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2010 年 第 55 卷 第 21 期：2099 ~ 2105
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英文引用格式: Wu Q, Cheng H, Liu F, et al. Screen of FISH marker of chromosomes at Gossypium D genome species (in Chinese). Chinese Sci Bull (Chinese Ver), 2010,
55: 2099—2105, doi: 10.1360/972010-157
论 文
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS
棉属 D 基因组棉种着丝粒 FISH 标记的筛选初报
吴琼①②*, 程华①③*, 刘方①, 王省芬④, 王春英①, 宋国立①, 黎绍惠①, 张香娣①, 王玉红①,
马峙英④†, 王坤波①†
① 中国农业科学院棉花研究所, 农业部棉花遗传改良重点实验室, 安阳 455000;
② 辽宁省农业科学院经济作物研究所, 辽阳 111000;
③ 安阳工学院生物与食品工程学院, 安阳 455000;
④ 河北农业大学河北省作物种质资源重点实验室, 保定 071001
* 同等贡献
† 联系人, E-mail: wkbcri@cricaas.com.cn; mzhy@hebau.edu.cn
2010-03-23 收稿, 2010-05-21 接受
国家自然科学基金(30170501)和国家高技术研究发展计划(2003AA207051)资助项目

摘要 为了筛选着丝粒探针, 在棉花染色体荧光原位杂交中标记染色体着丝粒区域, 以便于构
建棉花粗线期染色体细胞遗传学图谱. 在棉花遗传连锁图上选择尽可能接近着丝粒区的单拷
贝的分子标记, 以海岛棉 pima 90-53 的 BAC 文库为素材, 采用两维筛库法从该文库中筛选
BAC克隆, 然后用 BAC-FISH技术进行染色体定位检测. 用 10号染色体长臂末端的 SSR引物
BNL3563筛选到一个BAC克隆150D24, 该克隆在四倍体陆地棉和海岛棉部分染色体着丝粒区
有杂交信号, 但信号强度不高. 以二倍体D基因组为靶DNA进行 FISH时, 染色体着丝粒区有
明显信号, 但是以二倍体 A, C, E等基因组棉种染色体为靶 DNA进行 FISH时, 染色体着丝粒
区未发现杂交信号. BAC克隆 150D24可能含有 D组特有卫星重复序列, 可用作棉属 D基因组
棉种(包括四倍体棉种 D亚组)的着丝粒 FISH探针.
关键词
棉花
FISH
着丝粒
BAC


经典细胞遗传学识别染色体的方法主要是通过
分析染色体的相对长度、臂比、随体以及与特定遗传
材料杂交后代染色体的特征等来实现的 , 这些方法
广泛应用于各物种的核型研究中 , 为棉花的细胞遗
传学研究奠定了基础[1~7]. 这些方法首先需要掌握良
好的制片技术 , 其次由于制片过程中染色体凝聚程
度不同造成形态差异, 使得分析结果很难达到一致,
研究者必须通过多次重复的数据来确保结果的准确
性 , 但仍然避免不了制片过程中产生的染色体变形
对实验结果造成的影响, 实验重复性较差. 四倍体棉
花染色体数量多、形态小, 而且染色体多是中部或亚
中部着丝粒类型, 再加上在染色体制片过程中, 棉花
细胞质浓厚 , 细胞壁较坚硬 , 处理细胞比较困难等 ,
这些都为核型分析带来很大的困难 , 使得棉花核型
分析工作停滞不前 , 其细胞遗传研究工作已远远落
后于其他重要经济作物[8~17]. 减数分裂粗线期染色体
比有丝分裂中期染色体长, 有更好的空间分辨率, 在
粗线期染色体上进行荧光原位杂交 (fluorescence in
situ hybridization, FISH), 其分辨率能够达到低于 100
kb 的水平[18]. 对于染色体较小、形态相近的植物而
言, 利用粗线期染色体结合着丝粒、染色体臂位与端
粒标记, 不仅可以大大提高 FISH 的分辨率, 弥补中
期染色体不能识别单条染色体的缺陷 , 而且可较为
精确地测量染色体的长度, 在基于 FISH 的核型分析
中能够更准确地鉴别染色体及其大小 , 这种方法已
被应用于许多植物细胞学图的构建 [19~21]. 利用粗线
期染色体-FISH (pachytene-FISH)技术已成为构建分
子细胞遗传学图的首选方法.



