全 文 ：第 6卷第 2期 过 程 工 程 学 报 Vol.6 No.2
2006年 4 月 The Chinese Journal of Process Engineering Apr. 2006

收稿日期：2005−04−18，修回日期：2005−05−27
基金项目：国家 863计划海洋生物技术主题基金资助项目(编号：2004AA626040)
作者简介：李兴武(1979−)，男，湖北省荆门市人，硕士研究生，生物化工专业；李元广，通讯联系人，E-mail: ygli@ecust.edu.cn.
普通小球藻异养−光自养串联培养的培养基
李兴武 1， 李元广 1， 沈国敏 1， 杨 东 2
(1. 生物反应器工程国家重点实验室，华东理工大学海洋生化工程研究所，上海 200237；
2. 上海泽元海洋生物技术有限公司，上海 200237)
摘 要：采用单因素实验和均匀实验获得了适合于普通小球藻异养−光自养串联培养的培养基(HA−SK培养基)，其关
键是 C/N比和保证足够的 C, N供应. 采用该培养基在摇瓶中异养−光自养串联培养普通小球藻，异养培养结束时细胞
密度达 13.17 g/L，经过 36 h光自养培养后藻体蛋白质和叶绿素含量分别达 49.75%和 30.17 mg/g. 用 5 L生物反应器和
1 L平板光生物反应器串联培养，藻细胞密度最高可达15.36 g/L，藻体蛋白质和叶绿素含量分别达54.78%和31.23 mg/g.
表明采用 HA−SK培养基进行异养−光自养串联培养可实现普通小球藻的高密度高品质培养.
关键词：异养−光自养串联培养；普通小球藻；培养基；蛋白质含量；叶绿素含量
中图分类号：Q949.2 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2006)02−0277−04
1 前 言
小球藻富含蛋白质、多种色素、B族维生素、必需
氨基酸、微量元素和一些生物活性代谢产物[1]，而且同
时具有抗癌、抗辐射、抗感染、抗氧化、防治高血脂症、
防治便秘以及骨髓抑制等一系列生理保健功能，是目前
保健食品开发应用最理想和研究最多的微藻之一[2].
目前，小球藻的大规模培养方法通常采用传统的开
放式户外大池光自养培养，虽然成本低、藻体品质高[3]
[蛋白质含量 51%，叶绿素含量 24.4 mg/g (干重，下同)]，
但由于细胞密度低(0.2∼0.5 g/L)、易污染等缺点[4]，使其
发展受到较大的限制. 采用异养方式培养小球藻虽可较
大幅度地提高细胞密度[5,6]，但与光自养培养相比，获得
的藻体品质低(即蛋白质和色素的含量明显下降)[7−10].
Ogbonna等[10]采用Endo培养基异养−光自养串联培养蛋
白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa C−212)，可使藻体蛋
白质和叶绿素含量得到较大幅度的提高，藻细胞密度及
蛋白质和叶绿素含量分别可达 14 g/L, 60.1%和 36 mg/g.
普通小球藻(Chlorella vulgaris)是目前商业化生产中普
遍采用的藻种之一，其在异养高密度培养过程中也存在
品质下降问题[9]. 本研究尝试通过异养−光自养串联培
养方式实现普通小球藻高密度高品质培养，拟以普通小
球藻培养所用Sorokin−Krauss培养基[11](简称SK培养基)
为基础，首先解决培养基问题.
2 材料与方法
2.1 材料
藻种：普通小球藻(Chlorella vulgaris)，购自中国科
学院武汉水生生物研究所.
2.2 培养基
本工作共涉及 3种培养基，其中 HA−SK培养基为
最终优化后培养基，具体组成见表 1.
表 1 培养基组成
Table 1 The composition of medium
Medium Medium ingredient
HA-SK Adjusted SK SK
Glucose (g) 30 15 0
KNO3 (g) 9.28 2.00 1.25
KH2PO4 (g) 1.40 1.25 1.25
MgSO4⋅7H2O (g) 0.7 1.0 1.0
CaCl2 stock1) (mL) 17 10 10
FeSO4 stock2) (mL) 8 20 20
Trace element3) (mL) 1 1 10
Note: 1) CaCl2⋅2H2O 6.35 g; 2) FeSO4⋅7H2O 2.49 g, EDTA 25 g;
3) H3BO3 11.42 g, ZnSO4⋅7H2O 8.82 g, MnCl2⋅H2O 1.42 g,
(NH4)6Mo7O24⋅4H2O 0.8707 g, CuSO4⋅5H2O 1.57 g, Co(NO3)2⋅6H2O
0.49 g; 1)∼3) Distilled water 1 000 mL.
2.3 培养方法
2.3.1 摇瓶异养−光自养串联培养方法
250 mL 摇瓶中异养培养普通小球藻，待培养液中
葡萄糖消耗完后，开启外部光源进行光自养培养，接种
量 10%，装液量 100 mL，培养温度 30℃，摇床转速 150
r/min，光强 8000 lx.
2.3.2 反应器异养−光自养串联培养方法
反应器培养在 5 L生物反应器/1 L开放式平板光生
物反应器串联培养体系中进行. 在 5 L生物反应器中进
行异养培养，待培养液中有机碳源消耗完后，将其转入
1 L 开放式平板光生物反应器中进行光自养培养. 异养
培养条件为：接种量 10%，装液量 3.6 L，温度 30℃，
278 过 程 工 程 学 报 第 6卷

