全 文 ：沙棘属植物结瘤特性及 Frankia根瘤菌分离
张爱梅1 ,牛世全1 ,孙 坤1 ,曹文侠2 ,达文燕1
(1.西北师范大学 生命科学学院 ,甘肃 兰州 730070;2.甘肃农业大学 草业学院 ,
教育部草业生态系统重点实验室 ,甘肃 兰州 730070)
摘要:以 4种沙棘属植物为材料 ,调查其在不同生境 、不同季节的结瘤特点 ,研究弗兰克氏根瘤菌
(Frank ia)的特性。研究发现 ,同种沙棘在不同生境和同种生境不同季节 ,不同种的沙棘属植物在不同
生境 ,以及同一生境不同季节的根瘤大小 、形状 、着生部位 、颜色和结瘤率不同;植物分布海拔越高 ,瘤块
和瘤瓣越小;4种沙棘中藏沙棘根瘤瘤瓣最大。根瘤经切片法分离培养后 ,从不同生境不同季节生长的
4种沙棘属植物中共得到纯培养菌株 53株 ,不同宿主中的 Frankia根瘤菌种类不同 ,同一宿主中也存在
不同种类的 Frank ia根瘤菌 。
关键词:沙棘;根瘤;Frankia;分离
中图分类号:S 727.3;S 144.3 文献标识码:A 文章编号:1009-5500(2010)02-0043-04
沙棘属(Hippophae)为胡颓子科 、雌雄异株﹑生
态适应性很广的灌木或亚乔木落叶树种[ 1 , 2] 。沙棘根
系发达 ,沙棘根系能与弗兰克氏(F rankia)放线菌等共
生形成大量根瘤 ,具有较高的固氮能力 ,对改善土壤结
构 、提高林地生产力等具有极其重要意义[ 3 , 4] 。
Frank ia又称为根瘤内生菌 ,菌株资源丰富。根系结
瘤是沙棘旺盛生长的生物学基础 ,只有良好生长的植
株才具有较强的结瘤能力 ,两者之间相辅相成 。沙棘
根系的结瘤受诸多因素影响 ,如土壤中内生菌的数量 、
分布及瘤瓣的年龄 、环境因素 、沙棘不同种源植株
等[ 5] 。沙棘属植物在青海和甘肃两省分布广泛 ,不同
生境土壤类型复杂多样 ,为 F rank ia 的多样性研究提
供了丰富的资源[ 6] 。有关沙棘 F rankia根瘤菌形态特
征研究国内已有报道[ 7-10] ,但对于不同生境和同种生
境不同季节的同种沙棘 , 以及不同的沙棘属植物
Frank ia根瘤菌的结瘤特性和分离培养特性的系统研
究还很少有见报道 ,此项工作的展开将有助于丰富沙
收稿日期:2010-03-08;修改日期:2010-04-08
基金项目:国家自然科学基金项目(30960029)和西北师范
大学学生学术科研项目资助
作者简介:张爱梅(1973 -), 女 , 甘肃武威人 , 讲师 , 在读博
士。 E-mail:zhangaimei@nw nu.edu.cn
曹文侠为通讯作者。
棘 Frankia根瘤菌菌株资源库 ,为沙棘属植物根瘤的
系统研究提供理论基础 。
1 材料和方法
1.1 供试材料
2005年 10月 31 ～ 2007年 9月 22 日 ,选取 25个
采样点 ,依不同地理生态类型 ,在青海和甘肃采集宿主
沙棘属植物 4个种(亚种)Frankia根瘤菌(表 1)。
1.2 沙棘根瘤菌 Frankia的分离与培养
剪刀剪取新鲜的带有一段根的 Frank ia与沙棘形
成的根瘤 ,用自来水冲洗 3 ～ 5次 ,再用洗洁剂清洗 1
～ 2次 ,然后无菌水冲洗 3 ～ 5 次 ,并将根瘤(不能破
碎)放入 95%的酒精中浸泡 5 min ,再用 0.1% HgCl2
表面灭菌 5 ～ 8 min ,再用无菌水清洗 3 ～ 5次[ 9] 。
采用根瘤切片法 ,以无菌刀片将消毒后的根瘤切
成 1 mm 厚的薄片 ,将瘤片置于液体或固体培养基中 ,
置于 28 ℃恒温箱中培养 30 d ,淘汰污染有速生细菌和
霉菌的液体培养管和固体培养平板[ 10] 。待长出菌丝
体后 ,再转接到 Bap培养基中进行纯化培养 ,并检测其
纯度 。涂片法观察根瘤内生菌形态结构[ 10] 。
将分离纯化所得的 F rankia根瘤内生菌 ,分别在
S ,Bap , JA ,G 液体培养基中进行培养[ 10] ,在光学显微
镜下观察其形态特征 ,并记录在不同培养基中的培养
43第 30卷 第 2期 草 原 与 草 坪 2010年
特征 。
1.3 内生菌 Frankia菌株回接
将分离到的内生菌株进行柯赫法则检验。将采集
的中国沙棘 、西藏沙棘 、肋果沙棘 、棱果沙棘的种子经
0.1%的 HgCl2表面消毒后 ,于无菌的培养皿或灭菌的
珍珠岩中进行催芽 ,待长出子叶并且根长达到 2 cm 以
