全 文 ：第 27 卷 第 1期
2 7 0 0年 l月
浙 江 林 业 科 技
J O U R
.
O F 刀印叮IA NG FO R . S C I . & T EC H
V o l
.
2 7 NO
.
l
2 7 0 0
文章编号 : l( } 0 l一 37 7 6( 2 07 ) 01 ~ 0 0 01一5
+ 一种械属植物遗传多样性 A F L尸分析
钱永生 ’ , 王慧中 ’ * , 黎念林 2 , 胡 中 2
( 1
. 杭州师范学院 生物化学与分子生物学杭州市重点实验室 , 浙江 杭州 31 0 3;6 2 . 杭州植物园 , 浙江 杭州 31 0 13 )
摘要 : 采用了 川几P 技术分析了械属十一种植物的遗传多样性 , 从 12 对 A F L P 引物中筛选出 5对多态性高、 分辨
率清晰的引物 , 其中选择最优的 3 个引物组合分别扩增出 101 、 163 、 178 条多态性带。 三对弓I物 ( E + A C G月以 +
C A G
、
E +
cA
A IM + CAT
、
E + A A c 月“ + CCA ) 共扩增出 484 条带 。 分析结果按 UP G M人类平均法进行聚类 , 聚
类结果显示将 1 种械属植物聚为 I 、 n 、 uI 三大类 , 其中羊角械和栓皮械 , 长尾秀丽械和毛脉械 , 复叶械与剑叶
械之间的亲缘关系最近。
关键词 : 械属 ; Af L p ; 遗传多样性
中图分类号 : 5 792 .3 5 文献分类号 : A
械树属植物多为乔木或灌木 , 遍布北半球温带及亚热带 , 我国是其主要分布区之一 。 械树属植物约有 2 00
余种 , 很多具有一定的药用价值 , 目前对械属的研究主要集中在拐寸某种械属植物的化学成分和其药理性研究 ,
品种分类主要以形态学指标为主 , 而对分子生物学的相关指标研究较少 , 1 970 年 M u 比 ay 发表了 “械树科专著” ,
将械属分为 7 亚属 24 组 35 系 , 15 4 种口1。 D N A 指纹技术在研究真核生物和原核生物的系统分类 、 发展进化和
亲缘关系等方面已被证明是一种非常有效的分子标记技术 l8[ 。 本文利用 A f L p 技术 , 在分子水平上对十一种械
属植物亲缘关系进行了研究 , 以期对械属植物的系统分类和发育进化关系有初步了解 , 以及为今后械属植物种
属特异性鉴定 、 遗传图谱构建以及基因定位等方面提供依据 。
1 材料和方法
,
.
1 材料
1 种械属植物的嫩叶 , 采自杭州植物
园 。 实验所用 1 种械属植物种名见表 1。
,
.
2 基因组 O N A提取
主要参照宋国立等实验方法并有所改
进 l9j , 将提取后的 D N A 用 .0 8%琼脂糖凝
胶 (含 BE .O 5林g l l n l ) 电泳检测 D N A 片段
裹 1 材料名称
臀 种名 编号7
8
9
种名
小鸡爪械 A ce r aP l州四 to v时:ht be gr
“
长尾秀丽械 A . e l e g a n ut lu m var .
~
、
毛脉械 乃 . 夕u ian e vr e羊角械 A . ya n目 u e而樟叶械 A . a l b印“ , “ ar
~栓皮械 A . ` ` 用刃己“ 理
复叶械 A . 触 s u ” d o糖械 凡 as c c加~剑叶械 凡
10 秀丽械
1 建始械
s in -o o b ot 月 g u洲门
e份邵 n ut lu m
A
.