通气量 3.6 L/min，转速 200∼250 r/min；光自养培养条
件为：装液量 0.8 L，温度 30℃，通气量 0.8 L/min，反
应器外部光强 25000 lx.
2.4 分析方法
细胞密度的测定：在一定范围内，藻细胞浓度 CX
与波长 540 nm下的光密度(OD540)值呈线性关系，由标
准曲线计算细胞密度：CX=0.5205OD540 (R2=0.9987).
藻体总蛋白质含量采用微量凯氏定氮法测定[12]，藻
体叶绿素含量采用甲醇提取法测定[10]，葡萄糖的测定采
用葡萄糖试剂盒(卫生部上海生物制品所)，NO3−的测定
采用水杨酸比色法[13].
3 结果与讨论
3.1 初始培养基的确定及其在摇瓶中异养-光自养串联
培养普通小球藻过程特征分析
分别采用 SK培养基(由于是异养培养，添加 15 g/L
葡萄糖)、调整后的 SK 培养基异养培养普通小球藻(配
方见表 1)，结果表明采用调整后的 SK培养基异养培养
普通小球藻的生长速率、最高细胞密度及藻体蛋白质和
叶绿素含量均明显高于 SK 培养基. 图 1 给出了调整后
SK 培养基异养−光自养串联培养普通小球藻的过程曲
线. 可以看出藻细胞的生长与葡萄糖及硝酸钾消耗密切
相关. 在异养培养前期藻体蛋白质和叶绿素含量均呈上
升趋势，异养培养 42 h 分别达最大值 37.93%和 20.17
mg/g，到异养培养结束时降为 28.61% 和 16.13 mg/g；
而进入光自养培养后藻体蛋白质和叶绿素含量并无明
显升高，与硝酸钾消耗曲线密切相关. 另一方面，细胞











图 1 调整后 SK培养基异养−光自养串联培养
普通小球藻过程曲线
Fig.1 Profiles of sequential heterotrophic−autotrophic
cultivation of Chlorella vulgaris with adjusted SK
medium in a 250 mL flask
干重与葡萄糖密切相关. 所以，要优化 C和 N的浓度.
3.2 初始 KNO3浓度优化
在250 mL摇瓶中考察了KNO3浓度对异养−光自养
串联培养过程中细胞生长及藻体蛋白质和叶绿素含量
的影响，结果如图 2. 图 2(a)表明，KNO3对细胞干重和
pH 影响不大. 图 2(b)是异养培养和光自养培养结束时
的藻细胞蛋白和叶绿素含量，表明初始 KNO3浓度增加
使藻体蛋白质和叶绿素含量明显上升，当 KNO3的浓度
为 4 g/L时，培养结束时二者含量分别为 52.52%和 33.92
mg/g，与调整后 SK培养基相比有了大幅度的提高.
考虑到光自养培养结束后，KNO3初始浓度为 4 g/L
的培养液中仍残留有 0.5 g/L左右的 KNO3，因此，最后
将 KNO3的初始浓度选定在 3.5 g/L.