上时 ,部分转入灭菌的无氮 Sideris-young 营养液或无
氮的 Sideris-young 营养液琼脂管中(0.8%琼脂),部
分转入 MS 培养基中 ,部分仍置于珍珠岩中培养 ,待主
根长至 5 ～ 6 cm 时进行结瘤试验 。
表 1 4 种沙棘属植物根瘤来源与生境特征
Table 1 The source of root nodules of Hi ppophae and habitat
features
宿主 采样地点 海拔/m 生境与土壤 采样时间
中国沙棘 兰州石佛沟 2 500 山坡黄土 2005-10-25
Hi ppop hae 甘肃兴隆山 2 400 水沟河滩地 2006-03-11
rhamnoides 阳坡沙土地
2 250 河滩石头滩 2006-05-13
甘肃天祝 2 900 山坡黑土地 2006-06-10
青海大通 3 000 路边河滩地 2006-09-21
青海门源 3 050 山坡地黑土
青海祁连 2 900 城郊干黄土 2006-09-22
祁连拱拜湾 3 075 山坡石滩地 2006-09-23
青海八宝 2 840 河滩黑沙地 2006-09-24
青海祁连 2 768 极湿黄沙地 2006-09-24
兰州雁滩 1 520 路边极干黄土地2007-03-29
西藏沙棘 甘肃天祝 2 950 河滩沙石地 2005-10-31
Hi ppop hae 金强河 2006-05-10
thibetana 2006-06-10
2006-08-24
青海门源 3 200 山坡地黑土 2006-09-21
青海中大坂 3 590 路边沙土 2006-09-21
甘肃天祝 2 950 河滩沙石地 2007-09-22
金强河 2006-09-27
棱果沙棘 青海祁连 3 080 河滩干沙地 2006-09-23
Hi ppop hae 青海祁连 3040 黑土石滩地 2006-09-23
goniocarpa 青海八宝 2 840 路边沙石地 2006-09-24
肋果沙棘 青海俄博 3 050 河滩地 2006-09-22
Hi ppop hae 青海八宝 2 840 路边沙石地 2006-09-24
rhamnoide
2 结果与分析
2.1 沙棘根瘤形态与结瘤特点
试验中对不同地域采集的根瘤 ,详细进行根瘤瘤
块的大小﹑颜色﹑瘤瓣的大小与数量 ,结瘤位置等的
观察 ,发现以下基本特点 。
(1)沙棘的根瘤属于桤木型 ,珊瑚状 ,组成根瘤的
最基本单位是瘤瓣 ,瘤瓣大部分为近球形或球形 ,少数
为椭圆形至柱形。瘤瓣顶端分生组织被 Frankia菌新
侵染后 ,以二分叉分裂可形成下 1级 2个新的瘤瓣 ,以
此方法逐次 、逐年分裂 ,形成了珊瑚状[ 11] 瘤块 ,瘤块多
年生 。根瘤幼时较小 ,为圆形 ,表面平滑 ,成熟时根瘤
较大 ,表面粗糙 ,有的还发展为复合瘤。沙棘幼嫩的根
瘤呈淡黄或乳白色 ,成熟的根瘤着生部位呈土黄或淡
褐色 ,顶端乳白色 ,较老龄的根瘤颜色逐渐加深 ,呈咖
啡色至棕褐色 。根瘤可生长多年 ,由于分叉的增多 ,能
形成球状瘤簇 ,直径可达 4 ～ 5 cm ,有时可将根部环绕
一圈 。另外 ,不同种沙棘根瘤大小不同 ,较小的为肋果
沙棘 ,直径近 0.7 cm ,且相比之下 ,藏沙棘根瘤瘤瓣最
大 ,根瘤着生较大的种为藏沙棘 ,直径达 4 ～ 5 cm 。
(2)从着生部位看 ,中国沙棘主根很少生根瘤 ,藏
沙棘主侧根均可着生根瘤 ,但主根上着生的根瘤个体
较大 ,因此 , 沙棘主根一般不结瘤 。1 级侧根结瘤最
多 ,2 ～ 3级侧根次之;而且第 1级侧根形成的根瘤多 ,
瘤体大 ,固氮能力强 ,距地表较浅 ,分布在 10 ～ 80 cm
的土层 ,瘤块最大可达到 2 cm 以上 ,每个瘤块的瘤瓣
数量有 10 ～ 100个瘤瓣。2 ～ 3 级侧根虽然也有不少
的瘤块 ,但体积小 ,数量不多 。在调查中进一步发现 ,
沙棘有效根瘤为褐色或肉色 ,无效根瘤为黑色或白色 ,
而小根瘤为乳白色 ,为尚未发育完全成熟根瘤 ,亦为有
效根瘤。
(3)生长在不同生境的沙棘属植物 ,根瘤形状 、颜
色和结瘤率也有不同。同种沙棘 ,采样地海拔越高 ,瘤
块和瘤瓣越小;从沙棘生长的土壤环境来分析 ,土壤含
水率越底 ,根瘤颜色越深 ,且瘤瓣较小;土壤含水率越
高 ,结瘤量越大;从采集沙棘根瘤的时间来看 , 9月所
采样的根瘤颜色普遍较浅 ,大多数为乳白色 ,其余时间
所采瘤样 ,根瘤颜色较深 ,部分为黑色 ,说明 9 月份为