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着丝粒是指中期染色体上染色较浅且发生缢缩
的部位, 着丝粒的功能高度保守, 但 DNA 组成成分
差异较大. 研究表明, 着丝粒包含不同类型的重复序
列组成的复杂的 DNA 结构, 如高度重复的卫星序列
(satellite DNA)、还原转座子(centromeric retrotrans-
poson, CR)等, 水稻、小麦、玉米中着丝粒 DNA 序列
研究得较深入 [22~24]. 棉花粗线期染色体着丝粒区缢
缩不明显, 且没有合适的形态标志, 水稻和拟南芥等
植物中可以通过 DAPI 染色深浅来确定粗线期染色体
着丝粒的位置 , 但是用这种方法很难确定棉花粗线
期染色体着丝粒位置 , 所以筛选棉花着丝粒探针对
构建棉花粗线期细胞学图有重要意义 . 因此本实验
试图在海岛棉 pima90-53 BAC 文库中筛选出位于着
丝粒区的 BAC 克隆作为着丝粒 FISH 探针, 用于构建
棉花的的分子细胞遗传学图谱.
1 材料与方法
(ⅰ) 实验材料. 本实验中采用的材料包括陆地
棉 G. hirsutum [(AD)1]、海岛棉 G. barbadense [(AD)2]、
阿非利加棉 G. herbaceum var. africanum (A1-a)、亚洲
棉 G. arboretum (A2)、瑟伯氏棉 G. thurberi (D1)、辣
根棉 G. armourianum (D2-1)、戴维逊氏棉 G. davidsonii
(D3-d)、克劳茨基棉 G. klotzschianum (D3-k)、旱地棉
G. aridum (D4)、雷蒙地棉 G. raimondii (D5)、拟似棉
G. gossypiodies (D6)、三裂棉 G. trilobum (D8)、斯特
提棉 G. sturtianum (C1)和索马里棉 G. somalense (E2),
以上所有材料都种植于中国农业科学院棉花研究所
海南野生棉种质圃, 并在河南安阳温室中有备份.
实验中所用 SSR 标记来自遗传连锁图谱 TM-1×
3-79(http://cottondb.org), 选择在遗传连锁图上可能
接近着丝粒区的分子标记 , 或位于染色体长臂或短
臂末端的分子标记用于筛选染色体特异 BAC 探针(表
1). 实验所用的海岛棉 Pima 90-53 BAC 文库由河北
农业大学作物种质资源重点实验室马峙英教授惠赠.
(ⅱ) 两维法筛选文库. 将每块 384 孔板的 BAC
克隆混合成一个混合池(Plate-pool)(一级池), 提取
BAC DNA. 分别以混合的 BAC DNA 为模板, 以筛
选的 SSR 引物进行 PCR 扩增; 获得的阳性 384 孔板
再分别进行二维筛选[28], 即以 384 孔板的行混和列
混(二级池)为模板, 经过菌液 PCR 扩增相应的 SSR
引物. 菌液 PCR 反应体系: 模板 2.5 μL, Taq DNA 聚
合酶 0.5 U, 引物 0.5 μmol/L, dNTP 200 μmol/L, 10 ×
表 1 本实验筛选的染色体特异的 SSR 标记
编号 SSR 标记 染色体号或臂 引物扩增片段大小/bp
1 BNL3971 2Lo 122[25]
2 BNL2572 4 236[26]
3 BNL3995 5sh 190[25]
4 BNL1597 7 207[25]
5 BNL3563 10Lo 248[25]
6 BNL4094 11sh 173[27]
7 BNL1495 13L 189[27]
8 BNL3888 14 182[25]
9 BNL3065 16 190[25]
10 BNL3479 18Lo 256[25]
11 BNL0390 19 250[27]
12 BNL2553 20 200[25]
13 BNL3649 21 195[25]
14 BNL3408 3sh/17Lo 136/174[25]
15 BNL1440 25sh/6sh 245/270[25]
16 BNL686 9sh,23 189/144[25]
17 BNL1414 9Lo,23 128/165[25]
18 BNL3599 12sh,26 212/179[25]
19 BNL3627 8/24 184/176[25]
20 BNL252 8/24 179/169[25]
21 BNL1350 1/15 197/207[25]
22 BNL1045 22/26 215[26]

缓冲液 2 μL, 总反应体积 20 μL. 反应程序为: 95℃
预变性 10 min; 93℃, 15 s, 55℃, 30 s, 72℃, 60 s, 40 个
循环; 72℃延伸 6 min. 扩增产物经 8%聚丙烯酰胺凝
胶电泳, 银染检测.
