全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J． of Agr． Sci．) ，2011，27(6) :1423 ～ 1425
宣继萍，郭忠仁，徐 菲，等． 正交设计优化秋海棠属植物 SRAP-PCR 反应体系及引物筛选［J］．江苏农业学报，2011，27(6) :
1423-1425．
正交设计优化秋海棠属植物 SRAP-PCR 反应体系及
引物筛选
宣继萍， 郭忠仁， 徐 菲， 郑玉红
(江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014)
收稿日期:2011-07-11
基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目［CX(09)608］
作者简介:宣继萍(1976-) ，女，浙江东阳人，博士，副研究员，主要从
事园艺植物种质资源多样性研究及利用。(Tel)025-
84347021;(E-mail)xuanjiping0077@ yahoo． com． cn
通讯作者:郭忠仁，(Tel)025-84347003; (E-mail)zhongrenguo @
yahoo． com． cn
关键词: 秋海棠属;SRAP标记;正交试验设计;体系优化;引物筛选
中图分类号: S661． 403． 6 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2011)06-1423-03
Optimization of SRAP-PCR system for Begonia by orthogonal design and
selection of primers
XUAN Ji-ping， GUO Zhong-ren， XU Fei， ZHENG Yu-hong
(Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Jiangsu Province，Nanjing 210014，China)
Key words: Begonia．;SRAP marker;orthogonal design;optimization of system;selection of primers
相关序列扩增多态性 (Sequence-related amplified poly-
mophism，SRAP)是 2001 年由 Li 和 Quiros 开发的一种基于
PCR的新型分子标记技术［1］。与 RAPD、AFLP、SSR 等标记
方法相比，SRAP具有简单、高效、高共显性、重复性好、易测
序等优点，已经用于许多植物的种子纯度检测、杂种鉴定、遗
传多样性分析、指纹图谱及遗传连锁图的构建等［2-8］。
秋海棠属(Begonia oblique Linn．)属秋海棠科(Begoni-
aceae) ，有1 500多种［9］，是世界被子植物十大属之一，主要
分布在美洲、非洲和亚洲的热带和亚热带地区。秋海棠属植
物的外部形态表现了丰富的多样性，如叶片颜色、形状、图
案、质地以及花的颜色等。关于秋海棠属植物多样性的研究
主要集中于外部形态［10-12］和细胞学［13-14］。有关秋海棠属植
物分子研究也有少量报道，如 Plana 等［15］应用 ITS序列分析
非洲秋海棠属的历史生物地理分布;Hughes 等［16-18］开发了
24 对 Begonia socotrana 的 SSR 引物，并应用这 24 对 SSR 引
物对 Begonia socotrana的种内居群结构进行了分析。但至今
尚未见 SRAP标记应用于秋海棠属植物的报道。本研究拟
将 SRAP标记应用于秋海棠属植物，以期得到秋海棠属植物
的 SRAP-PCR最优反应体系。此外，对部分 SRAP 引物组合
进行多态性筛选，试图获得一些多态性丰富的 SRAP 引物组
合，为今后的秋海棠属植物分子生物学研究提供技术支撑。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
参试的 3 个秋海棠材料［无翅秋海棠(B． acetosella)、昌
感秋海棠(B． cavaleriei)、卷毛秋海棠(B． cirrosa) ］均采自江
苏省中国科学院植物研究所经济植物研究中心苗圃。Taq
酶、Mg2+和 dNTP 购自上海生物工程公司。SRAP 优化体系
的 DNA取自无翅秋海棠。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 基因组 DNA的提取及检测 以秋海棠属植物的嫩
叶为材料，采用 CTAB 法提取基因组 DNA，并用 0． 8% 琼脂
糖凝胶电泳检测 DNA的质量和浓度。最后将样品浓度稀释
至 20 ng /μl。
1． 2． 2 PCR反应体系的正交试验设计 采用 L9(3
4)正交
试验设计，对 Mg2+、dNTP、引物和模板 DNA进行 4 因素 3 水
平筛选，方案见表 1、表 2。SRAP 引物序列采用 Li 和 Qui-
3241
