全 文 ：第 53 卷 第 1 期
2014 年 1 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA SCIENTIAＲUM NATUＲALIUM UNIVEＲSITATIS SUNYATSENI
Vol. 53 No. 1
Jan. 2014
利用 SSＲ及 ISSＲ分子标记研究苜蓿属及其
近缘植物的亲缘关系
*
李飞飞1，羊海军2，崔大方2，3
(1． 中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081;
2． 华南农业大学公共基础实验教学中心，广东 广州 510642;
3． 华南农业大学林学院，广东 广州 510642)
摘 要:利用 30 对 SSＲ引物和 12 个 ISSＲ引物对苜蓿属 (Medicago)及其近缘植物共 11 个物种的亲缘关系进
行研究。通过遗传多样性研究及 UPGMA聚类分析显示，“阔荚类群”(subgen． Platycapos)的 4 个种在两种分子
标记下都聚为一支，符合其相似的形态学特征;“阔荚类群”在 SSＲ 分子标记中与胡卢巴属 (Trigonella)聚成
一支，网脉胡卢巴 (T． cancellata)在 ISSＲ分子标记中聚在“阔荚类群”中;两种分子标记中，“紫花苜蓿复合
体”(Medicago sativa complex)3 个种间的遗传距离都最短;南苜蓿 (M． polymorpha)在两种分子标记下的聚类
结果有所不同，SSＲ分子标记下与胡卢巴属的亲缘关系更近。研究说明苜蓿属与胡卢巴属具有很近的亲缘关系，
苜蓿属内不同物种与胡卢巴属的亲缘关系有远有近，其中苜蓿属中的“阔荚类群”与胡卢巴属的关系最近，苜
蓿属中其他物种与胡卢巴属的亲缘关系较远。
关键词:苜蓿属;近缘植物;分子标记;亲缘关系
中图分类号:Q949. 7 文献标志码:A 文章编号:0529 － 6579 (2014)01 － 0113 － 08
Genetic Ｒelationships Among 11 Species of Medicago and Ｒelative
Species Using Microsatellite (SSＲ and ISSＲ)Markers
LI Feifei1，YANG Haijun2，CUI Dafang2，3
(1． College of Life and Environmental Science，Central University for Nationalities，Beijing 100081，China;
2． Center of Experimental Teaching for Common Basic Courses，South China Agricultural University，
Guangzhou 510642，China;
3． College of Forestry，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)
Abstract:The genetic relationships among 11 species of Medicago and relative species were studied by
using 30 pair of SSＲ primers and 12 ISSＲ primers． Based on genetic diversity analysis and UPGMA clus-
ter analysis the results showed that 4 species of subgen． Platycapos were clustered together，related to
their similar morphological characteristics;species of subgen． Platycapos were clustered with Trigonella，
while T． cancellata were nested in subgen． Platycapos clade;the genetic distances among 3species of M．
sativa complex were shortest;M． polymorpha was closer to Trigonella in ISSＲ results． Thus Trigonella
