全 文 ：第 20卷
2(X X)年
第 4期
12月
蚕 学 通 讯
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农杆菌介导桑属 ( oM。 )遗传转化进展
杨金富`
(西南农业大学蚕桑丝绸学院
余茂德” 鲁成
农业部蚕桑学开放重点实验室 粼刃 7 16)
摘 要 本文介绍 了农杆菌介导的植物遗传转化机理和方法 ,并对近年来农杆菌介导桑树遗传
转化所取得的成就和存在的问题作简要综述 ,并对桑树基因工程进行展望 。
关健词 桑树 农杆菌 iT 质粒 遗传转化
植物组织培养和植物分子生物学的发展为桑树育种注人了新的活力 ,应用分子生物学方
法可以将来源不同的优良基 因组合在一起并转化到植物中 , 能较常规育种更为迅速地创造出
优良的新品种 ,并且大大缩短了育种周期 。 植物遗传转化工程的发展给常规育种带来一个全
新的概念 。 自 1984 年第一例转基 因烟草植株问世以来 [’ ] , 迄今多种植物 已经获得转基 因植
株 。 在所获得的转基因植株中 , 80 % 是通过农杆菌转化 ,农杆菌系统作为一个优 良的植物转化
系统 , 在植物基因工程中广泛应用 。 农杆菌转化系统在桑树上的应用开始于 19 85 年平野的农
杆菌感染实验 z[] ,本文将就农杆菌介导的植物遗传转化机理 , 以及对桑树进行遗传转化取得的
成就与问题作简要综述 。
1 农杆菌介导的遗传转化机理及方法
1
.
1 农杆菌介导的遗传转化机理
农杆菌是一种革兰氏阴性菌 ( S n云ht & 毛洲瓜留 n t , 1卯7 ) ,属于根瘤菌科 (瓜如 6
~
)
。 植物
遗传转化中常用的为根瘤 (土壤 )农杆菌 (崛叔冠丽娜 如啊触如 )和发根农杆菌 (月脚 6配切瓜叭
hr 心侧笋 n 巴姆 ) 。 两者感染植物产生不同的后果 , 根瘤农杆菌产生冠瘦瘤 , 发根农杆菌产生发根 ,
根瘤和发根的产生与菌体中的 iT 质粒和 凡 质粒有关 ,质粒上的部分 DN A 在感染植物时和植
物基因组整合 ,称为转移 DN A , 即 T 一 DN A ( . l b时 l s fe 功祖 一 DNA ) ,该区含有与植物肿瘤和发根形
成有关的基因 , T 一 DNA 两侧有 25 坤 的重复序列 ,右侧还含有和转移效率有关的超驱动序列
(O D ) ;另外一个区域的表达产物能激发 T 一 DN A 区的转移 ,使农杆菌表现 出毒性 , 这个 区域称
为 , i: 区 〔3 一 4〕。 另外 , 质粒上还含有与质粒复制和转移有关的基因 。 根瘤农杆菌感染植物的基
本过程如下 s[] :植物损伤后 ,受伤部位产生的低分子量的酚类物质 (如乙 酞丁香酮和 。一经基乙
酞丁香酮 )刺激 iT 质粒上 vir 区基因表达 , vi r 区表达产物对 T 一 DN A 进行切割并形成 T 复合
物 , T 复合物经细菌细胞膜壁和植物细胞壁和细胞膜 、 核膜并随机整合到植物 的染色体上 , 在
. 在读硕士研究生 。怜 通讯作者 。
蚕 学 通 讯 20卷
一定的条件下获得表达 。 由于农杆菌的 T一 DN A基 因和转移无关 , 因此用 目的基因取代 T -
DN A 基因 (保留边界序列 ) ,构建重组质粒 ;用带有重组质粒的根瘤农杆菌来感染植物组织 ,经
过组织培养手段就可获得带有目的基因的再生植株 。 农杆菌介导的植物基因转化系统广泛应
用于植物遗传转化 ,在已有的转基因植物中 , so % 是通过农杆菌转化成功的 。
1
.
2 根瘤农杆菌介导基因转化的方法
农杆菌介导的遗传转化方法很多 ,分为共培养法和直接转移法 , 共培养法包括叶盘法 〔’ 〕、
整体植株的直接感染 、体细胞胚和胚性细胞的转化 ,原生质体的转化 、腋芽的直接转化 e[] ;直接
转移法主要是与基因枪结合的直接转化法 。 其中叶盘法是 比较成熟的方法 ,该方法首先在烟
草和矮牵牛 中报道 , 随后在多种植物的遗传转化中得到应用 , 目前已发展成为以胚轴 、 下胚轴 、
茎段 、和块茎等多种外植体作为基因转化受体的转化方法 ;腋芽的直接转化报道于李卫等用根
瘤农杆转化沙田袖 的研究 , 以农杆菌直接感染叶腋并辅以打顶 、 出芽培养基促芽生长等方法 ,
选择丛芽诱导生根 ,得到表达 GU S 基因的完整转化植株 ,转化效率是常规方法的 3 一 6 倍 。 这
种方法的主要特点是不需要无菌操作 , 免除了在农杆菌共培养后除去农杆菌的烦琐过程 ,并且
对附体腋芽的诱导 比离体培养容易 ,转化 、再生的效率高 ,这个方法为传统的农杆菌转化方法
提供了新的思路 。
2 桑村遗传转化进展
2
.