ros［1］、Lin等［19］发表的引物序列。
表 1 SRAP-PCR体系的因素和水平
Table 1 The factors and levels of SRAP-PCR system
水平
因素
dNTP
(mmol /L)
DNA
(ng)
引物
(μmol /L)
Mg2+
(mmol /L)
1 0． 125 0 30 0． 15 0． 750
2 0． 162 5 40 0． 20 1． 125
3 0． 250 0 50 0． 25 1． 500
表 2 SRAP-PCR正交设计
Table 2 The orthogonal design of SRAP-PCR
编号
因素
dNTP
(mmol /L)
DNA
(ng)
引物
(μmol /L)
Mg2+
(mmol /L)
1 0． 125 0 30 0． 15 0． 750
2 0． 125 0 40 0． 20 1． 125
3 0． 125 0 50 0． 25 1． 500
4 0． 162 5 30 0． 20 1． 500
5 0． 162 5 40 0． 25 0． 750
6 0． 162 5 50 0． 15 1． 125
7 0． 250 0 30 0． 25 1． 125
8 0． 250 0 40 0． 15 1． 500
9 0． 250 0 50 0． 20 0． 750
1． 2． 3 PCR反应条件 根据表 1 和表 2 制备总体积为 20
μl的 PCR反应体系，除表中变化的因素外，每管中还加入 2
μl 10×PCR buffer和 1. 0 U 的 Taq DNA 聚合酶，所用引物组
合为 Me4 /Em1。PCR扩增程序为:94 ℃预变性 3 min;94 ℃
变性 30 s，35 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，5 个循环;94 ℃
变性 30 s，50 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环;72 ℃
延伸 5 min，4 ℃保存。扩增反应在 Eppendorf AG PCR 仪上
进行，产物用 8% 聚丙烯酰胺凝胶分离，银染检测。
1． 2． 4 SRAP 引物组合多态性筛选 根据上述试验结果确
定的 SRAP-PCR最佳反应体系，随机选取 5 条正向引物和 5
条反向引物，组合成 16 对引物组合(Me1+ Em1、Me2+ Em2、
Me4+ Em3、Me5+ Em1、Me6+ Em1、Me1+ Em2、Me2+ Em3、
Me4+ Em6、Me5+ Em7、Me6+ Em6、Me1+ Em3、Me2+ Em6、
Me4+ Em7、Me1+ Em6、Me2+ Em7、Me1+ Em7) ，对 3 个秋海
棠属植物材料进行多态性 SRAP引物组合的筛选。
2 结 果
2． 1 SRAP-PCR正交试验结果分析
参照何正文等［20］的方法，对扩增结果进行直观分析，依
据谱带的强弱及杂带的多少，将 9 个处理结果划分为 9 个评
分等级以便统计分析，3、4、5 号得分最高，其次是 8、9 号两
个组合，再次是 2 号组合，6、7 号两个组合得到的条带最多，
但是有杂带，得分不高，不宜采用，而 8、9 号两个组合条带与
2 号组合相似，这些组合因有杂带，不宜采用;得分最高的 3、
4、5 号组合带型清晰，亮度高，且杂带少，扩增效果最好;但
比较分析这 3 个组合与 2 号组合不同组分浓度差异，组合 20
μl反应体系中 dNTP 的用量为 0. 125 0 mmol /L，DNA 为 40
ng，上下游引物各为 0. 20 μmol /L，Mg2+为 1. 125 mmol /L，而
组合 3、4、5 号中，dNTP 的用量分别为 0. 125 0 mmol /L、
0. 162 5 mmol /L、0. 162 5 mmol /L，DNA依次为 50 ng、30 ng、
40 ng，上下游引物依次为 0. 250 μmol /L、0. 200 μmol /L、
0. 200 μmol /L，Mg2+依次为 1. 500 mmol /L、1. 500 mmol /L、
0. 750 mmol /L。综合考虑试验效果和成本，最终选择 2 号组
合为秋海棠基因组 SRAP-PCR的最佳反应体系，即 20 μl 的
PCR体系中含有模板 DNA 40 ng、2 μl 10×PCR buffer(不含
Mg2+)、Mg2+ 1. 125 mmol /L、dNTPs 0. 125 mmol /L、上下游引
物各 0. 200 μmol /L、Taq DNA聚合酶 1. 0 U。
2． 2 秋海棠 SRAP-PCR 反应体系的验证及多态性引物组
合的筛选
应用建立的最优 SRAP-PCR 反应体系，随机组合了 16
对 SRAP引物组合，应用 3 个秋海棠属植物 DNA进行 SRAP
扩增，结果显示:①在筛选的 16 对引物组合中，有 13 个引物
组合扩增得到清晰稳定的条带，表明该反应体系具有较好的
稳定性;在有扩增产物的 13 个引物组合中有 12 个引物组合
