全 文 ：新疆雪莲组培苗的染色体观察
张蜀敏1 ,2 , 王晓军1 , 陈 阳1 ,2　(1.中国科学院新疆理化技术研究所 ,新疆乌鲁木齐 830000;2.中国科学院研究生院 ,北京 100039)
摘要　[目的]为雪莲的组织培养奠定细胞学基础。[方法] 以新疆雪莲无菌苗的根部、下胚轴、真叶及种胚为外植体进行组织培养 ,观察
愈伤组织和不定芽阶段的染色体变异。[结果] 4种外植体形成的愈伤组织细胞中有二倍体、少量四倍体、六倍体 、非整倍体及其他倍性
细胞。以种胚为外植体的愈伤组织中染色体数目异常的频率最高 ,但愈伤组织不出芽或出芽量极少 ,且芽形态不正常。以根部、下胚轴
和真叶为外植体的愈伤组织出芽比例高 ,茎尖 、根尖细胞染色体大多数为二倍体 , 少数为嵌合体 ,嵌合体苗中四倍体细胞比例很小。愈
伤组织中存在异常的有丝分裂现象 ,不定芽中难以发现。[结论]雪莲组织培养中的染色体变异是由激素引起的 ,非整倍性的愈伤组织
细胞分化能力低。
关键词　新疆雪莲;染色体;激素
中图分类号　Q343.2+1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)03-00971-02
Observation on the Chromosome in Tissue Culture Seedlings of Saussurea involucrata
ZHANG Shu-min et al　(Xinjiang Institute of Physical &Chemical Technology , Chinese Academy of Sciences , Urumqi , Xinjiang 830000)
Abstract　[ Objective] The aim of the study was to lay cytological foundation for tissue culture of Saussurea involucrate.[ Method] With root , lower
hypocotyl , leaf and seed embryo of asepsis seedlings of S.involucrate as expants , the tissue culture was conducted to observe chromosome variation in
callus and adventitious bud stages.[ Result] The callus cells formed from 4 kinds of explants had diploid , a few tetraploid , sextuploid , aneuploid and
cells with other ploidies.The abnormal rate of chromosome number was highest in the callus with seed embryo as explant , but the callus grew out no bud
or very few buds with abnormal bud shape.The budding ratios of callus with root , lower hypocotyl and leaf as explants were high.Most chromosome in
cells of stem and root tips were diploid , a few weremixoploid.The tetraploid cell ratiowas very small in mixoploid seedlings.Callus had abnormal mito-
sis , which was difficult to find in adventitious bud.[ Conclusion] The chromosome variation in S.involucrate tissue culturewas induced by hormone and
the differentiation ability of callus cells with aneuploid was low.
Key words　Saussurea involucrata;Chromosome;Hormone
基金项目　中国科学院西部行动高新技术项目:新疆雪莲规模化组培
快繁技术研究(KGCX2-SW-506)。
作者简介　张蜀敏(1982-),女 ,四川南充人 ,硕士研究生, 研究方向:
植物遗传育种。
收稿日期　2007-09-11
　　新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)(2n =2x =
32
[ 1]),菊科凤毛菊属多年生草本植物 ,是名贵中药材[ 2] 。由
于雪莲生长环境特异 ,人工栽培困难 ,加上长期以来对雪莲
的粗放型和掠夺性采挖 ,导致目前雪莲资源日益匮乏 。很多
专家学者对其组织培养技术展开了研究 ,国内外均有大量报
道[ 3-5] 。染色体变异是组织培养过程中常见的一种变异现
象 ,其一方面影响了遗传稳定性 ,另一方面却成为培育植物
新品种的一条途径。笔者首次对新疆雪莲组培过程中的愈
伤组织阶段 、不定芽阶段进行染色体观察 ,探索其组培过程
中的染色体变异现象 ,以期为雪莲的组织培养奠定一定的细
胞学基础。
1　材料与方法
1.1　材料　①无菌苗。雪莲种子来自新疆和静县。用 75%