he
n yr i
大小 , 取出其中的 113 已提取的基因组 D N A 进行纯化 , 首先用 TE 缓冲液补满至总体积 5ul0 , 再等体积苯酚
氯仿屏戊醇 ( 25 : 24 : l) 抽提一次 , 离心吸上清液于 EP p en do fr 管中 , 加入 1 0 体积的 N a AC 和二倍体积预
冷的无水乙醇 , 一 20 ℃放置 Z h 以上 , or 《x旧 g离心 10 而 n ,用 70 %的乙醇漂洗 D N A 沉淀 2 次 ,风干后溶于 3即 r E
缓冲液中 , 用 U v 一 24 l0 CP (岛津 )紫外分光光度计检测 A姗 、 A 280 值并定量 , 如果 。 D Z日澎o D 2 80 值在 1 . 6 一 1 . 8 ,
说明 D N A 纯度比较高10I] , 再用 .0 8%琼脂糖凝胶 (含 BE .O 5林岁而 ) 电泳检测 DNA 片段大小
。
收稿日期 : 2以拓 一 1 1一03 ; 修回 日期 : 2X() 6 一 12一 05
基金项目 : 杭洲师范学院青年科研基金 ( 2哪 x N印 3 ) , 浙江省自然科学基金 ( 3 01 闷伪 ) , 浙江省 “ 151 ” 和杭州市 “ 13 1” 人刁雀淦资助项目
作者简介 : 钱永生 ( 19 的 一 ) , 男 , 浙江杭州人 , 助理实验师 , 从事植物分子生物学研究及基因工程 ; * 通讯作者 。
浙 江 林 业 科 技 7 2卷
1
.
3 AF P L分析
AF Lp实验流程主要参照 2冶b e u a和 V 0 s19 9 5年发表的论文
` , ’ 1 , 接头与引物由上海牛下牛物工程技术服务有限公司合成 , 预
扩增引物对选用 E + A了M + C (序列见表 2 ) , 开始选用 12 对选
择性引物对 E + A C G月吐 + C A G 、 E + A C A ZM + C A T 、 E 十 A A C M
+ C A C
、
E + A C IT M + C A A
、
E + A C C迎涯 + C A G 、 E + A C A月以 +
C A C
、
E + A C C IM + C A T
、
E + A C G月以 + C A T 、 E + A C G刀以 + C A C 、
E + A C C爪1+ C A C 、 E + A C G刀涯十 C A G 、 E 十 A A C月以 + C AA 分别
进行扩增 。 最后选用其中效果较好的 5 对选择性引物对 E 十
A C G刀吐 + C A G 、 E + A C沟M + C A T 、 E + A A C月以 + C A C 、 E +
A C T刀涯十 C A A 、 E + A C C月以 + C A G (见表 2 ) 分别进行扩增 。
1
.
3
.
1 酶切连接 模板量约为 25 0n g , .2 5 林 110 火酶切缓冲液 、 .2 5
表 2 不同扩增引物和接头的名称和序列
引物名称
E + A
M + C
Ec d R I a山 Petr l
cE oR l
a d a P t e口
M s e I a da P吐 l
M s e 1 a da P奴, 2
E + A C T
E + A A C
E + A C A
E + A C C
E + A C G
M 十 C A A
M + C八1,
M + C A C
M + C A G
序列 ( 5 , 一 3 , )
5
, 一 G A C T GC G TA C C A A T T C户
5
` 一 G A T GA G T C口旧 AG T AA (
5
护一 C T C G T A G A丫代犯G TA C (
3
尹一 C A T C TG A C GC A T GG TT A
5
, 一 C A C G A T G AG TC门陷 AG `
3
护一 T A白弋 AGG A口陀 A T . s r
G AC T G C G T A C C A尤门℃ A C T
G AC代祀GT A C C A A们呛A A C
C AC代犯G TA C C A A们弋A C A
C AC T G C G T A C C A AT T C A C C
G AC代祀GT A C C人酝n ℃ A C G
C AT G AG TCO陷 AC T AA C AA
G AT G AGT C C rG AG T AA C AT
C AT G A C T C口Or AG T AA C A C
G AT G AGT C口陷 AG T AA C A G
林 1 10 x T 4 D N A 连接酶切缓冲液 、 SU cE oR I 、
双蒸水补至 25 林 l 。 用 P E 公司 cP R 扩增仪设定
扩增模板 。
1
.