(ⅲ) 染色体制备. 预处理及染色体制片按王春
英等人 [29]的方法稍加改进 . 种子温水中浸种过夜 ,
播种于经煮沸消毒的潮湿的细沙中, 置 25~30℃萌发.
待根长至 3~5 cm 时取根尖, 25 mg/L 放线菌酮 20℃预
处理 2 h, 蒸馏水洗 10 min, 卡诺(乙醇:冰乙酸 = 3:1)
固定 2~24 h. 2%纤维素酶(Cellulase R-10, Sigma)和
0.5%果胶酶(Pectinase, Sigma)混合液 37℃处理 30 min,
60%乙酸压片, 液氮揭盖片, 4℃保存.
( ⅳ ) 探 针 的 标 记 . 探 针 标 记 试 剂 盒 为 德 国
Roche 公司的 Bio-Nick Translation 标记系统, 按照其
标准流程操作.
(ⅴ ) 原位杂交流程 . 制片在 60℃烘烤过夜 ,
100 μg/mL RNase A (2×SSC 配制) 37℃温育 1 h, 2×
SSC, 3×5 min 洗涤, 0.1% Pepsin (10 mmol/L HCI 配
制)37℃温育 30 min, 4%的多聚甲醛 37℃固定 10 min,
2×SSC 洗 3×5 min, 70%去离子甲酰胺溶液 80℃预
变性 2 min, 玻片迅速浸入−20℃的 70%, 90%, 100%
酒精各 3 min, 风干备用. 取 20 μL 杂交液滴于制片
上, 加盖片 80℃共变性 10 min, 37℃杂交过夜.




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论 文
(ⅵ) 洗脱和信号检测. 2×SSC 漂去盖片, 2×
SSC (含 0.1%SDS) 37℃洗脱 3×5 min, 0.2×SSC (含
0.1% SDS) 37℃洗脱 3×5 min, 2×SSC 室温下洗 2 次,
甩干制片, 加 5% BSA 于 37℃封阻 30 min, 甩干封阻
液(制片不能见干), 加 Avidin-FITC 抗体 37℃温育 1 h, 1
×PBS (Teween 20) 37℃洗脱 3×5 min, DAPI 衬染
10 min, 1×PBS 洗脱 3×3 min, 晾干, 抗荧光衰减剂
(Vectashied)封片.
(ⅶ) 荧光观察. 在荧光显微镜(Ziess Axioskop
2 plus) 下观察杂交信号, Isis 系统拍摄并调节对比度
和亮度 . 用于每个特定探针的信号统计的细胞数目
为 10 个以上. 染色体形态描述、核型分析参照李懋
学和陈瑞阳[30]的标准.