乙醇消毒种子表面30 s ,后用 0.1%HgCl2溶液消毒 10min ,再
用 15%H2O2 溶液消毒 30min ,将消毒后的种子用灭菌水漂洗
4 ～ 6次 ,播种于MS培养基上。10 d后大量无菌苗发生 ,将无
菌苗切割成根部 、下胚轴 、真叶。②种胚 。将消毒后的种子
经无菌水浸泡 4 h ,剥去种皮 ,得到种胚。
1.2　方法　①愈伤组织的诱导。将无菌苗的根部 、下胚轴 、
真叶及种胚分别接种到愈伤诱导培养基上诱导愈伤生成。
培养基配方为:MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L +2 ,4-D
0.1mg/L。②不定芽的增殖。将以上诱导产生的不定芽切
下进行继代培养 ,每 15～ 20 d继代一次 ,培养基配方为:MS+
6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.05 mg/L。③生根培养。不定芽长
至 3～ 4 cm时 ,将其切下转入生根培养基中诱导生根。生根
培养基配方为:1/2MS+NAA 0.1 mg/L。
1.3　染色体的鉴定　①愈伤染色体鉴定 。切取愈伤依次置
于 4 ℃蒸馏水中 6 h;0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液 , 2 h;卡诺
氏固定液(乙醇∶冰乙酸体积为 3∶1),室温 , 24 h;58 ℃下 , 1
mol/LHCl ,6min ;45%乙酸软化 , 2min;蒸馏水漂洗;改良苯
酚品红溶液染色 ,20 min。压片 ,在显微镜下镜检观察并拍
照。 ②茎尖染色体鉴定。与愈伤染色体鉴定步骤相同 。③
根尖染色体鉴定。切取根尖依次置 0.002 mg/L 8-羟基喹啉
溶液 ,5 h;卡诺氏固定液 24 h;蒸馏水漂洗;58 ℃1mg/LHCl ,
5min;改良苯酚品红 , 20 min;压片 ,在显微镜下镜检观察并
拍照 。
2　结果与分析
2.1　雪莲愈伤组织细胞染色体数目的观察　无菌苗的根
部 ,下胚轴 ,真叶及种胚接种到愈伤诱导培养基上 ,20 d后 ,
愈伤生成。不同外植体愈伤形成率都在 98%以上。对不同
外植体所形成的愈伤组织细胞进行染色体鉴定 ,结果发现:
各外植体形成的愈伤组织细胞中 ,除正常的二倍体细胞外 ,
都包括了少量四倍体 、六倍体 、非整倍体细胞及其他倍性的
细胞(图 1)。在 4种外植体类型中 ,以种胚为外植体得到的
愈伤组织细胞中二倍体细胞比例最低 ,仅为 62%,其他倍性
细胞比例最高 ,达 38%,特别是非整倍体细胞比例最高
(25%),而以根部 、下胚轴 、真叶为外植体得到的愈伤组织细
胞中 ,二倍体细胞比例均在 75%左右 ,其他倍性细胞比例在
25%左右(表 1)。表 1显示 ,以种胚为外植体的愈伤组织中
异常染色体数目的细胞比例最高。
2.2　雪莲不定芽茎尖细胞染色体数目的观察　对 4种外植
体诱导的愈伤组织进一步培养一段时间后 ,愈伤出芽。其
中 ,以根部 、下胚轴 、真叶为外植体诱导的愈伤组织出芽比例
高 ,芽形态正常 ,变异小 ,但以种胚为外植体诱导的愈伤组织
不出芽或出芽量极少 ,且芽形态不正常 ,变异高 ,难以扩繁 ,
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(3):971-972 , 987　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　朱新秀　责任校对　朱新秀
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.03.087
无法对其进行染色体鉴定。以根部 、下胚轴 、真叶为外植体
的不定芽进行茎尖染色体鉴定 ,大多数的不定芽为二倍体植
株 ,达 91%以上 ,少数为嵌合体植株 ,未发现完全纯和的四倍
体植株。原因可能是不定芽是由表皮单细胞或邻近几个细
胞共同发育而来 ,该试验以根部 、下胚轴 、真叶为外植体诱导
的愈伤组织中二倍体细胞比例高达 75%,四倍体细胞比例低
至 25%左右 ,因此不同倍性不定芽发生的概率表现为:二倍体
不定芽>嵌合体不定芽>四倍体不定芽。另外 ,在这些嵌合体
植株中 ,二倍体细胞比例保持在 85%左右 ,四倍体细胞比例在
11%左右(表 2),六倍体 、八倍体及非整倍体细胞极少。
表 1　雪莲愈伤组织中染色体倍性的变化
Table 1 Changes of chromosome ploidy in callus of Saussurea involucrata
外植体类型
Explant type
观察细胞总数∥个
Total cells observed
二倍体细胞比例∥%
Proportion of
diploid cells
四倍体细胞比例∥%
Proportion of
teraploid cells
非整倍体细胞比例∥%
Proportion of
aneuploid cells
高倍体细胞比例∥%
Proportion of more
polyploid cells
根部 Root 200 75 　　　　9 14 2
下胚轴 200 75 9 15 1
Lower hypocotyl
真叶 leaf 200 72 10 15 3
种胚 Embryo 200 62 11 25 2
　注:a:2n=32;b:4n=64;c:6n=96;d:2n=37;e:2n=35;f:2n=
30;图片皆是在 10×100的放大倍数下拍摄。
Note:All above photographs were screened under 10×100 magnifier.