3 .2 预扩增 取 3川 酶切连接产物 , 加入
7 5 n g E + A
、
7 5 n g M + C 引物 、 15
uon 比 M广
、
2 5
mo lL
d N T P s
、
I U T雌酶 、 3林1 10 x CP R 缓
冲液 , 加双蒸水补至 30 川。 反应参数为 : 94 ℃
9 0 5
、
9 4℃ 4 5 5 、 5 6℃ l而 n 、 7 2℃ I n五n , 30 循环 ;
72 ℃ 10而 n ( PE 公司 P C R仪 ) 。 反应结束后 ,
用 .0 8%潮旨糖凝胶 (含 BE .O 5林幼 n l ) 电泳检测
扩增产物 ( 图 1 ) 。
s u M se l
、
Zu 科 连接酶 、 5 0 pmo l M se l 接头 (序列见表 2 ) ,
3 7℃过夜反应后 , 于 65 ℃灭酶活 2伽m in , 一 20 ℃保存 , 作为预
图 1 预扩增产物电泳结果
从图 1的电泳条带浓度经验分析得出 : 预扩增产物取 3闪产物释稀 30 倍 , 用作选择性扩增模板为最宜。
1
.” 选择性扩增 取释稀后的产物 3川加入 cE o R I 选择性引物 、 M se l 选择性引物各 75 gn , 15 ~ 比 M g +2
,
2 5
m
o优 d N T p s , IUT a g 酶 , 3林] l o x P e R 缓冲液 , 加双蒸水补至 3即 l 。 反应参数为 : 男℃ 9 0 5 ; 9 4℃ 4 5 5 , 6 5
℃ l而 n , 7 2 ℃ In
,
1 3循环 (每循环降 0 . 7℃ ) ; 9 4℃ 4 5 5 , 56℃ l而 n , 7 2℃ l而 n , 2 5循环 ; 7 2℃ sun (咫公司 P c R 仪 ) , 先用 .0 8%琼脂糖凝胶 (含 E B .O 5林岁回 ) 电泳检测选择性扩增产物。
1
.
3
.
4 电泳 扩增产物用 6%变性聚丙烯酞胺胶和 1 x BT E 电泳缓冲液电泳分离 ( lB o ~ R A D 公司测序电泳仪 ) 。
1
.
3
.
5 银染 根据刘建斌 , 陈新露 , 石锐 、 乐晓萍等的银染方法并有所改进 12[ 一 14] 。
1
.
4 数据分析
选用 5 对选择性引物对 E + A C G月以 + C A G 、 E + A C A月以 + C A T 、 E + A A O M + C A C 、 E + A C T几以+ C AA 、 E
十 A C C几以 + C A G (序列见表 2 ) 分别进行扩增 , 我们选用全部清晰 、 可分辩的条带进林己录分析。 先用 BI O 一RA D
公司的 Qaun it yt o n e 软件统计 , 根据电泳图谱中同一位置有无统计有带计为 1 , 无带或模糊不能辩认计为 。 。 由于
全泳道的 A F L p 图谱高分子量和低分子量的扩增带比较模 表 3 选择性引物组合对供试材料的扩. 结果
糊 , 所以在 A IF . p 图谱中我们只分析了 3 50 一 150 bP 之间的
带 , 在 15 0 一 3 50 bP 之间共得到 4 84 条带 , 多态性带科 2条 ,
多态性百分率为 91 . 3% (见表 3 ) 。 再用 N T SsY 软件计算
出遗传相似性系数 , 用 U p G M峨 法进行聚类分析构建聚类图 。
引物 扩增带数 .多态带数 多态带的百分匆%
E + AC e M + C AG 1 18 10 1 8 5
.
6
E + A C AjM + C AT 1 74 1 63 9 3
.
7
E + A A G M + C A C 1 9 2 1 7 8 9 2 7
1期 钱永生 , 等 : 十一种械属植物遗传多样性 A F L P 分析
2 结果
5对引物组合的 A , L p扩增结果得到 4 84 条带 , 多态性带 4 4 2 条 。 其中引物组合 E + A C C M + C A G 和 E +
AC刀 M + C AT 扩增结果分别见图 2 和图 3 , 相似系数见表 4 , 数据分析聚类图见图 4o
图 4 A FL P 标记构建的 U PG M叭 聚类图
根据图 4 , 由 A F L P 技术得到的聚类图相似系数在 .0 62 处 , 可将这 n 种材料分为 I 类 、 n 类和班类 。 I 类
包括小鸡爪械 、 长尾秀丽械 、 毛脉械 、 复叶械 、 剑叶械 、 秀丽械 ; n类包括羊角械 、 栓皮械 、 糖械 、 建始械 ;
1 类只有樟叶械。 在 .0 76 处羊角械和栓皮械聚在一起 , 与它们关系较远的依次是建始械 、 糖械 、 冬青、 樟叶械
等 。 长尾秀丽械和毛脉械相似系数在 .0 74 处聚在一起 , 表明两者亲缘关系最近 。 I 类包括复叶械 、 剑叶械 , 并
且在 .0 70 左右之间聚类 , 表明两者亲缘关系最近 。
浙 江 林 业 科 技 2 7 卷
表 4 根据 A F LP 标记计算的相似系数
0
.