根瘤生长的关键时期。
2.2 沙棘根瘤菌的分布特点
所采集的根瘤经切片法进行分离 ,祁连拱拜湾所
采的棱果沙棘 ,中国沙棘 、以及兰州雁滩采集的中国沙
棘没有分离到所需菌株 ,其余地区初步分离共得到纯
培养菌株 53株 。纯培养菌株都从 Bap培养基中获得 ,
研究发现 ,不同宿主中存在不同种类的 Frankia 菌 ,同
一宿主中也存在不同种类的 Frankia 菌。另外 ,从不
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同生境的中国沙棘共分离出不同种类的 Frankia 菌
29株;从不同生境的西藏沙棘共分离出不同种类的
Frank ia菌 12株;从不同生境的棱果沙棘共分离出不
同种类的 Frankia菌 5株;从不同生境的肋果沙棘共
分离出不同种类的 Frankia菌 7株。
国内外已从沙棘不同宿主 ,或同一宿主根瘤 ,分离
到 100株以上纯培养菌株 ,中国最多 。本实验中分离
到的 53株纯培养菌株 ,由于 Frankia的分类鉴定较为
复杂 ,研究停留在所收集到有限菌株材料上的归类 ,是
否跟已报道的菌株不同 ,还需 ARDRA 分析 。
2.3 沙棘根瘤菌的形态及培养特征
将从不同种沙棘根瘤中分离所得的 53 株纯培养
菌株在 Bap液体培养基中培养 4 ～ 6周后镜鉴 ,发现大
部分菌株具有细长分支菌丝;在 JA 液体培养基中培
养后 ,也发现大部分菌株具有极度弯曲且细长的分支
菌丝;并且不同菌株其菌丝有不同程度的粗细差别 。
部分菌株在不同培养基上的培养特征见表 2。研究表
明 Frank ia属于慢生长型 ,采用液体培养比固体培养
生长速度快 ,而液体培养随着时间和培养基的不同 ,
Frank ia的形态和结构发生相应的变化。
Frank ia纯培养菌株在 Bap和 JA 液体培养基中
大部分呈絮状生长 ,少数呈颗粒状 ,菌丝体沉淀在底
部 ,少数附在容器壁上 ,紧密或疏松;颜色大部分为微
黄色﹑白色﹑部分带有褐色 ,培养液清亮 ,与资料对
Frank ia菌的形态特征描述一致[ 11] 。在平板上培养 1
个月以上才可以长出菌落 ,在 Bap固体培养基上生长
时菌落较小 ,气丝少而不发达 ,基丝发达且伸入培养基
内部 ,颜色大部分也为微黄色﹑白色﹑部分带褐色 。
Frank ia 属于慢生长型 ,但采用液体培养比固体培养
生长速度快 ,而液体培养随着时间和培养基的不同 ,
Frank ia的形态和结构发生相应的变化 ,在 Bap液体
培养基中用 60 r/min的摇床能缩短培养时间。
弗兰克氏菌生长缓慢 ,离体培养需要 2 ～ 3周或更
长时间 ,探讨更好的培养条件及培养方法 ,缩短生长周
期 ,减少离体培养中的污染非常必要 。对于不同生境
的沙棘属植物根瘤 F rank ia进行系统研究 ,获得一批
新的弗兰克氏菌的菌株资源 、研究不同条件下分离所
得弗兰克氏菌的特性将是今后研究的另一个方向 。而
选育生长快 、固氮活性高 、侵染力强的优良菌株 ,并积
极研制人工高效菌肥 ,是解决应用问题的关键。
表 2 部分菌株的培养特征
Table 2 The morphological features of some Frankia strains in different culture medium
菌株 培养基 菌落表面 菌落大小 菌落颜色 菌株 培养基 菌落表面 菌落大小 菌落颜色
F8-3 B 厚 , 干燥 深灰 F9-1 B 突起 , 光滑 ,致密 小 灰黑
S 突起 , 光滑 ,致密 小 灰白 S 扁平 , 干燥 小 浅灰
T 扁平 , 光滑 ,致密 小 浅灰 T 扁平 , 干燥 大 浅灰
Q 突起 , 光滑 ,致密 小 灰白咖色 Q 小 灰白
G 致密 极小 灰白 G 突起 , 光滑 ,致密 小 ,点状 灰白咖色
JA 光滑 , 致密 ,透明 小 灰白 JA 小 土黄
T+10S 薄 , 透明 小 灰白 DSM 突起 , 致密 小 浅红灰
P 无生长 C 、PT 光滑 , 突起粘稠
F10-3 S 突起 , 光滑 ,致密 小 栗红 B 较薄 , 透明 小 无色
T D 突起 小 土灰色
Q P 无生长
注:菌株 F8-3 为中国沙棘 , 采自大通河滩;F9-1 为棱果沙棘 ,采自八宝河滩;F10-3 为肋果沙棘 , 采自八宝河滩
2.4 菌株回接
为了便于菌株回接实验 ,对沙棘属植物的种子进
行了发芽试验 ,试验表明 ,西藏沙棘出芽率最高 、棱果