图 2 初始 KNO3浓度对异养−光自养串联培养中普通小球藻生长及藻体蛋白质和叶绿素含量的影响
Fig.2 Effects of initial KNO3 concentration on the growth, protein and chlorophyll content of
Chlorella vulgaris cultured with sequential heterotrophic−autotrophic model
3.3 初始葡萄糖浓度优化
图 3(a)给出了摇瓶中普通小球藻在相同 C/N比、不
同初始葡萄糖浓度的培养基中异养−光自养串联培养时
的细胞生长曲线. 从图可见，初始葡萄糖浓度增加使对
数生长期明显延长，最高藻细胞密度得到了大幅度的提
高，初始葡萄糖浓度为 30 g/L时异养培养 85 h的最高
藻细胞密度达 10.28 g/L.
由图 3(b)可见，随着初始葡萄糖浓度增加，异养培
0
2
4
6
8
10
12
14
6
7
8
9
10
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40
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
1
2
3
4
5
6
KNO3
DCW
KN
O
3 c
on
c.
, D
ry
c
el
l w
ei
gh
t (
g/
L)
Time (h)
Heterotrophy Autotrophy
Glucose
G
lu
co
se
c
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ce
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n
(g
/L
)
pH
pH

Chlrophyllo
Protein
C
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op
hy
ll
(m
g/
g)
, P
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(%
)
6
7
8
9
10
10
15
20
25
30
35
40
0 20 40 60 80 100
0
1
2
3
4
5
6
Time (h)
D
ry
c
el
l w
ei
gh
t (
g/
L)

KNO3 (g/L)
2
3
4
AutotrophyHeterotrophy
2 3 4
25
30
35
40
45
50
55
P
ro
te
in
c
on
te
nt
(%
)
Heterotrophy Autotrophy
Protent
Chlorophyll
KNO3 concentration (g/L)
(a) (b)
pH
C
hl
or
op
hy
ll
co
nt
en
t (
m
g/
g)
第 2期 李兴武等：普通小球藻异养−光自养串联培养的培养基 279
养结束时藻体蛋白质和叶绿素含量有下降的趋势，但光
自养培养结束时的藻体蛋白质和叶绿素含量均有较大
幅度的增加；此外，光自养培养结束时高浓度葡萄糖下
的藻体蛋白质和叶绿素含量略有下降.
进一步在 5 L生物反应器中考察了 45 g/L 葡萄糖
(与摇瓶培养时的 C/N比相同)下的生长，表明细胞生长
的延滞期明显延长，对数生长期的细胞生长速率也大幅
度下降，藻体干重对葡萄糖的得率也明显降低，这说明
高浓度的初始葡萄糖对藻细胞生长会产生明显的抑制
作用. 综合考虑，初始葡萄糖浓度选定在 30 g/L是合适
的，KNO3相应的浓度按照初始 C/N比增加至 7.0 g/L.













图 3 初始葡萄糖浓度对异养−光自养串联培养中普通小球藻生长及藻体蛋白质和叶绿素含量的影响
Fig.3 Effects of initial glucose concentration on the growth, protein and chlorophyll content of
Chlorella vulgaris cultured with sequential heterotrophic−autotrophic model