2 结果与分析
2.1 BAC 克隆筛选
本研究共用了 22 对引物对 7680 个 BAC 克隆进
行筛选, 从中共筛选到 12 个阳性克隆(表 2), 以阳性
克隆作探针, 以海岛棉 pima90-53 有丝分裂中期染色
体为靶 DNA 进行原位杂交, 大多数 BAC 克隆的杂交
信号是弥散在染色体或是不在着丝粒区域 . 在实验
中发现以 SSR 标记 BNL3563 筛选到 BAC 克隆
150D24 的 DNA 为探针, 以四倍体海岛棉 pima90-53
有丝分裂中期染色体为靶 DNA 进行原位杂交, 发现
在许多较小的染色体着丝粒区位置有强弱不等的信
号(图 1(a)), 按其染色体大小来看这些大多都是 D 亚
组染色体; 在以四倍体陆地棉为靶 DNA 的原位杂交
中, 也发现了类似的现象(图 1(b)).
2.2 以 150D24 为探针的 FISH
以 BAC 克隆 150D24 为探针, 以 A 组二倍体棉
种亚洲棉(A2)、阿非利加棉(A1-a)为靶 DNA 进行原位
杂交实验, 与实验最初预期结果差距较大, 在 A 组棉
种染色体着丝点处没有发现任何信号 , 在染色体其
他位置也没有信号, 我们将这一实验重复了多次, 但
是一直都没有发现任何信号.
鉴于以 A 组棉种为靶 DNA 的实验中没有信号,
经反复考虑, 增加了以 D 组棉种为靶 DNA 的实验.
以 BAC 克隆 150D24 为探针, 以二倍体 D 组棉种戴
维逊氏棉(D3-d)有丝分裂前中期染色体作靶 DNA 进
行原位杂交 , 发现在戴维逊氏棉染色体着丝粒区有
非常明显的信号(图 1(c)), 局部放大图中(图 1(d))染
色体中部较暗的区域为着丝粒区 , 可以很清楚地看
到信号(白色箭头)位于染色体的着丝粒区. 在以二倍
体 D 组棉种瑟伯氏棉(D1)、辣根棉(D2-1)、克劳茨基
棉(D3-k)、旱地棉(D4)、雷蒙德氏棉(D5)、拟似棉(D6)、
三裂棉(D7)有丝分裂中期染色体为靶 DNA 原位杂交,
在没有重复序列的封阻条件下, 在 D 组棉种几乎每
条染色体上, 着丝粒处都发现了非常清晰的信号(图
1(e)~(k)), 而且在染色体其他位置几乎没有信号, 背
表 2 筛选获得的阳性克隆
编号 单克隆 SSR 标记 引物扩增片段
大小/bp
染色体号或臂 SSR 标记在染色体
上的位置
原位杂交信号
1 150D24 BNL3563 248 10Lo 150/260 着丝点区
2 150H22 BNL0390 231 19 234.2/322.3 弥散分布
3 149E1 BNL1440 245 6sh/25sh 121.7/167.8,
135.3/293.7
弥散分布
4 148C1 BNL2553 200 20 145.9/146 弥散分布
(含端粒区域信号)
5 160K12 BNL3592 195,188 11 29.5/161.9, 弥散分布
6 160C3 BNL3479 256 13/18Lo 61.8/211.9,
90.7/171.9
弥散分布
7 160I2 BNL0390 230 19 234.2/322.3 弥散分布
8 160H11 BNL0390 245 19 234.2/322.3 弥散分布
9 159N2 BNL3408 136 3/17 0/130.6,
55.3/84
弥散分布
10 158N13 BNL1597 207 7 169/230 弥散分布
11 157A16 BNL3649 193 11/21 77/271,
32.1/331.2
弥散分布
12 149P17 BNL3995 190 5sh 染色体端部 特异信号



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图 1 以 150D24 为探针的原位杂交图
(a) 以海岛棉 pima90 有丝分裂中期染色体为靶 DNA 的原位杂交图; (b) 陆地棉 TM-1 有丝分裂中期染色体为靶 DNA 的原位杂交图; (c) 以戴
维逊氏棉(D3-d)有丝分裂前中期染色体为靶 DNA 的原位杂交图; (d) 为(c)的局部放大图, 白色箭头示信号位于染色体着丝粒区侧翼区; (e)~(k)
以瑟伯氏棉(D1)(e)、辣根棉(D2-1) (f)、克劳茨基棉(D3-k) (g)、旱地棉(D4) (h)、雷蒙地氏棉(D5) (i)、拟似棉(D6) (j)、三列棉(D8) (k)有丝分裂中期
染色体为靶 DNA 的原位杂交图; (l) 以瑟伯氏棉(D1)有丝分裂间期染色体为靶 DNA 的原位杂交图. 标尺示 5 μm
景非常干净 , 但是在每个棉种的 FISH 图像中都有
1~2 对染色体上的信号相对较弱(绿色箭头). 在以瑟
伯氏棉有丝分裂间期细胞为靶 DNA, 以 BAC 克隆
150D24 为探针的原位杂交实验中, 我们也发现了非
常明显的信号散布在整个细胞中(图 1(l)), 如不计强
弱, 信号总数为 26 个左右.
