
发与利用的研究工作(E-mail)chencw@ wxc. edu. cn。
油脂化学
盐肤木油致突变性研究
陈存武1,2,韩邦兴1,2,陈乃富1,2,朱文鑫3
( 1. 皖西学院 生物与制药工程学院,安徽 六安 237012; 2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心,
安徽 六安 237012; 3. 合肥金籽花油脂装备有限公司,合肥 230031)
摘要:根据《食品安全性毒理学评价程序与方法》要求,采用小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形
试验及 Ames试验研究盐肤木油的致突变性。结果表明:盐肤木油各剂量组对小鼠骨髓细胞微核
试验为阴性( P > 0. 05) ,对小鼠精子无致畸作用( P > 0. 05) ; 对 Ames试验中的 TA97、TA98、TA100、
TA102 未显示致突变性。说明在试验条件下,盐肤木油无致突变作用。
关键词:盐肤木油;骨髓细胞微核试验;精子畸形试验;致突变性
中图分类号:TS225. 1;TS201. 6 文献标志码:A 文章编号:1003 - 7969(2013)05 - 0044 - 04
Mutagenicity of Rhus chinensis oil
CHEN Cunwu1,2,HAN Bangxing1,2,CHEN Naifu1,2,ZHU Wenxin3
(1. College of Biological and Pharmaceutical Engineering,West Anhui University,Luan 237012,
Anhui,China;2. Engineering Technology Research Center of Plant Cell Engineering,Luan 237012,
Anhui,China;3. Hefei Jinzihua Oil and Fat Equipment Co.,Ltd.,Hefei 230031,China)
Abstract:According to“Procedures and Methods for Toxicological Assessment on Food Safety ”,the
mice bone marrow cell micronucleus test,sperm abnormality test and Ames test were carried out to study
the mutagenicity of Rhus chinensis oil. The results indicated that for each dosage group of Rhus chinensis
oil,both the mice bone marrow cell micronucleus test and sperm abnormality test were negative (P >
0. 05) ,and Rhus chinensis oil showed no mutagenicity on TA97,TA98,TA100,TA102 in Ames test.
Therefore,Rhus chinensis oil had no mutagenicity in these tests.
Key words:Rhus chinensis oil;bone marrow cell micronucleus test;sperm abnormality test;mutagenicity
我国是食用油消费大国,2011 年消费总量高达 2 865 万 t,而自给率只有 34%[1]。为了减少对进口
的依赖,提高食用油的自给率,在不与粮食争地的前
提下,充分利用荒山滩地,大力发展木本油料植物,
开发油料新资源,其经济及社会价值不言而喻。
盐肤木 (Rhus chinensis Mill)为漆树科(Anacar-
diaceae)盐肤木属(Rhus)植物,又称五倍子树,广
44 CHINA OILS AND FATS 2013 Vol. 38 No. 5
泛分布于我国各地[2]。盐肤木全身是宝,其根、茎、
叶等均能入药,尤其是枝叶上形成的虫瘿———五倍
子,是常用中药及工业原料,广泛应用于医药、化工
等领域,因此盐肤木一直是研究重点和热点[3 - 5]。
盐肤木果皮及种子均含油脂,本课题组的研究表明
野生状态下,其果实中的油脂含量高达 18%[6],不
饱和脂肪酸含量达 72%[7],极具开发价值。本文以
盐肤木油为研究对象,根据《食品安全性毒理学评
价程序与方法》中相关要求[8],在前期研究基础
上[9],进行致突变性试验,研究其安全性,为盐肤木
油的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 盐肤木油
盐肤木果实采自安徽省霍山县南岳山,精选后
于 65 ~ 70℃烘干 12 h,粉碎,过 40 目筛,正己烷浸
提 3 次,合并浸提液,减压回收溶剂,得盐肤木油,其
密度约 0. 9 g /mL。
1. 1. 2 试验动物
清洁级昆明种小鼠、SD 大鼠,由安徽医科大学
实验动物中心提供(SCXK(皖)2005 - 001)。试验
前将其在本实验室( (22 ± 3)℃,相对湿度 50% ~
60%)适应性饲养 1 周。
1. 1. 3 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株
鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株 TA97、TA98、
TA100、TA102 由安徽医科大学毒理学实验室惠赠。
突变型菌株的某些特性易丢失或变异,在投入使用
前按照《食品安全性毒理学评价程序与方法》[8]中
的方法进行鉴定,4 种菌株鉴定均合格。
1. 1. 4 仪器与试剂
OlympusBX 51 显微镜,GL -21M型高速冷冻离
心机,RE - 52D 型旋转式蒸发器,DW - 86L370 型
超低温冰箱(海尔) ,XFS - 280A手提式高压蒸汽灭
菌锅,SW - CJ - 2F 型超净工作台,真空泵,组织匀
浆器,液氮罐。小牛血清(上海酶联生物科技有限
公司)、混合蛋白胨、牛肉膏、二甲亚砜(DMSO)、氨
苄青霉素、结晶紫、D -生物素、L -组氨酸、环磷酰
胺、四环素、敌克松(Dexon)、葡萄糖 - 6 - 磷酸钠
盐、辅酶 -Ⅱ、玉米油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、2 -
乙酰氨基芴(2 - AF)、无水甲醇、冰醋酸等均为分
析纯。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 小鼠骨髓细胞微核试验
(1)小鼠选择:体重 25 ~ 30 g 的健康小鼠雌雄
各 25 只,随机分成 5 组,每组雌雄各半。
(2)盐肤木油的剂量设置:根据急性毒性试验
结果,盐肤木油的 LD50 > 18 g /kg
[8],因此设置试验
用盐肤木油 3 个剂量组分别为 9. 0、4. 5、2.25 g /kg,
另设蒸馏水阴性对照组(10 g /kg)和环磷酰胺(CP)阳
性对照组(0. 04 g /kg)。
(3)经口灌胃:采用 30 h 给受试物法经口灌胃
盐肤木油,即两次灌胃盐肤木油的时间间隔 24 h,并
于第 2 次灌胃 6 h后颈椎脱臼法处死小鼠。
(4)微核标本制备及镜检阅片:按照 GB
15193. 5—2003 相关要求进行。
1. 2. 2 小鼠精子畸形试验
(1)试验小鼠:将体重 25 ~ 35 g 的健康雄性小
鼠 25 只随机分成 5 组用于试验。
(2)盐肤木油的剂量设置:盐肤木油的分组及
剂量设置与“小鼠骨髓细胞微核试验”相同。
(3)经口灌胃:按设置剂量连续 5 d经口灌胃,每
天 1次,灌胃结束后的第 30 d,颈椎脱臼处死小鼠。
(4)精子标本制备、镜检及统计:按照 GB
15193. 7—2003 相关要求进行。
1. 2. 3 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames 试
验)
按照 GB 15193. 4—2003 相关要求进行。
1. 2. 3. 1 代谢活化系统 S9及 S9混合液的制备
(1)大鼠肝脏 S9的制备:取鼠龄 5 ~ 6 周、体重
150 g左右的健康雄性成年 SD 大鼠,分别灌胃苯巴
比妥钠及 β - 萘黄酮,剂量均为 80 mg /kg,每天 1
次,连续灌胃 3 d,处死前 16 h 禁食,断头处死大鼠
后取出肝脏,用新鲜冰冷的 0. 15 mol /L氯化钾溶液
洗去血红蛋白,再按照每克肝脏加入 3 mL的量加入
冰冷的 0. 1 mol /L 氯化钾溶液,冰浴条件下剪碎肝
脏,匀浆器 20 000 r /min 条件下匀浆 1 min,并在 0 ~
4℃、12 000 r /min 条件下高速冷冻离心 10 min,除
去沉淀即得到 S9组分,分装后液氮保存。
(2)S9蛋白含量测定:将制得的 S9组分稀释 100
倍,Lowry 法测定其蛋白含量为 0. 153 2 mg /mL,符
合试验要求。
(3)10% S9混合液:使用前临时配制,由储备的
各混合液试剂与稀释 100 倍的 S9共同组成。
1. 2. 3. 2 Ames 试验
(1)试验方法:平板渗入法[8]。
(2)试验设置:试验分加 S9与不加 S9两组进行,
都以 DMSO 为溶剂,受试物盐肤木油设置为 5. 0、
1. 0、0. 2、0. 04、0. 008 mg /皿 5 个剂量组,同时设自
542013 年第 38 卷第 5 期 中 国 油 脂
发回变、溶剂对照以及阳性对照组。自发回变组只
在每皿的培养基上加菌液 0. 1 mL,溶剂对照组添加
DMSO,剂量为 0. 1 mL /皿,不加 S9组的阳性对照物
为 Dexon,剂量为 0. 05 mg /皿,加 S9组的阳性对照物
为 2 - AF,剂量为 0. 02 mg /皿,每个剂量设 3 个平行
进行同步试验。
(3)试验操作:以溶剂 DMSO 将盐肤木油配制
成 50、10、2、0. 4、0. 08 mg /mL 5 个质量浓度,对应 5
个剂量组。在 45℃水浴条件下,每个剂量组分别取
0. 1 mL盐肤木油、2 mL顶层培养基、0. 1 mL新鲜的
待测菌液、加 S9组再添加 0. 25 mL 10% S9混合液,快
速混匀,均匀涂布于底层培养基上并平放固化。对
照组的操作相同。
(4)培养条件和数据统计:接种固化后的平皿
于 37℃ 恒温培养 48 h,统计每皿菌落数进行方差
分析,结果用“X ± S”表示。
2 结果与讨论
2. 1 小鼠骨髓细胞微核试验
经双盲法阅片镜检,统计受试小鼠骨髓嗜多染
红细胞中的微核出现情况(见表 1) ,结果发现盐肤
木油各剂量组的微核率与阴性对照组比较,均无显
著性差异(P > 0. 05) ,与阳性对照组比较,差异极显