had close genetic relationship with Medicago，especially species of subgen． Platycapos，and relatively
farther from other species in Medicago．
Key words:Medicago;relative species;microsatellite markers;genetic relationships
* 收稿日期:2013 － 07 － 21
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30670145)
作者简介:李飞飞 (1983年生) ，女;研究方向:系统与演化植物学;通讯作者:崔大方;E-mail:cuidf@ scau. edu. cn
DOI:10.13471/j.cnki.acta.snus.2014.01.006
中山大学学报 (自然科学版) 第 53 卷
苜蓿属 (Medicago)是属于豆科 (Legumino-
sae)车轴草族 (Trifolieae)的一年生或多年生草
本。因其富含蛋白质、维生素和各种矿物质，其营
养价值为各类牧草之首，并在我国种植已有 2000
多年历史，对我国畜牧业做出了重要贡献。其中，
紫花苜蓿 (M． sativa)更被誉为 “牧草之王”，在
我国栽培最为广泛。自瑞典植物学家林奈在 18 世
纪创立苜蓿属以来，全世界至今已记载苜蓿属植物
达 100 多种［1］，分布在欧、亚、非三洲，《中国植
物志》将我国苜蓿属植物分为 13 个种，1 个变种，
主要分布于黄河流域的华北、西北地区［2］。
苜蓿属及其近缘植物的分类学问题主要存在于
两个方面。①苜蓿属有些种与胡卢巴属 (Trigonel-
la)在形态、生长习性及染色体数目上相似，形成
大量的中间类群。②苜蓿属内种间由于自然杂交或
环境饰变而出现许多复合体类群，如 Quiros ＆
Bauchan (1988)利用蛋白标记根据紫花苜蓿的进
化路线，将 Lesins ＆ Lesins (1979)系统中与紫花
苜蓿可以天然杂交的黄花苜蓿、多变苜蓿、Medi-
cago cretacea M． Bieb．、Medicago tunetana (Murb．)
A． W． Hill和 Medicago glutinosa M． Bieb． 5 个种合
并称为“紫花苜蓿复合体” (Medicago sativa com-
plex)等。因此按照历史上不同分类学家的处理，
苜蓿属及其近缘植物的分类曾一度错综复杂。国内
外学者对苜蓿属及其近缘植物在分类学上做了一定
的研究:Urban I．［3］最早将苜蓿属分为 11 个组
(section)共包括 46 个种，并把幼苗子叶片和子叶
柄之间有无明显的关节作为区分苜蓿属和胡卢巴属
重要的依据;Lesins K． A． 等［4］从形态学、细胞学
和杂交实验等方面对苜蓿属做了更为详尽的研究，
建立了一个包含 56 个种的系统;Small E. 等［5］发
现许多胡卢巴属植物在花的综合性状、种子形态结
构等方面具有较高的相似性，在聚类分析中常与苜
蓿属聚到一起，因此将 Lesins K． A． 和 Lesins I．
系统中的部分种类进行合并，又将先前被认为是胡
卢巴属的 23 个与苜蓿属有共同特征的种 “medica-
goid”划归到苜蓿属中，使苜蓿属种数扩大到 83
个种，分成 12 个组;但我国学者多将 “medica-
goid”中的角型果组 sect． Bucerates 放在胡卢巴属
中;而 Bena G．［6］利用分子系统学方法，比较了
Small E． 系统中从胡卢巴属中转移过来的 10 个种
与苜蓿属其他 53 个种的亲缘关系，认为这些中间
类群宜归于苜蓿属，提出建立一个新组的观点。
与欧美所不同的是，我国在分属上还有较大歧
义，其中多年生阔荚类植物的分类问题最多，主要
表现在扁蓿豆属 (Melissitus)和黑荚豆属 (Tu-
rukhania)的设立上。 《中国植物志》则摈弃扁蓿
豆属和黑荚豆属 2 个属，将其中的种分别归入苜蓿
属和胡卢巴属内，共收录我国境内胡卢巴属 9 种，
苜蓿属 13 种［2］;崔大方等［7］将多年生阔荚类群
(包含扁蓿豆属和黑荚豆属)归属苜蓿属，并建立
阔荚亚属 (subgen． Platycapos) ，包含由西向东通
过青藏高原、蒙古高原、华西台地向着荒漠草原的
种类演化的阔荚苜蓿 (Medicago platycarpos)、克什
米尔苜蓿 (M． cachemiriana)、青海苜蓿 (M．
archiducis-nicolai)、花苜蓿 (扁蓿豆) (M． rutheni-
