全 文 ：第 3 卷
V
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.
3
农 业 生 物 技 术 学 报
JO U R NL AO FG R AIC U L TU R AB LO EI C H TNO I
J
O G Y
9 9 5 1年 4月
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.
19 9 5
柑桔属与九里香属的原生质体融合及植株再生
甘 霖` 邓秀新 2 肖顺元 2 章文才 ,
l( 湖南农业大学园艺植物研究所 , 长沙 41 0 1 2 8 ; 2 华中农业大学柑桔研究所 , 武汉 4 3 0 0 7 0)
摘要 : 采用 P E G (聚 乙二醇 )诱导原生质体融合 , 进行 了 P ag e 桔抽 ( c i t ur , er lt : ul 口勿
召 la n c 。 又 e . g r 口 , J i , O s b . C v . P a g e )九里香 (材 u r r卿 a 户a n i c u z a re J a e k . )的体细胞杂交 , 培
养获得 了 40 株再生植株 , 经细胞学检查和同工酶分析鉴定 , 确认有 2 株为aP g e 桔袖九里香的
体细胞杂种植株 , 它们均为四倍体 ( 2n 一 4x 一 36 ) , 具有双亲综合的谷草转氨酶 (G O T )和过氧
化物酶 (P O X )同工酶带型 。 体细胞杂种的获得将有可能将九里香对黄龙病 ( B L O )的抗性转移
到 栽培品种 P a g e 桔袖中 。
关键词 : 柑桔属 ; 九里香属 ; 原生质体融合 ; 体细胞杂种
黄龙病 ( B L O ) 为流行于我国高温柑桔产区的一种毁灭性病害 , 受黄龙病为害的柑桔树
只有 10 ~ 12 年的寿命 , 目前尚无一种有效 的防治方法 。 柑桔近缘属九里香属对黄龙病具有
高抗性 , 但由于与柑桔属杂交不亲和而无法利用 。 原生质体融合技术 由于克服了远缘杂交
的不亲和性 , 对于实现种 、 属间的基因重组 、 转移有利性状有着特别重要的意义 。
自 ( ) h g a w a r a 等 ( 1 9 5 5 )首次采用积和 T r o v i t a 甜橙作亲本 , 用 P E G (聚乙 二 醇 )诱导融
和 , 成功地获得了稳定的属间体细胞杂种后川 , 经过数年的努力 ,这一技术已取得了很大 的
成攻 , 迄今为止 , 共获得了 29 个种间和 20 个属 间的柑桔体细胞杂种工 。 积与哈姆林甜橙的
体细胞杂种表现早产 、 抗速衰病 、 抗脚腐病和抗寒弘 3二 ,伏令夏橙与宜昌橙的体细胞杂种表现
抗寒 , 伏令夏橙与宁波金柑的体细胞杂种表现耐盐碱叉 , 通过体细胞杂交可以获得具有多
抗性的优化组合的新类型 。 本研究以生产上推广的良种 P a ge 桔袖 (cl t ur 、 er t icu l o at BI 。 。 co
只 c . g ar n dl : O s b . 。 v . P a g e ) 作为胚性亲本 的原生质体供体材料 , 以抗黄龙病 、 耐盐碱的九
里香 (M “ 犷 r 口少a P。 in cu la et J a c k . )作为叶肉原生质体供体材料 , 试图通过原生质体融合和
培养 , 将九里香对黄龙病的高抗性转移到柑桔栽培品种中 , 创造出新的柑桔类型 。
1 材料与方法