扩增出多态性条带，占总数的 75%。②12 个具有多态性引
物组合扩增出的条带总数为 90. 0 条，平均每对引物组合扩
增出 7. 5 个条带;具多态性的条带有 51. 0 条，占总数的
56. 7%，平均每对引物组合扩增出的多态性条带为 4. 3 条。
3 讨 论
根据 PCR 的 SRAP 分子标记技术，可以将 RAPD 和
AFLP两者的优点有机地结合在一起，具有简便、稳定、中等
产率的优点，高频率共显性也明显优于 AFLP，且比 AFLP、
RAPD、SSR等其他方法更能反映表型的多样性及进化历
史［21-22］。SRAP 反应体系中，Mg2+、dNTPs 及引物浓度对
SRAP分子标记的影响较明显［23-25］。Mg2 +和 dNTPs 浓度不
仅影响 Taq 酶的活性，还在反应液中相互制约，且与模板
DNA及引物结合，影响引物与模板的结合效率、产物的特异
性及引物二聚体的形成［26］。引物浓度会对 PCR 的带型产
生明显的影响。浓度过低不能扩增，浓度太高会产生新的位
点，且形成引物二聚体的机率增大［27］。为了减少非特异性
扩增，加强重复性，本研究在确保产量的前提下，采用了较低
的引物浓度。
扩增程序对 PCR扩增效果的影响也较大，但由于 SRAP
引物使用的是通用型随机引物，有部分引物组合在不同种属
4241 江 苏 农 业 学 报 2011 年 第 27 卷 第 6 期
植物间可以通用，因此，扩增程序对 SRAP-PCR 扩增结果的
影响相对较小。在秋海棠属植物 SRAP-PCR反应体系中，前
5 个循环采用 35 ℃ 的退火温度，后 30 个循环采用 50 ℃的
退火温度，获得了较理想的扩增结果。在 PCR 扩增过程中，
大多数研究者设置 25 ～ 45 个循环［28-29］。本试验采用 30 个
循环，获得的扩增条带清晰、多态性丰富、结果重复性较强，
能满足 PCR扩增的要求。
综上所述，SRAP标记用于秋海棠属种质遗传多样性研
究是切实可行的，该试验体系可进一步推广应用到秋海棠属
种质的 SRAP标记研究中。利用正交试验设计对秋海棠属
植物的 SRAP-PCR反应体系进行优化，得到的最佳反应体系
(20 μl)为:模板 DNA 40 ng、2 μl 10× PCR buffer(不含
Mg2+)、Mg2+ 1. 125 mmol /L、dNTPs 0. 125 mmol /L、上下游引
物各 0. 200 μmol /L、Taq DNA聚合酶 1. 0 U。
参考文献:
［1］ LI G，QUIROS C F． Sequence related amplified polymorphism
(SRAP)． a new marker system based on a simple PCR reaction:
its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］． Theo-
retical Applied Genetics，2001，103:455-461．
［2］ 姜树坤，马 慧，刘 君，等．利用 SRAP 标记分析玉米遗传多
样性［J］．分子植物育种，2007，5(3) :412-416．
［3］ RIAZ A，LI G，QURESH Z，el al． Genetic diversity of oilseed
Brassica napus inbred lines based on sequence-related amplified-
polymorphism and its relation to hybrid performance［J］． Plant
Breeding，200l，120:411-415．
［4］ BUDAK H，SHEARMAN R C，PARMAKSIZ I，el al． Molecular
characterization of buffalograss germplasm using sequence-related
amplified polymorphism markers ［J］． Theoretical and Applied
Genetics，2004，108:328-334．
［5］ 张建成，王传唐，焦 坤，等． SRAP 标记技术在花生种子纯度
鉴定中的应用［J］．中国农学通报，2005，21(12) :35-39．
［6］ 郑轶琦，宗俊勤，薛丹丹，等． SRAP 分子标记在假俭草杂交后
代真实性鉴定中的应用［J］． 草地学报，2009，17 (2) :
135-140．
［7］ 文雁成，王汉中，沈金雄，等． SRAP 和 SSR 标记构建的甘蓝型
油菜品种指纹图谱比较［J］． 中国油料作物学报，2006，28
(3) :233-239．
［8］ 王 刚，潘俊松，李效尊，等．黄瓜 SRAP 遗传连锁图的构建及
侧枝基因定位［J］．中国科学(C辑) ，2004，34(6) :510-516．
［9］ WAGNER W W． The french begonia society［J］． The Begonian，
1999，66:172-175．