考虑到实验的异常现象, 又增加了以 C, E 组棉
种为靶 DNA 的实验, 以 BAC 克隆 150D24 为探针,
以 C 组二倍体棉斯特提棉、E 组二倍体棉索马里棉为
靶 DNA 的原位杂交实验结果与 A 组相同, 也没有任
何 信 号 , 重 复 多 次 结 果 依 然 如 此 . 本 实 验 所 用 靶
DNA, 探针及信号具体情况详见表 3.




2103
论 文
表 3 以 BAC 克隆 150D24 为探针所用制片、细胞数及信号
AD2 AD1 D1 D2-1 D3-d D3-k D4 D5 D6 D8 A1-a A2 C1 E2
制片数目 2 2 5 2 5 6 5 5 5 5 10 10 10 10
细胞数 12 18 22 31 24 30 21 22 15 20 67 53 47 41
信号 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 无 无 无 无

3 讨论
刘三宏等人[31]发现在以 A 组二倍体阿非利加棉
作靶 DNA, 以二倍体 D 组雷蒙德氏棉基因组 DNA 作
探针, 用鲑鱼精 DNA 作封阻的 GISH 实验中, 在阿非
利加棉染色体着丝粒区处没有杂交信号出现 , 并由
此推测二倍体棉花 A 和 D 基因组经过漫长的分化,
其着丝粒区重复序列同源性很低. 在本实验中发现,
BAC 克隆 150D24 只在二倍体 D 组棉种染色体着丝
粒区域有信号, 在其他二倍体 A, C, E 组棉种染色体
着丝粒区都没有信号, 这暗示着 150D24 中可能含有
着丝点区域特有的重复序列 , 且这些重复序列在二
倍体 A, C, E 组棉种中并不存在, 也就是说 150D24
可能含有二倍体 D 组棉种的着丝粒区域特有的重复
序列. 通过仔细观察图 1(c)~(k)发现, 在二倍体 D 组
的着丝粒信号中 , 不同染色体上的信号强度是不同
的, 几乎在每张图片中都能找到 1~2 对信号较弱的染
色体(绿色箭头), 这说明 BAC 克隆 150D24 虽然含有
二倍体 D 组棉种着丝粒重复序列, 但是该重复序列
在不同的染色体上的重复次数是不同的 , 在部分一
些染色体上重复次数很少, 这说明 BAC 克隆 150D24
中所含重复序列在不同染色体间差异还是很大的 .
近年来的研究证明, 卫星 DNA(satellite DNA)和还原
转座子是植物着丝粒区含量最多有 DNA 元件, 着丝
粒特异的还原转座子(centromeric retrotransposons)序
列在相近种间是保守的, 卫星 DNA 长度在种间的长
度是保守的 , 但其组成成分即使是在较近的种间也
有很大不同[32~36], 卫星 DNA 是真核生物中进化较快
的部分 , 在亲缘关系较近的种间也呈现非常明显的
重排、序列及拷贝数的变异 [32,37]. 因此, 我们认为,
BAC 克隆 150D24 含有二倍体 D 组着丝粒区的特有
卫星重复序列, 可以作为二倍体 D 组棉种着丝粒的
特异 FISH 标记, 用于构建基于粗线期染色体的分子
细胞遗传学图谱.