叶肉亲本无菌苗叶片为成熟种子经消毒后剥去种皮 、 在试管 内萌发 2 ~ 3 周的展开叶 。
胚性亲本悬浮系为 E M E川 + 谷氨酸胺 50 0 m g / L 培养基悬浮培养获得 。 酶法分离原生质体
参照 G r os s e r 等 ( 1 9 9 0) 的方法 仁们进行 。 分离的原生质体以 45 拌m 孔径不锈钢网筛过滤 , 再经
漂洗和甘露醇一蔗糖界面梯度离心纯化后用于融合处理 。
原生质体融合参照 G or s s e : 等 ( 1 9 9 0) 的方法川进行 , 异核体同时具有叶绿体和淀粉粒 ,
在显微镜下明显可辩 。 融合处理后的原生质体采用液体浅层培养 、 L M T (低熔点 )琼脂糖包
埋 (含琼 脂粉 0 . 6% )和 L M T 软包埋 ( 含琼脂 粉 0 . 3% )培养于略 经修改的 B H 3工培 养基 中 ,
收稿 日期 : 1 99 4一 0 9一 0 5
农 业 生 物 技 术 学 报 ] 9 9 5年
7 2C 下培养 , 前一 周保持黑 暗 , 以后转为弱光 , 3一 4 周后补充少量渗透压降低 了的液体培
养基 , 待细胞团长至 20 ~ 30 个细胞大小时 , 连同液体培养基一起转入 E M E 固体培养基作
双层培养 , 在光照条件下促使胚状体发生 。
将双层培 养形成的绿色胚状体转入 M T 川十 麦芽提取物 1 50 o m g · L 一 1固体培养基 ,
培养 2一 3 周后将胚状体转入 M T 十 G A 。 2 m g · I一 `固体培养基促进萌发 ,不能萌发的胚状
体转入 M T 十 K T 0 . 5 m g · L 一 1十 B A 0 . 5 m g · L 一 ’ + N A A 0 . 1 m g · I一 ’固体培养基诱导
丛芽形成 , 产生的芽切下于 1/’ 2M T 十 BI A 0 . 1 m g · I 一 ` + 活性炭 。 . 5 9 · I一 `固体培养基
上诱导生根 , 形成的完整植株转入 iG f( 网状完全培养基 ) 中继续培养一个月后 , 再生植株连
同 G Lf 一起移栽到大 田 。
细胞学观察参照朱 徽等 ( 1 9 8 2) 的方法 二6二进行 。
同工酶分析参照 肖顺元的方法川分析再生植株的 G O T (谷草转氨酶 )和 (P ) X (过氧化物
酶 )的同工酶酶谱 。
2 结果与分析
2
.
1 柑桔原生质体融合 、 培养和再生
等量混合后的双亲原生质体 ( 5 又 1护 ~ 1 又 1 0 6 个 · L 一 ’ )在加入浓度为 40 %的 P E G 后 ,
立即相互靠近 、 粘连 , 8 ~ 10 m in 即形成球形的杂种原生质体 , 融和频率 为 7% 。 培养 5一 12
天 后 , 观察到 细胞的第一 、 第二次分裂 (图版 2 ) ; 培养成 20 一 40 天后形成肉眼可见的细胞
团 , 这时需补 充适量渗透 压降低了的新鲜培养基 , 双层培养 30 一 50 天后形成绿色胚状体
( 图版 3 ) , 胚状体在M T 十 麦芽提取物 1 50 O m g · L 一 1固体培养基上进一步增大后 , 转入M T
+ G A
。 2 m g
·
l
沙 一 `固体培养基以促进胚状体的萌发 , 不能萌发的胚状体转入生芽培养基诱
导分化丛芽 , 切下丛芽于生根培养基上诱导生根 , 生根率几乎达 10 % . 完整植株在 iG f 中
继续培养 一个月后移栽到大田 。
2
.