6 37
O
一
5 0 2
0
.
6 2 0
0
.
624
0
.
5 5 1
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0
.
7 4 7
0
.
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0
.
5 7 1
0
.
5 9 2
0
.
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0
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0
.
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0
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1049
2一069“
0
.
6 2 9 0
.
6 57 0
.
706
0. 62 9 0. 6 6 5 0. 747
0
.
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.
5 8 8 0
.
6 5 3
1
.
(减) X
0
.
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0
.
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0 沉】
0. 620
0
.
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.
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.
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.
(拟)
0
.
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0
.
6 5 3
0
.
6 16
0
.
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0
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0
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.
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0. 6 9
l一1234567980
3 讨论
Pej ic 等I1s 队为 A f L p 和 s s R 具有与 R F L p 同样的可靠结果 , 并可实现自动化操作 , 所以能完全取 R IF尹 用
于种质资源遗传多样性研究。 大量研究表明 , 月几P 可以用于生物的遗传多样性和类群划分的研究 , 它已成为
国内外植物育种的一个重要方向。 1 8 85 年 Pax 建立了械属的分类系统 , 他将械属分为 4个大群 , 14 个组 。 190 2
年他又将械属调整为 13 个组 。 ojP 田火 o va ( 19 3 ) 严肃地批评了 P ax 的系统和构想 , 她认为械属分为 17 个组和
犯 系 , 其中有她新研究的四个组。 而到了现代 , 械属的分类又有所变动 , 为 4亚属 23 组 3 系 2 0 种〔均 。 以上
械属的分类较局限于其形态学性状 , 然而关于械属在分子标记上的亲缘关系分类研究就相对较少 。 按照 《浙江
植物志 》 l7[ 】械属的分类检索表可知 : 秀丽械和毛脉械的分类地位最近 , 建始械属于复叶型 , 与其余的械属品种
分为两大类。
而本实验用 A F L P 技术得到的聚类图相似系数在 .0 62 处 , 本实验可将这 n 种材料分为 I 类 、 n类和 1 类。
I 类包括小鸡爪械 、 长尾秀丽械 、 毛脉械 、 复叶械 、 剑叶械 、 秀丽械 ; n 类包括羊角械 、 栓皮械 、 糖械 、 建始
械 ; 1 类只有樟叶械 。 在 .0 76 处羊角械和栓皮械聚在一起 , 与它们关系较远的依次是建始械 、 糖械 、 冬青 、 樟
叶械等 。 长尾秀丽械和毛脉械在 .0 74 处聚在一起 , 表明两者亲缘关系最近 。 I 类包括复叶械 、 剑叶械 , 并且在
.0 70 左右之间聚类 , 表明两者亲缘关系最近 。 其中长尾秀丽械和毛脉械的亲缘关系最近与形态学上的分类完全
吻合 , 但在形态学上建始械与其他械属分为两类 , 因为它是复叶 , 而在分子水平上的亲缘关系研究发现 , 羊角
械 、 栓皮械 、 糖械 、 建始械可以聚类在一起 。
本文研究的 A f L p 多样性分析结果证明 , 就某个基因位点而言 , 其差异无法在 A F LP 扩增条带中加以区分 ,
只有显性与隐性基因型才可以通过条带的有无进行区分 , 也就无法对全部实验材料按照某一具体性状进行聚类 。
A FL p 谱带只能反映械属基因组上的部分差异 , 不能反映控制某一性状的全部基因的情况。 但本实验的结果基
本反映出了不同种间亲源关系的远近 , 对于械属植物亲本选配工作起到一定的指导作用 , 也为传统植物分类研
究提供一些佐证 , 为械属植物特定基因的 QT L 研究打下一定的基础 , 也将是今后研究的重要方向。
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