ca)以及偏南趋向暖热谷地的毛荚苜蓿 (M． edge-
worthii) ;韦直［8］认为自然存在的仅有苜蓿属和胡
卢巴属，而扁蓿豆属无论作为属或属下等级都不合
乎分类系统的事实，但近来受欧美分类思想的影响
有重新归属中间类群的趋向。此外，Melissitus、
Pocockia常被认为是胡卢巴属的异名;Turukhania
则被作为苜蓿属的异名。Eig A．［9］将 Trigonella as-
chersoniana从胡卢巴属中分离出来成为一个单种属
Factorovskya;Vassilczenko I. T. ［10］将 Medicago ar-
borea从苜蓿属中分离出来建立一个单种属 Ｒhodu-
sia。Small E. 等［11］对上述两属并不支持，指出
Ｒhodusia的成属依据相当不充分，而 Factorovskya 在
亲缘关系上也依然是扑朔迷离。事实上，在查阅文
献过程中，我们都很少见到这 2个属被引证的情况。
20 世纪 70 年代起，分子系统学研究进入了核
酸水平时期。SSＲ、ISSＲ、AFLP 及其他分子标记
技术被广泛的应用于动植物的遗传多样性研究
中［12 － 14］，分子标记技术从 20 世纪 90 年代初就开
始应用于苜蓿种质资源研究中，国内外许多学者都
曾使用 ＲAPD、AFLP、SSＲ、ISSＲ等分子标记对紫
花苜蓿的栽培品种的遗传结构及指纹图谱进行了分
析和研究，证明了分子标记在苜蓿属植物遗传研究
上的可行性。刘磊等［15 － 16］通过 ISSＲ分子标记研究
黄花苜蓿、紫花苜蓿、扁蓿豆及胡卢巴属植物的亲
缘关系时发现，扁蓿豆与胡卢巴关系更近，但并未
说明二者应归于一属。
苜蓿属植物作为世界性的牧草资源，其系统分
类学的研究不仅具有重要的系统分类学意义更具有
经济学意义。本研究利用 SSＲ 及 ISSＲ 分子标记，
研究苜蓿属及其近缘植物遗传多样性及亲缘关系，
为苜蓿属及其近缘植物的种质资源评定和利用方面
的研究提供基础数据。
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第 1 期 李飞飞等:利用 SSＲ及 ISSＲ分子标记研究苜蓿属及其近缘植物的亲缘关系
1 材料和方法
1. 1 研究材料及引物
包括二倍体、四倍体在内的苜蓿属及胡卢巴属
11 种植物为材料，每个种按单株采样，各采集 15
份植株，分别放入装有硅胶的封口袋中，材料来源
及倍性见表 1。40 对 SSＲ引物来源于 Bernadette 等
发表的紫花苜蓿 SSＲ 引物［17］，37 个 ISSＲ 引物来
源于 UBC大学公布的 100 个通用引物。
表 1 苜蓿属及其近缘植物材料信息
Table 1 The information of Medicago L． and its relatives
物种 倍性 采集地
胡卢巴属 Trigonella L．
胡卢巴 T. foenum-graecum L. 2n 新疆 (栽培)
网脉胡卢巴 T. cancellata Desf. 2n 新疆
苜蓿属 Medicago L.
紫花苜蓿 M. sativa L. 2n，4n 新疆 (栽培)
黄花苜蓿 M. falcata L. 2n，4n 新疆
多变苜蓿 M. varia Martyn 2n，4n 新疆
天蓝苜蓿 M. lupulina L. 2n，4n 新疆
花苜蓿 M. ruthenica (L.)Trautv. * 2n 宁夏
毛荚苜蓿
M. edgeworthii Sirj. ex Hand. -Mazz. *
2n 四川
阔荚苜蓿M. platycarpos(L.)Trautv. * 2n 新疆
南苜蓿 M. polymorpha L. 2n Australia
青海苜蓿 M. archiducis-nicolai Sirj. * 2n 宁夏
* 为阔荚类苜蓿
1. 2 实验方法
采用改良 CTAB (Hexadecyltrimethy-ammonium
Bromide)法提取单个样品总 DNA，并用 w = 1. 0%
的琼脂糖电泳检测 DNA。利用 Eppendorf AG 22331
Hamburg紫外分光光度计检测单个样品的 DNA 浓
度，再将每个种的 15 份单株 DNA等量混合成为一
个种的 DNA池。
SSＲ反应体系:总体积 20 μL，包括 10 × Buff-
er (含 Mg2 －)2 μL，10 mmol·L －1 dNTP 0. 3 μL，
10 μmol·L －1引物各 1 μL，Taq 酶 (5 U·μL －1)
0. 2 μL，30 ng·μL －1 DNA 模板 2 μL，去离子水