1 报告基因的遗传转化
19 85 年平野用根瘤农杆菌感染桑树形成根瘤 ,证明桑树能为农杆菌所感染 z[] ; 1990 年 ,
M ACH n
,
H 用带有 GU S 基因的根瘤农杆菌 LB为种时 感染桑树叶盘 , 获得再生植株 , 首次证明
桑树可以作为外源基因的良好受体 v[] ; 1992 年夏本末男等将连接有 35 强启动子的 uG s 基 因
转人 or ~ eln 她 凡` 肋阮 5记乙〔s]
。 报道基因成功地转人桑科植物小诸树并稳定表达 , 为桑树的
基因工程奠定了基础 。
2
.
2 抗菌肤的遗传转化
19男〕年李丹青等人报道将人工合成的柞蚕抗菌肤 D 基因克隆于 时 e isr P/ MP 质粒和辅助
质粒 O企4 ,并成功的地将之导人根瘤农杆菌中 0[] 。 1卯 2 年吴成仓等将天蚕抗菌肤 B转人桑树
叶盘 ,获得愈伤组织 ,但未能形成再生植株 [ `01 ;l 94 年管志文等用人工合成的抗菌肤 D 基因来
感染桑树叶盘 ,经过筛选培养后获得转化苗 ,经检测证明外源基因已转人桑树体内 ,但其表达
和抗病性的检测 目前未见报道 〔川 ;l 96 年
, 蓝玲等进行了广东桑的叶盘和茎段的基因转化技
术研究 , 发现叶盘的转化率高于茎段〔’ 2〕; 19 8 年王勇等将抗菌肤基因通过叶盘法导人桑树基
因组 ,通过筛选培养后获得具有抗病性的转化植株 ,但对于进一步的大田实验和基因的稳定表
达检测未见报道〔’ 3〕。
2
.
3 异种蛋白的遗传转化 〔’ 4 〕
将异种植物基因导人桑树的研究已取得一定的成果 , 19 8 年 ,谈建中等成功地将大豆球
蛋白基因 (从 。 lB 因导人桑树 , 开始了通过分子育种改 良桑树品质的探索 。 将异种蛋 白质基
因转人桑树以改良桑叶品质的研究 , 目前仅处于探索阶段 。
2
.
4 利用发根农杆菌介导的遗传转化 〔` 5 ]
与根瘤农杆菌相比 ,发根农杆菌在植物遗传转化中的应用要相对晚一些 , 近来 的研究表
明 ,发根农杆菌所诱导产生的发根是单细胞产物 ,转化后形成的再生植株在理论上不会出现嵌
4 期 杨金富等 :农杆菌介导桑属 (入肠心 )遗传转化进展
合体 , 因此具有较大的应用潜力 。 发根农杆菌在桑树中的应用近年来也有一定的研究 , 199
年 , 日本学者报道应用发根农杆菌感染桑树 , 产生发根 , 表明桑树也能为发根农杆菌所感染 ,但
未获得再生植株 。
4 桑树遗传转化所存在的问题
桑树的遗传转化为桑树育种带来了新的契机 ,经过多年努力 , 取得了较大进展 ,但由于桑
树本身具有木本植物的生长特点 , 使其遗传转化存在一定得难度和特殊性 。 综合文献可 以发
现桑树在遗传转化中存在以下问题 : 一是桑树的组织培养虽然 已经取得很大进展 , 建立于完善
的离体培养体系 ,但是这个体系是建立在对某些品种的培养基础上的 ,并非适合所有的桑树品
种 ;二是桑树的遗传转化体系尚未成熟 , 目前的转化仅限于 白桑 (山肠双。 月刀劲 乙)以及几个品种
丰驰 、新一之獭 ,并且对影响桑树的遗传转化因素的研究还未得到开展 ,转化率和再生率低也
是限制桑树遗传转化的关键因素 ;三是用于转化桑树的 目的基因有限 ,仅限于抗病基因 。 关于
抗虫基因方面 , 由于抗虫基因产生的毒蛋白具有杀虫广谱性 ,而家蚕属于昆虫 , 因此抗虫基因
转化桑树的研究应慎重 〔’卜 ’ 9] ,对于桑树的品质改 良和抗除草剂等方面的遗传转化研究较少 ;
四是 目前的研究仅仅属限于实验室探索阶段 ,还没有大田实验和推广的转化植株的报道 ;五是
用来进行基因转化的外植体较少 ,转化方法单一 ,外植体用得最多得是叶盘 。 而方法上迄今为
止仅有叶盘法 ,其他的同样有效的外植体和转化方法还没有研究报道 ;六是遗传标记 的选择 ,