图1　雪莲愈伤组织中不同倍性细胞的染色体
Fig.1 Chromosome in different ploidy cell in callus of Saussurea in-
volucrata
2.3　雪莲不定芽根尖细胞染色体数目的观察　以根部 、下
胚轴 、真叶为外植体得到的不定芽大量扩繁 ,然后进行生根 ,
对根尖细胞进行染色体鉴定 ,二倍体苗占大多数 ,少数为嵌
合体苗 ,且发现嵌合体苗比例与四倍体细胞比例与茎尖染色
体检测结果相比基本保持一致 ,无明显上升或下降趋势 。嵌
合体苗中 ,六倍体 、八倍体及非整倍体细胞极少见(表 2)。
2.4　雪莲细胞有丝分裂行为的观察　观察发现有染色体
桥 、染色体落后 、微核等异常有丝分裂现象。这些异常有丝
分裂行为主要存在于愈伤组织细胞(特别是以种胚为外植体
诱导的愈伤组织细胞出现的频率最高),而在不定芽茎尖 、根
尖细胞中难以发现。
3　讨论
3.1　雪莲愈伤组织细胞中染色体数目异常的分析　一般认
为 ,植物组织培养过程中 ,染色体数目的变异现象普遍存
在[ 6] 。并且生长素对于染色体数目的变异起了重要作用 ,其
中尤以 2 ,4-D 、NAA对其影响最为显著 ,例如在伊贝母[ 6] 、大
表2　雪莲不定芽茎尖及芽根尖中染色体倍性的变化
Table 2　Changes of chromosome ploidy in shoot-tip of abventitious buds and in root-tip of bud of Saussurea involucrata
外植体类型
Explant type
二倍体苗比例∥%
Proportion of diploid
seedlings
嵌合体苗比例∥%
Proportion of mixoploid
seedlings
嵌合体苗中不同倍性细胞的比例
Different ploidy cell in mixoploid seedlings
二倍体细胞比例∥%
Proportion of diploid cells
四倍体细胞比例∥%
Proportion of teraploid cells
芽茎尖 根部 91 9 87 13
Shoot-tip of bud Root
下胚轴 94 6 90 10
Lower hypocotyl
真叶 leaf 93 7 89 11
芽根尖 根部 90 10 89 11
Root-tip of bud Root
下胚轴 93 7 86 14
Lower hypocotyl
真叶 leaf 92 8 88 12
　注:观察不定芽均为 50株。
　Note:Fifty plants were observed for abventitious buds.
麦[ 7] 、马铃薯[ 8]等植物中 , 2 , 4-D 、NAA都能导致愈伤染色体
数目变异 ,且效果表现为 2 ,4-D>NAA。前人研究认为 ,导致
染色体数目变异的原因之一可能是在离体培养条件下 ,外源
激素远高于植物体内正常的激素水平 ,这必然对细胞某些代
谢过程产生干扰或抑制效应 ,使细胞分化不能正常进行 ,出
(下转第 987页)
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特性有待进一步研究 。
参考文献
[ 1] 景士西.园艺植物育种学[M] .北京:中国农业出版社 ,2000:220-230,
244-248.
[ 2] 包满珠.园林植物育种学[M] 北京:中国农业出版社 ,2004:139-159.
[ 3] 汪隆植 ,何启伟.中国萝卜[M] .北京:科学技术文献出版社, 2005.