沙棘次之 、中国沙棘较差 、肋果沙棘最容易被污染而影
响出芽率 ,但由于西藏沙棘出芽需时最长 ,所以菌株回
接时选择中国沙棘种子作为合适的宿主 ,待芽主根长
至 5 ～ 6 cm 时进行结瘤试验 。
选取其中 12株纯培养菌株进行结瘤试验 ,以确定
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所分离的内生菌为 Frankia菌。但由于沙棘幼苗管理
不当 ,只有接种于中国沙棘培养液中的 F8-4号菌株 , 1
个月以后发现侧根上有极小的瘤状突起 ,此时中国沙
棘的植株高为 7.8 cm ,主根长 5.6 cm ,侧根很发达 ,共
5条 1级侧根 ,12条 2级侧根 ,且只在 1级侧根上有瘤
状突起。在今后试验中还需进一步摸索合适的接瘤条
件 ,将分离到的 F rankia内生菌株进行柯赫法则检验 ,
提高沙棘接瘤率 。
3 结论
不同生境 、不同季节和不同种类的沙棘属植物其
根瘤的大小 、形状 、颜色和结瘤率等均不同 。沙棘属植
物根瘤幼时较小 ,为圆形 ,表面平滑 ,成熟时根瘤较大 ,
表面粗糙 。沙棘属植物分布海拔越高 ,瘤块和瘤瓣越
小。从沙棘生长的土壤环境看 ,沙棘根部土壤含沙石
越少﹑含水率越低 ,根瘤颜色越深 ,并且瘤瓣也较小;
土壤含水率越高 ,结瘤量越大 。从着生部位看 ,中国沙
棘﹑棱果沙棘和肋果沙棘主根很少生根瘤 ,西藏沙棘
主侧根均可着生根瘤 ,但主根上着生的根瘤个体较大。
从采集沙棘根瘤时间来看 ,9月所采集的根瘤颜色普遍
较浅 ,多数为乳白色 。根瘤经切片法分离培养后 ,从不
同生境不同季节生长的不同种沙棘中共得到纯培养菌
株 53株 ,不同宿主中存在不同种类的 Frankia菌 ,同
一宿主中也存在不同种类的 Frankia菌 。
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Study on the root nodules features of
Hippophae and Frankia isolation
ZHANG Ai-mei1 ,NIU Shi-quan1 ,SUN Ku1 ,CAO Wen-xia2 , DA Wen-yan1
(1.Collegeo f L i f e Science , Northwest Normal University , Lanz hou 730070 , China;2.College of
Pratacul tural Science ,Gansu Agricul tural Univ ersity ;K ey Laboratory of Grassland Ecosy stem
Educat ion Ministry ,Lanzhou 730070 ,China)
Abstract:The features of roo t nodules of 4 Hip pophae species f rom Gansu and Qinghai we re invest igated ,
and Frankia were iso lated f rom nodulation.T he roo t nodules show ed different size , shapes , locality , co lors , and
nodulation ratio in di fferent seasons , environments and species.The nodules w ere less wi th alti tude increasing
and the nodule size of H .thibetana was bigger among 4 Hippophae species.A fter the ro ot nodules w ere cul-
tured by slicing method , 53 Frankia st rains w ere obtained and the species w ere dif ferent in same or dif ferent
Hip pophae species.
Key words:Hippophae;roo t nodule;Frank ia;isolat ion
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