13. 5 μL。SSＲ 反应程序:94 ℃变性 5 min;94 ℃
变性 30 s，54 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35
个循环;72 ℃延伸 10 min;4 ℃保存。ISSＲ 反应
体系:总体积 20 μL，包括 10 × Buffer (含 Mg2 －)
2 μL，10 mmol·L －1 dNTP 0. 25 μL，10 μmol·L －1
引物 1 μL，Taq 酶 (5 U·μL －1)0. 2 μL，30 ng·
μL －1 DNA模板 2 μL，去离子水 14. 55 μL。ISSＲ反
应程序:94 ℃变性 5 min;94 ℃变性 30 s，54 ℃
退火 45 s，72 ℃延伸 1. 5 min，42 个循环;72 ℃
延伸 7 min;4 ℃保存。
SSＲ扩增产物采用 w = 6%的聚丙烯酰胺凝胶
电泳检测，ISSＲ扩增产物采用 w = 2%琼脂糖凝胶
电泳检测。电泳结果至凝胶成像仪拍照观察，并记
录结果。
1. 3 数据统计分析
由于苜蓿属植物中既含有二倍体又含有四倍
体，所以二倍体等位基因的频率统计公式并不适合
本研究，目前统计四倍体的方法还未完善，部分统
计指数还需进一步研究。且本研究所采的植株为野
生型，如紫花苜蓿种群内既存在四倍体又存在二倍
体，无法简单区分。因此本实验统一采用 0 /1 法统
计，以扩增条带在相对迁本实验统一采用 0 /1 法统
计，以扩增条带在相对迁移位置有无，赋以 “1”
或“0”，生成分子数据矩阵。利用 PopGene 1. 32
软件［18］进行电泳谱带差异和各项遗传指数的统计
分析，包括:多态位点百分率 (PPB)、遗传相似
系数 (I)、遗传距离 (GD)。利用 GeneALEx 软件
AMOVA 计算方差分量［19］，Mental 检测相关系数
(r)。利用 Excel 计算 SSＲ /ISSＲ 标记效率指数 MI
(marker index)采用公式计算［20 － 22］。其中 Ibav 为
位点平均信息量 (average band informativeness) ，，
Pi 代表样品第 i个扩增位点所占比例，n 代表扩增
位点总数;EMＲ 为有效多元比率 (effective multi-
plex ratio) ，计算公式为 EMＲ = 多态位点数 /引物
数。并利用 NTSYS 软件采用非加权平均聚类法
(UPGMA)绘制聚类图［23］。
2 结果与分析
2. 1 SSＲ和 ISSＲ分子标记的标记效率分析
本研究从 40 对紫花苜蓿 SSＲ 引物和 37 个 IS-
SＲ通用引物中筛选出 30 对具多态性、可扩增出清
晰带谱的 SSＲ引物，占总数的 75 %;12 个具多态
性、清晰且重复性好的 ISSＲ引物，占总数的 32 %
(表 2)。
众多研究者对 ＲFLP、SSＲ、ＲAPD 及 AFLP 4
种分子标记技术进行了比较分析，综合考虑遗传稳
定性和标记系统机制，提出了标记指数 MI，标记
指数 MI是衡量不同类型标记扩增效率和扩增产物
信息含量的综合指标，并包含了鉴定亲缘关系的有
效性这一层意思［24］。11 个种间 ISSＲ 标记的 MI 值
(2. 00)与 SSＲ标记 MI 值 (1. 95)相差不大，而
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中山大学学报 (自然科学版) 第 53 卷
SSＲ标记 Ibav 值 (0. 34)是 ISSＲ 标记 Ibav 值
(0. 10)的 3. 41 倍，但 ISSＲ 标记 EMＲ 值 (20. 08)
却是 SSＲ 标记 EMＲ 值 (5. 73)的 3. 5 倍。因此
EMＲ差异是导致 ISSＲ 标记 MI 值高于 SSＲ 标记的
主要原因 (表 3)。
表 2 30 对 SSＲ和 12 个 ISSＲ引物
Table 2 30 pair of SSＲ primers and 12 ISSＲ primers
标记类型 引物
SSＲ
FMT13、 MTIC447、 MTIC258、 MTIC451、
MTIC278、 MTIC354、 MTIC189、 MTIC237、
MTIC169、MAA660456、MTIC326、B14B03、
MTIC58、 MTIC93、 MTIC153、 MTIC248、
MTIC251、 AFct45、 MAL369471、 MTIC27、
MTIC94、 MTIC183、 MTIC188、 MTIC232、