由于在根瘤农杆菌转化过程中多用抗生素作为选择标记 , 但抗 生素能抑制桑树外植体的再
生 [ ’ “ , ’ 7〕 , 因此选择一个好的选择标记 ,仍然是一个有待研究的问题 。 针以上问题 ,桑树学科应
该采用先进的分子生物学手段 , 研究开发各种技术途径 ,使桑树遗传化技术更趋成熟 , 桑树基
因工程才能取得突破性进展 。
5 桑树基因工程展望
植物基 因工程已有十多年的历史 ,并在植物的抗性培育 、 品质改良等诸方面都取得了很大
的成功 。 植物遗传工程的手段和方法在桑树方面的应用显示出巨大 的潜力 。 首先 ,植物遗传
转化可以为传统的桑树育种提供新的种质资源 ;其次 ,桑树遗传性状的基础研究难度较大 ,传
统手段很难将控制其优 良性状的基因从分子水平上加 以揭示 ,植物基因工程为这一研究提供
了一条崭新的途径 ,应用基因工程手段 , 从分子水平上对桑树优良性状进行基因分析 、定位 、 克
隆和转化 ,在改 良桑树品种的同时 ,对桑树遗传背景的研究也具有开创性的意义 ;第三 , 可以将
优良基因导人桑树优良品种 , 对优良品种的某些缺陷进行改造使之更优 ;最后 , 由于桑树本身
的独特性 ,可利用桑树作为生物反应器 , 生产人类所需的特殊蛋白质以及药物或食品 。 同时桑
树是多年生木本植物 ,一旦外源基因导人并稳定表达 , 即可利用无性繁殖的手段 ,如嫁接 、 扦插
等来扩大转化植株的数量 ,而不会出现分离现象 。 桑树的离体培养体系业已建立 ,为遗传转化
奠定了基础 。 还应该注意到 ,虽然植物基因工程与传统桑树育种相比具很大优势 ,但并不能取
代传统育种 ,桑树基因工程可以创造出新的种质 , 但要使新种质的优良性状在桑树中保留并稳
定的遗传下去 ,只有通过有性杂交 、筛选等传统育种手段 ,才能得到所需要的稳定遗传的优 良
品种 。 相信随着分子生物学技术的发展 ,传统育种和植物基因工相结合 ,将会把桑树育种学科
推向一个崭新的阶段 , 培育出适合蚕业发展所需的突破性新桑品种 。
蚕 学 通 讯 20卷
参 考 文 献
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肠翅石on in in 川犯 tU er l已迁 C ul ut 比 胡己 polr ife 画二 of m』it少 一 b u d lx 记y 成 md 比侧 , J .翻。 . 阮i . vnJ , 1卯 7 , “ (6 ) : 49 3
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` 产` 产心产 , 护小唱产 ` 户 , 荟小写产,公户 `产唱产 , 笋小写产 , 护户写产 , 户从` 沪` 产 、公户 、公户侣产 `产喝产 `产 `沪 ` 产` 沪 , 声户 , 奋户 ,` 沪、 沪气` 产 ` 产` 产 ` 产
(上接第 8 页 )
谷草通透性 、 吸湿性好 , 柔软适中 ,不易刺伤
蛹体 ,感染病源机率低 ,对蛹 、 蛾均有一个 良
好的保护环境 ;焦糖虽然吸湿性好 ,但极易刺
伤蛹体 ,增加病源感染机率 , 增加死亡率 ;海
绵虽柔软 ,但降温 、 通透性 、 吸湿性能差 ,蛹体
温度过高 ,病源繁殖 、 浸染机率高 , 增加死亡
率 。 在调查中还发现 ,麻网摊放蛹的试验区 ,
死蛾发生情况特别多 , 究其原 因 , 与材料通透
性 、 吸湿性能有直接关系 。
谷草节摊蛹发蛾率高 , 但不易复鉴蛹 。
在生产中 , 为了减少错误率 , 提高杂交率 ,在
摊蛹前就应复鉴完毕 。 另外 ,焦糠摊蛹 ,对于
产生旋蛹的品种不宜采用 , 复鉴蛹的时候也
要注意动作轻 ,避免粗放操作刺伤蛹体 ,增加
死蛹 。
综上所述 , 笔者认为 , 为了提高发蛾率 ,
蛹期保护材料宜用干燥清洁的谷草节 。