［10］ 李景秀，管开云，大宫微，等． 云南秋海棠属植物叶片横切面比
较解剖研究［J］． 广西植物，2007，27(4) :543-550．
［11］ TRAC Y，MCLELLAN FLS． Geographic variation and plasticity of
leaf shape and size in Begonia dregei and B． homonyma (Begoni-
aceae) ［J］． Botanical Journal of the Linnean Society，2000，
132:79-95．
［12］ TANG M ，HU Y X，LIN J X，et al． Developmental mechanism
and distribution pattern of stomatal clusters in begonia peltatifolia
［J］． Acta Botanica Sinica，2002 ，44(4) :384-390．
［13］ 宋立波，杨德奎． 秋海棠属植物花粉形态的扫描电镜研究
［J］．山东科学，2009，22(2) :19-21．
［14］ 田代科，管开云，周其兴，等．云南八种秋海棠属植物的染色体
数目［J］． 云南植物研究，2002，24 (2) :245-249．
［15］ PLANA V，GASCOIGNE A，FORREST L L，et al． Pleistocene
and pre-pleistocene Begonia speciation in Africa［J］． Molecular
Phylogenetics and Evolution，2004，31:449-461．
［16］ HUGHES M，HOLLINGSWORTH P M，SQUIRRELL J． Isolation
of polymorphic microsatellite markers for Begonia sutherlandii
Hook［J］． Molecular Ecology Notes，2002，2:185-186．
［17］ HUGHES M，RUSSELL J，HOLLINGSWORTH P M． Polymorphic
microsatellite markers for the Socotran endemic herb Begonia soco-
trana［J］． Molecular Ecology Notes，2002，2:159-160．
［18］ HUGHES M， HOLLINGSWORTH P M， MILLER A G．
Population genetic structure in the endemic Begonia of the Socotra
archipelago［J］． Biological Conservation，2003，113:277-284．
［19］ LIN Z，HE D，ZHANG X． Linkage map construction and mapping
QTL for cotton fibre quality using SRAP，SSR and RAPD［J］．
Plant Breeding，2005，124:180-187．
［20］ 何正文，刘运生，陈立华，等． 正交设计直观分析法优化 PCR
条件［J］． 湖南医科大学学报，1998，23(4) :403-404．
［21］ 林忠旭，张献龙，聂以春，等． 棉花 SRAP 遗传连锁图构建
［J］． 科学通报，2003，48(5) :1676-1679．
［22］ 邹喻苹，葛 颂，王哓东． 系统与进化植物学中的分子标记
［M］． 北京:科学出版社，2001:36-41．
［23］ 张安世，邢智峰，刘永英，等． SRAP分子标记及其应用［J］． 安
徽农业科学，2007，35(9) :2562-2563．
［24］ 萨姆布鲁克，弗里奇． 分子克隆实验技术指南［M］． 2 版．金冬
雁，黎孟枫，译．北京:科学出版社，2002:325-342．
［25］ 王 燕，龚义勤，赵统敏，等． 番茄 SRAP-PCR体系优化与品种
分子鉴定［J］． 南京农业大学学报，2007，30(1) :23-29．
［26］ 郭大龙，罗正荣． 部分柿属植物 SRAP-PCR 反应体系的优化
［J］． 果树学报，2006，23(1) :138-141．
［27］ 吴 鑫，雷天刚，何永睿，等． 柑桔 SRAP 和 ISSR 分子标记技
术体系的建立与优化［J］． 分子植物育种，2008，6(1) :
170-176．
［28］ 王 瑜，袁庆华． 紫花苜蓿 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化
［J］． 草地学报，2007，15(3) :212 -215．
［29］ 王 康，董宽虎，孙 彦，等． 马蔺 ISSR-PCR 反应体系的建立
与优化［J］． 草地学报，2008，16(6) :580-584．
5241宣继萍等:正交设计优化秋海棠属植物 SRAP-PCR反应体系及引物筛选