MTIC238、 MTIC249、 MTIC250、 MTIC272、
MTIC331、MTIC343
ISSＲ
814、815、817、822、823、825、873、880、
881、889、890、891
表 3 SSＲ和 ISSＲ分子标记的标记效率比较
Table 3 Compare the efficiency of SSＲ and ISSＲ primers
项目 SSＲ ISSＲ
引物数 30 12
总位点数 172 241
平均位点数 5. 733 20. 083
多态性比率 (PPB /%) 100 100
位点平均信息量 (Ibav) 0. 341 0. 1
有效多元比率 (EMＲ) 5. 733 20. 083
标记指数 (MI) 1. 954 2
利用 Mantel检测对 SSＲ和 ISSＲ分子标记的遗
传距离矩阵进行了相关性检验，基于 11 个物种的
分析，SSＲ和 ISSＲ 分子标记的遗传距离存在显著
相关性 (r = 0. 709，t = 3. 016)。
2. 2 遗传多样性分析
11 个种 PCＲ扩增结果显示:①30 对 SSＲ引物
扩增出 172 条带，多态性比率 PPB 为 100 %，平
均每个种扩增出 51 条多态性条带，一年生、多年
生种平均多态性条带分别为 46 和 53 条，多年生种
多态性条带平均数略多于一年生种;二倍体、二倍
体四倍体共有种平均多态性条带分别为 44 和 63，
二倍体四倍体共有种多态性条带平均数略多于二倍
体种。②12 个 ISSＲ 引物共扩增出 241 条带，多态
性比率 PPB为 100 %，每个种平均扩增出 45 条多
态性条带，一年生、多年生种多态性条带分别为
49 和 43 条，一年生种多态性条带平均数略多于多
年生种;二倍体种、二倍体四倍体共有种平均多态
性条带分别为 43 和 48，二倍体四倍体共有种多态
性条带平均数略多于二倍体种。表明在 11 个种间
两种标记都表现出了较高的多态性。
SSＲ和 ISSＲ分子标记在 11 个所选种间的 Neis
遗传距离 GD变幅分别为 0. 05 (多变苜蓿与紫花苜
蓿)～ 0. 67 (紫花苜蓿与花苜蓿)和 0. 07 (多变苜
蓿与紫花苜蓿)～ 0. 47 (紫花苜蓿与胡卢巴) ，平均
值分别为 0. 47 和 0. 36，SSＲ 标记大于 ISSＲ 标记，
表明 11个物种间存在相当程度的分化 (表 4，5)。
UPGMA聚类表明 (图 1，2) ，SSＲ 和 ISSＲ 分
子标记分别得到了相近但不完全相同的聚类树。紫
花苜蓿、黄花苜蓿以及多变苜蓿在两个分子标记下
遗传距离均最小。花苜蓿、毛荚苜蓿、阔荚苜蓿以
及青海苜蓿属于 “阔荚类群”的 4 个种在两种分
子标记下均可以聚为一支。不同的是，在基于 SSＲ
分子标记的聚类树中，分为主要的两支，其中一支
包含紫花苜蓿、黄花苜蓿、多变苜蓿以及天蓝苜
蓿。“阔荚类群”和胡卢巴属的两个种聚为另外一
支，在这支下“阔荚类群”形成一个亚支，胡卢巴
属两个种和南苜蓿形成了另外一个亚支。而在基于
ISSＲ分子标记的聚类树中，胡卢巴与其他物种明
显区别开，单独形成一支，在其他物种的分支内，
“阔荚类群”和网脉胡卢巴聚为一个亚支，而 “紫
花苜蓿复合体”的三个种与天蓝苜蓿聚为一个亚支。
Thorpe曾指出，当一个种群的分类地位用其他
方法难以解决时，应使用遗传相似系数 I 信息［25］。
为了进一步揭示 “阔荚类群”同苜蓿属其他种及
胡卢巴属之间的遗传关系，表 6 列出了两种分子标
记下，“阔荚类群”4 个种同苜蓿属余下的 5 个种
及胡卢巴属 2 个种之间的平均遗传相似系数。
Thorpe通过分析研究后认为:遗传相似系数 I ＜
0. 85 的两种群，不可能是同一物种;同科属间 I
范围是 0. 1 ～ 0. 5;种间 I范围为 0. 2 ～ 0. 8;而同种
种群间 I的范围是 0. 8 ～ 0. 97［25］。本结果显示，在
两种分子标记中苜蓿属 (除 “阔荚类群”外)与
胡卢巴属平均遗传相似系数 I 分别为 0. 60 (SSＲ)
和 0. 64 (ISSＲ) ，“阔荚类群”与苜蓿属其他种平
均遗传相似系数 I分别为 0. 56 (SSＲ)和 0. 63 (IS-
SＲ) ，“阔荚类群”与胡卢巴属平均遗传相似系数 I
分别为 0. 63 (SSＲ)和 0. 66 (ISSＲ)。可见结果中 I
值均略大于 0. 5，表明苜蓿属与胡卢巴属亲缘关系
很近，“阔荚类群”与两个属之间的平均遗传相似系
数 I相差不大，与胡卢巴属两个种亲缘关系更近一些。