2 再生植株的生根
胚状体在附加 G A 3 的培养基中一般只发生增大 , 直接萌发成完整植株的 比率很低 。 柑
桔原生质体再生一般先通过生芽培养基诱导丛芽产生 , 同时播种砧木 , 砧木避光生长到一
定高度时 ( 通常 15 天左右 ) , 取丛芽进行单芽嫁接 ( 长度约。 . S C二、 ) , 这种方法不仅费时费
工 , 丛芽和砧 木的生长量难以掌握 . 而且嫁接成活率不高 。 本试验 采用 BI A ( 0 . 1 m g ·
L
一 ’
) 代替过去生根培养基 中的 N A A , 当丛芽木质化以前即切下置于生根培 养基中 , 并降
低光照强度 , 获得了很好的效果 , 扦插 后 7一 10 天切 口 即变白 , 并很快萌发新根 , 生根率几
乎达 1 0 % 。 这一方法不仅极大地提高了再生植株的生根率 , 有效地解决了生根难的问题 ,
而且缩短了柑桔原生质体培养再生成完整植株的时间 。
2
.
3 再生植株 的细胞学检查和 同工酶分析
对获得的 4 0 株再生植株进行 了细胞学检查 , 有 4 株为四倍体 ( 2n 一 4x 一 3 6 , 图版 4 ) , 1
株染色体数为 19 和 1 株染色体数为 21 的非整倍体 , 其余 34 株为二倍体 ( 2n 一 2x 一 1 8 , 图版
5 )
。 非整倍体植株的产生主要是由于融合培养过程造成的 , 非整倍体虽然是抗性育种的好材
料 , 但难以正常生长发育 , 这 2 株最终都未能移栽成活 。
对 4 株四倍体植株进行了G O T 和 (P ) X 同工酶分析 , aP ge 桔袖在 G O T 一 1 区有 1 条酶带
R f 0
.
2 5
, 在G O T 一 2 区有 2 条酶带 R f 0 . 6 0 、 R f 0 . 6 5 , 九里香在 G ( ) T 一 l 区有 l 条酶带 R f 0 . 3 0 ,
第 2 期 甘 霖等 : 柑桔属 与九里香属的原生质体融合及植株再生
20346 57
00宁曰口 J啥反ō btl
在 GO T 一2 区有 1条酶带 R f 0 . 6 5, 在
G O T
一
1 区与 G O T 一 2 区之间有 1 条特
征酶带 R f 0 . 4 5 。 其中有三株再生植株
具 有双 亲综 合的 (弧 ) T 酶 带 , 即 在
G O T
一
l 区 有 2 条 酶 带 R f 0 . 2 5 、 R f
0
.
3 0
, 在 G O T 一 2 区有 2 条带 R f 0 . 6 0 、
R f 0
.
6 5
, 在 G O T 一 1 区与 G ( ) T 一 2 区之
间有 1 条特征酶带 R f 0 . 4 5 (图 1 、 图版 .
7 )
。
(P ) X 同工酶谱带中 , 中区谱带
比较稳定 , 可以作为分类和进化研究
中种的鉴定 ` 。 在 (P ) X 一 2 区 , P ag 。 桔
袖 有 3 条酶 带 R f 0 . 3 8 、 R f 0 . 4 0 、 R f
0
.
1 3
, 九里香有 生条酶带 R f 0 . 26 、 R f
0
.
2 9
、
R f 0
.
4 0
、
R f 0
.
4 3
, 具有双亲综
合的 G O T 酶带 的 2 株再生植株共有
5 条 P ( ) X 酶带 R f 0 . 2 6 、 R f 0 . 2 9 、 R f
R f x lo 九里香 杂种 P a g e
— — G O T 一 l
— — G O T一 2+
_
I
〕 o x 一 2
P o x 一 3
+
图 飞 aP ge 桔袖 九里香体 细胞杂种
的 G O T 、 P O X 同工酶谱图
F 一9 . I G ( ) T a n d P O X i s o z y m e p a t r e r n s o f
“
P a g e
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T a n g e l
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( )
r a n g e J s s a m in e
。 . 38 、 R f 0 . 40 、 R f 0
.