(上接第 972页)
现有丝分裂的异常 ,导致各种倍性细胞的产生[ 5] 。因此 ,该
试验中愈伤组织细胞出现的明显的染色体数目变异现象 ,与
愈伤诱导培养基中 2 ,4-D 、NAA的作用密不可分 。
以种胚为外植体诱导得到的愈伤组织细胞中 ,染色体数
目的变异频率最高 ,可能是由于种胚具有更强的分化潜能 ,
在激素的作用下 ,细胞更容易发生各种分化变异 。同时也说
明雪莲不同外植体对激素的敏感性不同 ,导致愈伤组织细胞
中染色体变异程度不同 。在该试验中 ,以种胚为外植体的愈
伤组织细胞染色体变异频率高 ,但难以得到分化的不定芽 ,
针对种胚的这一特性 ,一方面 ,可通过改变试验条件 ,特别是
激素配比 ,进一步提高愈伤组织中各种染色体数目的细胞 ,
如果能将这些细胞游离 ,就能获得各种染色体数目变异的无
性系[ 8] ,这对于染色体的研究及丰富雪莲遗传多样性都有重
要意义。另一方面 ,一些植物分子生物学试验需要结合组织
培养 ,由于分子水平上的试验 ,要求材料具有稳定的染色体
状态 ,所以在以雪莲为对象的分子生物学试验上 ,应尽量避
免采用种胚为材料 ,以保证染色体的稳定性。
3.2　雪莲不定芽茎尖 、根尖细胞中染色体数目异常的分析
　在该试验中 ,虽然以种胚为外植体得到的愈伤组织中 ,染
色体数目变异的细胞比例高(非整倍体细胞比例高),但其愈
伤组织却难以分化出芽。而以根部 、真叶 、下胚轴为外植体
得到的愈伤组织中 ,染色体数目变异的细胞比例低 ,但其愈
伤组织却大量出芽。这证实了愈伤组织得以分化的前提是
染色体的整倍性[ 6] ,对于雪莲而言 ,愈伤组织中变异的细胞 ,
特别是非整倍性的细胞比例越高 ,愈伤组织越难分化 。前人
的研究也证实了这一结论 ,王伦山[ 6] 在对伊贝母的研究中发
现 ,NAA+KT的组合中 ,由于非整倍性细胞的比例低 ,使得愈
伤组织分化的能力高;Ziauddin[ 7]对大麦的研究进一步支持了
这一观点 ,正常的不定芽不可能来自于异常的细胞 。
不定芽是由表皮单细胞或邻近几个细胞共同发育而来 ,
在嵌合体不定芽中难以发现非整倍性的细胞 ,进一步说明了
非整倍性细胞分化能力低 ,难以分化出不定芽。可通过调整
培养基配方 ,特别是调整各种激素配比 ,达到提高愈伤组织
中整倍体细胞比例 ,降低非整倍体细胞比例的目的 ,从而提
高愈伤组织的分化潜能。
3.3　雪莲细胞有丝分裂行为的分析　有文献报道 ,愈伤组
织中存在有丝分裂异常的现象 ,如染色体桥 、染色体落后 、微
核现象等。这些异常的有丝分裂现象同样存在于雪莲的愈
伤组织中。外源激素对这些异常的有丝分裂现象影响很大 ,
如A.Ziauddin[ 7]对大麦的研究指出 ,外源激素导致大麦愈伤
组织细胞产生异常的有丝分裂行为 ,其表现为 NAA>2 , 4-D。
这些异常的有丝分裂行为是导致染色体数目变异的途径之
一。胡含等[ 9]认为 ,离体培养容易引起植物体细胞的核内有
丝分裂 、核融合 、多极有丝分裂以及染色体断裂等现象 。而
这些有丝分裂的异常过程 ,是产生染色体加倍 、混倍体以及
染色体变异的各种新类型的重要原因;Staesh[ 10]也认为 ,染色
体落后 、纺锤体不分离可导致形成染色体数目低的细胞核;
总之 ,针对雪莲愈伤组织中出现的有丝分裂异常的现象 ,可
以认为是外源激素影响了植物正常的生理生化过程 ,从而干
扰了正常有丝分裂过程 ,导致变异的有丝分裂行为产生 ,变
异的有丝分裂行为进一步促使了不同染色体数目的细胞核
形成 ,但具体的作用机制还需要进一步探讨。另外 ,该试验
以种胚为外植体得到的愈伤组织细胞中 ,染色体数目变异的
细胞比例最高 ,同时异常的有丝分裂行为出现的频率也是最
高 ,这也与上述的观点相吻合 ,即异常有丝分裂行为是导致
异常的染色体数目途径之一。
4　小结
该试验中 ,笔者观察了从雪莲愈伤组织到不定芽根尖的
染色体变化 ,根据试验结果 ,虽然最终得到的组培苗中包含
有少量的嵌合体植株 ,但这些嵌合体植株中的四倍体细胞比
例很低。由于二倍体细胞较四倍体细胞分裂速度快 ,若四倍
体细胞不占到绝大比例 ,则最终会在长期的生长过程中被二
倍体细胞所“淹没” ,嵌合体植株最终变为二倍体植株[ 11] 。因
此 ,组培苗中少量的嵌合体植株是可以忽略 ,从而认为该组
织培养的配方能保证雪莲组培苗染色体的稳定性 ,有利于对
雪莲做进一步的研究分析 。另外 ,优化激素配比 、通过组织
培养途径得到多倍体植株多有报道 。并且该途径较之采用
秋水仙素诱导法 ,能显著降低嵌合体的比例 ,得到大量纯合
的多倍体植株。可以进一步调整激素比例 ,尝试通过组织培
养途径得到多倍体雪莲。
参考文献
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