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第 1 期 李飞飞等:利用 SSＲ及 ISSＲ分子标记研究苜蓿属及其近缘植物的亲缘关系
表 4 基于 SSＲ分子标记苜蓿属 11 个种的 Neis遗传距离 GD(左下角)及遗传相似系数 I (右上角)
Table 4 Neis genetic distance(left corner)and genetic similar coefficient(right corner)of 11 Medicago species based on SSＲ markers
物种编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 ＊＊＊＊ 0. 58 0. 61 0. 61 0. 60 0. 67 0. 58 0. 63 0. 76 0. 69 0. 65
2 0. 55 ＊＊＊＊ 0. 91 0. 51 0. 66 0. 58 0. 95 0. 53 0. 55 0. 60 0. 53
3 0. 49 0. 10 ＊＊＊＊ 0. 56 0. 67 0. 61 0. 92 0. 59 0. 60 0. 62 0. 58
4 0. 49 0. 67 0. 58 ＊＊＊＊ 0. 53 0. 75 0. 52 0. 71 0. 53 0. 58 0. 80
5 0. 50 0. 42 0. 40 0. 64 ＊＊＊＊ 0. 56 0. 67 0. 55 0. 57 0. 61 0. 52
6 0. 39 0. 55 0. 49 0. 29 0. 58 ＊＊＊＊ 0. 58 0. 76 0. 64 0. 66 0. 78
7 0. 55 0. 05 0. 08 0. 65 0. 40 0. 55 ＊＊＊＊ 0. 55 0. 55 0. 60 0. 54
8 0. 46 0. 63 0. 52 0. 34 0. 59 0. 27 0. 60 ＊＊＊＊ 0. 67 0. 59 0. 78
9 0. 28 0. 59 0. 51 0. 64 0. 56 0. 45 0. 59 0. 40 ＊＊＊＊ 0. 69 0. 62
10 0. 37 0. 50 0. 48 0. 54 0. 49 0. 42 0. 50 0. 52 0. 37 ＊＊＊＊ 0. 58
11 0. 43 0. 64 0. 55 0. 23 0. 65 0. 25 0. 61 0. 24 0. 48 0. 55 ＊＊＊＊
1:胡卢巴 Trigonella foenum-graecum L.;2:紫花苜蓿 Medicago sativa L．;3:黄花苜蓿 M． falcata L．;4:花苜蓿M． rutheni-
ca (L．)Trautv．;5:天蓝苜蓿 M． lupulina L．;6:毛荚苜蓿 M． edgeworthii Sirj． ex Hand. － Mazz．;7:多变苜蓿 M． varia
Martyn;8:阔荚苜蓿 M． platycarpos (L．)Trautv．;9:网脉胡卢巴 T． cancellata Desf．;10:南苜蓿 M． polymorpha L．;
11:青海苜蓿 M． archiducis-nicolai Sirj．
表 5 基于 ISSＲ分子标记苜蓿属 11 个种的 Neis遗传距离 GD (左下角)及遗传相似系数 I (右上角)
Table 5 Neis genetic distance(left corner)and genetic similar coefficient(right corner)of 11 Medicago species based on ISSＲ markers
物种编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 ＊＊＊＊ 0. 63 0. 69 0. 67 0. 64 0. 70 0. 64 0. 64 0. 69 0. 68 0. 64
2 0. 47 ＊＊＊＊ 0. 83 0. 67 0. 69 0. 70 0. 93 0. 64 0. 66 0. 69 0. 63
3 0. 37 0. 19 ＊＊＊＊ 0. 75 0. 70 0. 78 0. 87 0. 70 0. 72 0. 75 0. 71
4 0. 40 0. 40 0. 29 ＊＊＊＊ 0. 68 0. 79 0. 71 0. 70 0. 73 0. 69 0. 73
5 0. 44 0. 37 0. 35 0. 38 ＊＊＊＊ 0. 69 0. 71 0. 68 0. 65 0. 68 0. 66