43
,显然是双亲的综合酶带 。 除此之外 ,也有与九里香一样的 (P ) X 一 2 区
与 PO X 一 3 区之间的 l 条特征酶带 R f0 . 60 。 综合上述酶带特征 , 这 2 株再生植株具有双亲综
合的 (兀 ) T 和 P O X 酶带 , 其染色体数 目经检 查为 2n 一 x4 一 3 6 , 植株的叶片也具有与九里香
一样的羽状复 叶特征 (图版 6 ) , 因此 , 可以确认这 2 株再生植株为杂种植株 , 其它植株只具
有与 P a ge 桔袖相同的酶带类型 (图 1 ) 。
九里香对柑桔黄龙病具有高抗性 , 而且耐旱 、 耐盐碱 , 由于与柑桔属有性杂交 不亲和
而无法利用 , 通过原生质体融和获得的 P ag e 桔袖 二 九里香体细胞杂种 , 将有可能将九里
香的抗病性和耐旱性转移到 P a ge 桔袖中 , 直接用于生产或作为宝贵的抗病育种 资源加以
利用 。
3 讨论
长期以来 , 柑桔的品种改 良主要依赖于体细胞突变 , 即芽变及珠心苗变异 , 由于多胚
性 、 漫长的童期 、 遗传上的高度异质性 以及柑桔的大多数性状呈受多基因控制 的数量性状等
柑桔类植物所固有的一些特征 , 限制了有性 杂交在柑桔品种改 良上的实际应用 。 远缘杂交
的不亲和性在柑桔的有性杂交 中表现很明显 , 除积属外 , 柑桔属与其它的近缘属杂交都表
现出高度不亲和性 ,无法利用近缘属的有利性状 , 体细胞杂交 由于利用的是体细胞 , 不仅
克服 了远缘杂交的不亲和性 , 成功地获得 了与柑桔属有性杂交不亲和的近缘属壕壳刺 、 澳
洲指桔 、 非洲樱桃桔 、 黄皮等与柑桔属的体细胞杂种 止二, 使近缘属中的有利性状 如抗旱 、 抗
病等性状转移到柑桔属中成为可能 ; 而且还克服 了雌 /雄不育和花期不遇造成的障碍 , 通
过原生质体融合成功地获得了脐橙与温州蜜柑和伏令夏橙与宁波金柑的体细胞杂种 , 这些
都是通过有性 杂交无法做到的 , 因此 , 原生质体融合技术对于柑桔的品种改 良具有特别重
要的意义 。
第 2期 甘 霖等 : 柑桔属 与九里香属的原生质体融合及植株再生
2 034 5 67
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在 GO T一 2区有 1 条酶带 R f 0. 5 6, 在
G O T
一
1 区与 G O T 一 2 区之间有 1 条特
征酶带 R f 0 . 4 5 。 其中有三株再生植株
具 有双 亲综 合的 (弧 ) T 酶 带 , 即 在
G O T
一
l 区 有 2 条 酶 带 R f 0 . 2 5 、 R f
0
.
3 0
, 在 G O T 一 2 区有 2 条带 R f 0 . 6 0 、
R f 0
.
6 5
, 在 G O T 一 1 区与 G ( ) T 一 2 区之
间有 1 条特征酶带 R f 0 . 4 5 (图 1 、 图版 .
7 )
。
(P ) X 同工酶谱带中 , 中区谱带
比较稳定 , 可以作为分类和进化研究
中种的鉴定 ` 。 在 (P ) X 一 2 区 , P ag 。 桔
袖 有 3 条酶 带 R f 0 . 3 8 、 R f 0 . 4 0 、 R f
0
.
1 3
, 九里香有 生条酶带 R f 0 . 26 、 R f
0
.
2 9
、
R f 0
.
4 0
、
R f 0
.