本研究中的 BAC 克隆 150D24 是由 SSR 标记
BNL3563 筛选到的, BNL3563 位于四倍体棉花遗传
连锁图中 10 号染色体长臂末端, 而且在二倍体 D 组
遗传连锁图中并没有此分子标记, 以此 BAC 克隆为
探针进行原位杂交时, 在四倍体棉种 D 亚组染色体
着丝粒区产生微弱的信号. 最初我们推断 BAC 克隆
150D24 来自四倍体棉种的 A 亚组的一对染色体, 其
中可能含有部分 D 亚组着丝粒的重复序列, 或是含
有 A 和 D 组共有的着丝粒重复序列, 因此能在 D 亚
组 染 色 体 着 丝 粒 区 产 生 信 号 . 因 此 , 最 初 预 计 以
BAC 克隆 150D24 为探针能在二倍体 A 组棉种着丝
粒至少产生一对信号. 然而后来的研究发现, BAC 克
隆 150D24 不能在 A 组二倍体染色体着丝粒处产生信
号, 而是在 D 亚组全部染色体着丝粒处产生了清晰
信号 , 这说明来源于四倍体 A 亚组的 BAC 克隆
150D24 含有二倍体 D 组着丝粒重复序列而不是 A 组
的着丝粒重复序列 . 我们推测可能有两种原因造成
了这种现象: 一是二倍体 D 组的着丝粒区重复序列
“入侵”或是“转移”到了遗传连锁图中 10 号染色体着
丝粒区, 并恰好处在分子标记 BNL3563 附近; 二是
遗传连锁图的 10 号染色体可能是二倍体 D 组来源的,
或者至少说部分属于 D 亚组而不是 A 亚组染色体,
而标记 BNL3563 是在漫长的进化过程中复制或转移
而来的, 四倍体棉种与二倍体 A, D 组棉种染色体的
线性对应关系可能比我们预期的更复杂.
近 20 年来, 着丝粒结构和功能、物理图谱着丝
粒区 Gap 填补等已成为当今分子细胞生物学与分子
细胞遗传学的热点之一 , 本研究仅就着丝粒探针进
行初步筛选 , 其功能和结构等还要需要更深入的研
究来确定, 并将推动棉花分子细胞生物学、分子细胞
遗传学及棉花基因组测序计划的发展.
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2105
论 文
Screen of FISH marker of chromosomes at Gossypium D genome species
WU Qiong1,2, CHENG Hua1,3, LIU Fang1, WANG ShengFeng4, SONG GuoLi1, LI ShaoHui1,
ZHANG XiangDi1, WANG YuHong1, MA ZhiYing4 & WANG KunBo1
1 Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Cotton Genetic Improvement of Ministry of Agriculture,
Anyang 455112, China;
2 Institute of Cash Crops, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Liaoyang 111000, China;
3 AnYang Institute of Technology, Anyang 455112, China;
4 Key Laboratory of Crop Germplasm Resources of Hebei, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China
Appropriate centromere probes for fluorescence in situ hybridization (FISH) of cotton were screened and high density cytoge-
netic maps based on pachytene-FISH in D genome cotton were developed. A BAC library of Gossypium barbadense var. pima
90-53 was screened using two-dimensional PCR with molecular markers close to the centromere region and 12 BAC clones
were identified by BAC-FISH. BAC clone 150D24 screened with SSR marker BNL3563, located at the end of long arm of
Chromosome 10 was identified. Signals for BAC clone 150D24 were located in centromere regions of some shorter chromo-
somes in tetraploid cotton G. hirsutum (AD)1 and G. barbadense (AD)2. FISH conducted on diploid cotton demonstrated that
there were clear signals in the centromere region of D genome diploid cotton species when BAC clone 150D24 was used as a
probe. No signals were evident in A, C or E genome diploid cotton. This suggests that 150D24 contains repeat sequences, which
are specific to D genome species centromere region; therefore, 150D24 can be used as a specific FISH marker for centromere
regions in D genome diploid cotton, including the D sub-genome.

cotton, FISH, centromere, BAC
doi: 10.1360/972010-157