6 0. 35 0. 35 0. 25 0. 24 0. 37 ＊＊＊＊ 0. 71 0. 73 0. 76 0. 73 0. 76
7 0. 44 0. 07 0. 14 0. 35 0. 34 0. 34 ＊＊＊＊ 0. 67 0. 68 0. 70 0. 64
8 0. 44 0. 44 0. 35 0. 36 0. 38 0. 32 0. 40 ＊＊＊＊ 0. 65 0. 65 0. 76
9 0. 37 0. 41 0. 33 0. 32 0. 43 0. 28 0. 38 0. 43 ＊＊＊＊ 0. 71 0. 69
10 0. 38 0. 37 0. 29 0. 37 0. 39 0. 32 0. 35 0. 43 0. 34 ＊＊＊＊ 0. 66
11 0. 45 0. 46 0. 35 0. 31 0. 42 0. 27 0. 45 0. 27 0. 37 0. 42 ＊＊＊＊
1:胡卢巴 Trigonella foenum-graecum L.;2:紫花苜蓿 Medicago sativa L.;3:黄花苜蓿 M. falcata L.;4:花苜蓿 M. ruthenica
(L.)Trautv.;5:天蓝苜蓿 M． lupulina L．;6:毛荚苜蓿 M． edgeworthii Sirj． ex Hand. － Mazz．;7:多变苜蓿 M． varia Martyn;
8:阔荚苜蓿M． platycarpos (L．)Trautv．;9:网脉胡卢巴 T． cancellata Desf．;10:南苜蓿M． polymorpha L．;11:青海苜蓿M．
archiducis-nicolai Sirj．
表 6 “阔荚类群”、苜蓿属 (Medicago) (除“阔荚类群”外)及胡卢巴属 (Trigonella)平均遗传相似系数 I
Table 6 The average genetic similarity coefficient (I)of subgen． Platycarpos，Medicago (except subgen． Platycarpos)and Trigonella
种群名
SSＲ标记
阔荚类群
Platycarpos
胡卢巴属
Trigonella
苜蓿属
Medicago
ISSＲ标记
阔荚类群
Platycarpos
胡卢巴属
Trigonella
苜蓿属
Medicago
阔荚类群 Platycarpos 0. 763 6* 0. 753 0*
胡卢巴属 Trigonella 0. 627 9 0. 755 8* 0. 661 0 0. 704 6*
苜蓿属 Medicago 0. 562 2 0. 602 3 0. 721 0* 0. 634 9 0. 642 9 0. 740 9*
＊标注的为同一类群种间的平均遗传相似系数 I
711
中山大学学报 (自然科学版) 第 53 卷
图 1 基于 SSＲ标记苜蓿属 (Medicago L．)及胡卢巴属 (Trigonella L．)11个种聚类图
Fig. 1 UPGMA dendrograms of the genetic relationships among 11species of Medicago L． and Trigonella L． constructed from
estimated simple matching genetic distance based on SSＲ markers
图 2 基于 ISSＲ标记苜蓿属 (Medicago L．)及胡卢巴属 (Trigonella L．)11个种聚类图
Fig. 2 UPGMA dendrograms of the genetic relationships among 11species of Medicago and Trigonella constructed from
estimated simple matching genetic distance based on ISSＲ markers
3 讨 论
3. 1 SSＲ与 ISSＲ分子标记评价
分子标记的应用性评价是开展遗传多样性分析
的基础工作之一［26］。由于所用标记技术和材料的不
同，得到的结果会不一致。1995年 7月 30日召开的
美国园艺学会 (ASHS)第 92 届年会上，与会专家
一致认为四大标记系统综合效用大小应该是 AFLP
＞ SSＲ ＞ ＲAPD ＞ ＲFLP。Belaj 等通过研究橄榄
Canavium album遗传关系比较 ＲAPD、AFLP 和 SSＲ
标记的效用，结果发现 SSＲ标记具有更高的多态性
并获得更多的信息量［27］。Archak 等［22］的研究表明，