图 4 摇瓶中 HA−SK和调整后 SK培养基异养−光自养串联 图 5 5 L生物反应器/1 L平板光生物反应器中异养−光自养
培养时细胞生长及藻体蛋白质和叶绿素含量的变化 串联培养过程曲线
Fig.4 Changes of the cell growth, the content of protein and Fig.5 Changes of the cell growth, the content of protein and chlorophyll
chlorophyll of Chlorella vulgaris cultured with the initial of Chlorella vulgaris cultured in sequential 5 L bioreactor
medium and HA−SK medium in flask vs. culture time and 1 L plat photo-bioreactor system vs. culture time
3.4 培养基综合优化
均匀实验设计中涉及的实验因子有 5个，即 KNO3、
磷酸盐、MgSO4⋅7H2O, CaCl2和 FeSO4，每个因素为三
水平，采用均匀实验设计表 U13(138)[15]，培养基中其他
组成成分的量固定不变. 响应函数为细胞密度、蛋白质
含量和叶绿素含量，优化得到的配方见表 1中 HA−SK.
图 4 给出了分别采用 HA−SK 培养基和调整后 SK
培养基异养−光自养串联培养普通小球藻细胞生长及藻
体蛋白质和叶绿素含量变化曲线. 从图可见，普通小球
藻在 HA−SK培养基中异养培养周期从 60 h 缩短至 48
h，细胞密度可达 13.17 g/L，经过 36 h光照培养后藻体
蛋白质和叶绿素含量分别达 49.75%和 30.17 mg/g，比在
调整后的 SK培养基中有大幅度提高.
3.5 5 L 生物反应器/1 L 平板光生物反应器串联体系中
普通小球藻异养-光自养串联培养
图 5为 5 L生物反应器/1 L平板光生物反应器串联
体系中的培养结果. 在 5 L生物反应器异养培养阶段，
34 h时藻细胞达到最高密度 15.36 g/L，经过后续的 35 h
光自养培养，藻体蛋白质含量分别从 33.61%和 14.38
mg/g提高至 54.78%和 31.23 mg/g，比在摇瓶中更好. 表
10
15
20
25
30
0 20 40 60 80 100 120
0
2
4
6
8
10
D
ry
c
el
l w
ei
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t (
g/
L)
Time (h)
Initial glucose (g/L)
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Autotrophy
Heterotrophy
30
35
40
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P
ro
te
in
c
on
te
nt
(%
)
Heterotrophy Autotrophy
Protent
Chlorophyll
Glucose concentration (g/L)
C
hl
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ll
co
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t (
m
g/
g)
302215
(a) (b)
10
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20
25
30
30
35
40
45
50
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
2
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6
8
10
12
14
16
SK HA-SK
DCW
D
ry
c
el
l w
ei
gh
t (
g/
L)
Time (h)
Heterotrophy Autotrophy
Chlorophyll
C
hl
or
op
hy
ll
(m
g/
g)
Protein
Pr
ot
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n
co
nt
en
t (
%
)

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20
24
28
32
30
35
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45
50
55
0 10 20 30 40 50 60 70
0
2
4
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10
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Time (h)
D
ry
c
el
l w
ei
gh
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g/
L)
Heterotrophy Autotrophy
C
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hy
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(m
g/
g)
DCW
Chlorophyll
Protein
P
ro
te
in
c
on
te
nt
(%
)
280 过 程 工 程 学 报 第 6卷

明充分的混合和光照有利于普通小球藻的培养.
4 结 论
获得了适合于普通小球藻高密度高品质培养的异
养−光自养串联培养基，采用该培养基在摇瓶中异养−
光自养串联培养，异养培养周期从 60 h缩短至 48 h，异
养培养结束时细胞密度可达 13.17 g/L. 光自养培养后藻
体蛋白质和叶绿素含量分别达 49.75%和 30.17 mg/g，分
别比初始培养基提高了 69.8%和 68.7%. 进一步在 5 L
生物反应器/1 L平板光生物反应器串联体系中验证了该
培养基的培养效果，说明采用该培养基在生物反应器中
实现普通小球藻高密度高品质培养是完全可行的.
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24−26.
Medium for Culturing Chlorella vulgaris with Sequential Heterotrophic−Autotrophic Model
LI Xing-wu1, LI Yuan-guang1, SHEN Guo-min1, YANG Dong2
(1. State Key Lab. Bioreactor Eng., Inst. Marine Bioprocess Eng., East China Univ. Sci. & Technol., Shanghai 200237, China;
2. Shanghai Zeyuan Marine Biotechnology Ltd., Shanghai 200237, China)
Abstract: The medium (HA−SK medium) for culturing Chlorella vulgaris with sequential heterotrophic−autotrophic model was
optimized by using the one-at-a-time strategy and uniformity experimental design. When Chlorella vulgaris was cultured with HA−SK
medium in 250 mL flask, the cell density reached 13.17 g/L at the end of heterotrophic cultivation, the cellular protein and chlorophyll
content were 49.75% and 30.17 mg/g after 36 h autotrophic cultivation, which were increased by 134%, 69.8% and 68.7% respectively
comparing with those obtained in an initial medium. As Chlorella vulgaris was cultured with HA–SK medium in sequential 5 L
bioreactor and 1 L plat photo-bioreactor system, the cell density reached 15.36 g/L at the end of heterotrophic cultivation, the cellular
protein and chlorophyll content were 54.78% and 31.23 mg/g after 35 h autotrophic cultivation. The results show that the cultivation of
Chlorella vulgaris with high cell density and high quality can be realized successfully by sequential heterotrophic−autotrophic model
with HA−SK medium.
Key words: sequential heterotrophic−autotrophic cultivation; Chlorella vulgaris; medium; protein content; chlorophyll content