著(P < 0. 01) ,说明在所设剂量范围内,盐肤木油的
小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性。
表 1 盐肤木油的小鼠骨髓细胞微核试验结果(n =10)
性别 组别 剂量 /(g /kg) 嗜多染红细胞数目(个) 微核细胞数(个) 微核率 /%
雄性 阴性对照(蒸馏水) 10. 00 5 000 008 0. 16
阳性对照(CP) 0. 04 5 000 125 2. 50
盐肤木油 9. 00 5 000 015 0. 30
4. 50 5 000 012 0. 24
2. 25 5 000 006 0. 12
雌性 阴性对照(蒸馏水) 10. 00 5 000 007 0. 14
阳性对照(CP) 0. 04 5 000 114 2. 28
盐肤木油 9. 00 5 000 013 0. 26
4. 50 5 000 011 0. 22
2. 25 5 000 005 0. 10
2. 2 小鼠精子畸形试验
表 2 为盐肤木油的小鼠精子畸形试验结果。由
表 2 可以看出,阳性对照组精子畸形率远高于其他
组,差异极显著(P < 0. 01) ,阴性对照组与盐肤木油
各剂量组相比,差异不显著(P > 0. 05)。说明在试
验所设剂量范围内,盐肤木油对小鼠精子无致畸
作用。
表 2 盐肤木油的小鼠精子畸形试验结果(n =5)
组别 剂量 /(g /kg)精子数(个)
畸形精子数(个)
香蕉形 胖头 无钩 双头(尾)折叠 无定形 总数
畸形率 /%
阴性对照(蒸馏水) 10. 00 5 000 6 4 15 0 4 70 99 1. 98
阳性对照(CP) 0. 04 5 000 55 52 67 6 19 513 712 14. 24
盐肤木油 9. 00 5 000 12 9 17 1 3 74 116 2. 32
4. 50 5 000 11 11 16 1 2 67 108 2. 16
2. 25 5 000 7 10 14 0 3 65 99 1. 98
2. 3 Ames试验
盐肤木油的 Ames 试验结果见表 3。从各菌株
的回变菌落数来看,阳性对照组均超过自发回变组
和溶剂对照组 2 倍以上,而盐肤木油各剂量组均未
超过溶剂对照组和自发回变组 2 倍,亦无剂量 -反
应关系。这一结果说明,在试验所设剂量范围内,不
论是否添加 S9,盐肤木油对各试验菌株均无致突变
性作用。
3 结 论
采用小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试
验和 Ames试验研究盐肤木油的致突变性,结果发
现,盐肤木油对小鼠骨髓细胞微核无明显增多作用,
对雄性小鼠生殖细胞无遗传损伤作用,也不具有致
突变作用。因此,盐肤木油具有进一步深入研究和
开发的价值。
64 CHINA OILS AND FATS 2013 Vol. 38 No. 5
表 3 盐肤木油的 Ames试验结果(X ± S )
组别
TA97(个)
- S9 + S9
TA98(个)
- S9 + S9
TA100(个)
- S9 + S9
TA102(个)
- S9 + S9
盐肤木油 /(mg /皿)
5. 0 107 ± 9. 62 0114 ± 10. 21 042 ± 3. 24 0038 ± 3. 62 095 ± 2. 54 0084 ± 5. 46 0184 ± 9. 63 267 ± 32. 35
1. 0 096 ± 11. 46 0124 ± 12. 32 058 ± 9. 23 0046 ± 7. 82 114 ± 2. 25 0152 ± 9. 50 0196 ± 10. 46 242 ± 17. 08
0. 2 102 ± 13. 20 0136 ± 16. 84 062 ± 4. 54 0052 ± 3. 62 126 ± 5. 87 0165 ± 12. 14 0178 ± 21. 68 254 ± 22. 32
0. 04 098 ± 12. 20 0146 ± 11. 24 058 ± 4. 32 0066 ± 6. 56 146 ± 12. 66 0157 ± 11. 82 0226 ± 13. 44 265 ± 12. 25
0. 008 106 ± 11. 78 0157 ± 9. 62 048 ± 5. 26 0059 ± 3. 44 123 ± 15. 67 0149 ± 10. 07 0195 ± 12. 70 238 ± 16. 75
自发回变 123 ± 6. 22 0148 ± 10. 54 051 ± 3. 52 0068 ± 6. 23 127 ± 11. 23 0167 ± 9. 26 0201 ± 18. 56 315 ± 21. 33
溶剂对照 132 ± 9. 60 0156 ± 11. 42 061 ± 3. 78 0071 ± 6. 25 149 ± 11. 71 0183 ± 7. 26 0225 ± 26. 30 321 ± 14. 52
加 S9 的阳性对照 1 326 ± 32. 46 1 967 ± 38. 23 1 876 ± 32. 22 786 ± 58. 26
不加 S9 的阳性对照 988 ± 39. 00 996 ± 42. 32 521 ± 12. 54 1 024 ± 38. 03
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http:∥www. shunxia. net
742013 年第 38 卷第 5 期 中 国 油 脂