AFLP标记较 ISSＲ、ＲAPD标记更适于腰果的遗传多
样性分析。
在本研究中，对比两种标记在 11 个种间和 M．
sativa complex 3个种间的标记指数，结果表明 ISSＲ
标记 MI值略高于 SSＲ 标记，说明前者比后者具有
较高的标记效率。MI组成参数的比较发现，ISSＲ标
811
第 1 期 李飞飞等:利用 SSＲ及 ISSＲ分子标记研究苜蓿属及其近缘植物的亲缘关系
记具有更多的多态性位点，即具有高的 EMＲ值，这
是 ISSＲ标记的 MI值高于 SSＲ标记的主要原因，而
SSＲ的 Ibav值高于 ISSＲ标记。同 11 个种间相比在
复合体类群内部的物种间两种标记的 EMＲ值大幅减
小，而 Ibav值却有所升高。Ibav 是多样性指数的一
种修正计算方法［22］，是扩增位点多态性程度的直接
体现，因此认为 SSＲ、ISSＲ标记在复合体种间具有
高度的多态性，适于亲缘关系较近的种群分析。但
由于 SSＲ 是共显性标记，而在本研究中由于所测
DNA是 15个样品等量 DNA的混合以及四倍体的存
在，故采用显性标记统计方法，使得共显性标记的
优势大大下降，这可能也是 SSＲ标记指数略低于 IS-
SＲ标记指数的主要原因之一。
两个分子标记下的遗传距离具有明显的相关性，
并且对比基于 SSＲ与 ISSＲ分子标记的遗传多样性研
究结果，11个种间聚类图虽不完全相似，但都能有
效的区分出“阔荚类群”与紫花苜蓿、黄花苜蓿及
多变苜蓿这 3 个“紫花苜蓿复合体”种，与物种的
倍性水平和形态学相似程度存在较高的一致性，表
明两种标记在苜蓿属植物种间分析是有效的。
3. 2 苜蓿属及其近缘植物亲缘关系分析
在基于两种分子标记的 UPGMA 聚类图中，可
以看出胡卢巴属物种与苜蓿属物种并不能有效的区
分出来。SSＲ标记中，胡卢巴属两个种虽然遗传关
系较近，但却与南苜蓿及“阔荚类群”的 4 个种聚
成了一个分支，与苜蓿属其他种区分明显。ISSＲ标
记中，胡卢巴与苜蓿属其他物种区分开，而网脉胡
卢巴却聚在了 “阔荚类群”中。这与刘磊等［15 － 16］
通过 ISSＲ研究扁蓿豆 (M． ruthenica)与胡卢巴关
系更近的结果相似。Baum［28］指出，胡卢巴属的花丝
联合部上缘则近截平，内部维管束无增厚，花丝分
离处不加宽，与 Larkin 和 Graumann［29］研究的苜蓿
属雄蕊的特征不同，从而可将这 2 个属划分开来，
此区分特征后被 McComb［30］否定，因为天蓝苜蓿的
花丝分离部的下端仅有轻微的趋宽迹象。而在聚类
树上，天蓝苜蓿与胡卢巴属的亲缘关系都较远。对
比“阔荚类群”，苜蓿属 (除“阔荚类群”外)同
胡卢巴属间的平均遗传相似系数，均已超出
Thorpe［25］认为的一般类群属间平均遗传相似系数范
围，并且“阔荚类群”与胡卢巴属间的平均遗传相
似系数最高。邢建军等利用细胞染色体技术对苜蓿
属及胡卢巴属亲缘关系研究的发现:胡卢巴属植物
与苜蓿属的扁蓿豆材料亲缘关系较近，与苜蓿属的
其它材料亲缘关系较远［31］。本研究中 SSＲ标记的聚
类分析显示南苜蓿与胡卢巴属的两个种遗传距离较
近，而在 ISSＲ标记中与紫花苜蓿复合体及天蓝苜蓿
聚成一支，可见与胡卢巴属遗传关系相近的并不仅
有“阔荚类群”。因而本研究结果更加证实了胡卢
巴属与苜蓿属在亲缘关系上的密切性，但由于分析
方法的不同与前人的研究结果有相似性但也有一定
的差异。
两种标记中，花苜蓿、青海苜蓿、毛荚苜蓿以
及阔荚苜蓿这 4个果实形态特征为荚果扁、阔镰形、
矩圆形或椭圆形的种均可聚为一类，进一步说明了
“阔荚类群”无论从形态上还是分子水平上都应当
归为一个类群。而紫花苜蓿复合体的 3 个种在两种
分子标记下，都是遗传距离最近的种。且二倍体、
四倍体共有种在两种分子标记下都聚在一支上，除
与其他仅有二倍体的物种有所区分，该结果也与细
胞学的研究结果相符合［31］。
4 结 论
本研究从分子水平上可以看出苜蓿属与胡卢巴
属亲缘关系很近，尤其是苜蓿属中“阔荚类群”在
两种分子标记下呈现了与胡卢巴属较近的亲缘关系。
而“紫花苜蓿复合体”3 个种及天蓝苜蓿与胡卢巴
属亲缘关系较远，南苜蓿在两种分子标记下与胡卢
巴属的亲缘关系有所不同。而胡卢巴在 ISSＲ分子标
记下也呈现了与其他物种较远的亲缘关系。可见苜
蓿属内不同物种与胡卢巴属的亲缘关系有所区别，
且基于不同的研究手段结果也有所区别。因此胡卢
巴属与苜蓿属的分类地位需随两个属内物种材料的
进一步丰富及将不同的分析手段结合从而得到进一
步解决。
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