4 3
, 具有双亲综
合的 G O T 酶带 的 2 株再生植株共有
5 条 P ( ) X 酶带 R f 0 . 2 6 、 R f 0 . 2 9 、 R f
R f x lo 九里香 杂种 P a g e
— — G O T 一 l
— — G O T一 2+
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〕 o x 一 2
P o x 一 3
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图 飞 aP ge 桔袖 九里香体 细胞杂种
的 G O T 、 P O X 同工酶谱图
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.
43
,显然是双亲的综合酶带 。 除此之外 ,也有与九里香一样的 (P ) X 一 2 区
与 PO X 一 3 区之间的 l 条特征酶带 R f0 . 60 。 综合上述酶带特征 , 这 2 株再生植株具有双亲综
合的 (兀 ) T 和 P O X 酶带 , 其染色体数 目经检 查为 2n 一 x4 一 3 6 , 植株的叶片也具有与九里香
一样的羽状复 叶特征 (图版 6 ) , 因此 , 可以确认这 2 株再生植株为杂种植株 , 其它植株只具
有与 P a ge 桔袖相同的酶带类型 (图 1 ) 。
九里香对柑桔黄龙病具有高抗性 , 而且耐旱 、 耐盐碱 , 由于与柑桔属有性杂交 不亲和
而无法利用 , 通过原生质体融和获得的 P ag e 桔袖 二 九里香体细胞杂种 , 将有可能将九里
香的抗病性和耐旱性转移到 P a ge 桔袖中 , 直接用于生产或作为宝贵的抗病育种 资源加以
利用 。
3 讨论
长期以来 , 柑桔的品种改 良主要依赖于体细胞突变 , 即芽变及珠心苗变异 , 由于多胚
性 、 漫长的童期 、 遗传上的高度异质性 以及柑桔的大多数性状呈受多基因控制 的数量性状等
柑桔类植物所固有的一些特征 , 限制了有性 杂交在柑桔品种改 良上的实际应用 。 远缘杂交
的不亲和性在柑桔的有性杂交 中表现很明显 , 除积属外 , 柑桔属与其它的近缘属杂交都表
现出高度不亲和性 ,无法利用近缘属的有利性状 , 体细胞杂交 由于利用的是体细胞 , 不仅
克服 了远缘杂交的不亲和性 , 成功地获得 了与柑桔属有性杂交不亲和的近缘属壕壳刺 、 澳
洲指桔 、 非洲樱桃桔 、 黄皮等与柑桔属的体细胞杂种 止二, 使近缘属中的有利性状 如抗旱 、 抗
病等性状转移到柑桔属中成为可能 ; 而且还克服 了雌 /雄不育和花期不遇造成的障碍 , 通
过原生质体融合成功地获得了脐橙与温州蜜柑和伏令夏橙与宁波金柑的体细胞杂种 , 这些
都是通过有性 杂交无法做到的 , 因此 , 原生质体融合技术对于柑桔的品种改 良具有特别重
要的意义 。
5 7第 2 期 甘 霖等 :柑桔属与九里香属的原生质体融合及植株再生
参 考 文 献
2
3
4
5
6
7
H ga war aT
,
K o b a y a s h i S
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e n e t , 1 9 8 5
,
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:
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甘 霖 . 柑桔原生质体融合及体细胞杂种的抗性研究 . 华中农业大学博士学位论文 , 1 9 9 3
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r o o t s t o e k s f r o m e e ll一 f u s io n o f f e r g r e a t p o t e n t ia l . C i t r u s I n d u s r r y , 1 9 9 1
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.
P r o e I s t I n r C i t r u s
C
o n g r e s s
,
1 9 6 9
,
3
:
1 1 5 5~ 1 1 6 1
朱 徽等 . 植物染色体及染色体技术 . 科学出版社 , 1 9 8 2
肖顺元 , 章文才 , 陈吉笙 , 万蜀渊 . 利用同工酶鉴定柑桔杂种与遗传分析的研究 . 园艺学报 , 1 9 89 , 1 6 :
2 5 5~ 2 6 0
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