全 文 ：收稿日期:2005 06 14
基金项目:广东省关键领域重大突破项目(2003A30908);广东省科
技攻关项目(2003C104025);华南理工大学高水平大学建设项目
作者简介:桂林(1975 ), 男 ,湖北武汉人 ,博士研究生 , 主要研究
方向为食品微生物和生物化工.
文章编号:1673 2383(2005)05 0052 04
蛋白核小球藻不同培养方式的比较
桂　林1 ,史贤明2 ,李　琳1 ,胡松青1 ,刘国琴1
(1.华南理工大学 轻工与食品学院 ,广东 广州 510640;
2.上海交通大学 食品科学与工程系 ,上海 201101)
摘要:采用自养 、异养 、混养3种方式对蛋白核小球藻15 2070进行了培养.测定了3种培养方
式获得的生长曲线 、最高生物量(干重)和最大比生长速率.对3种方式培养获得的藻细胞的化
学组分进行了检测 ,并比较了三者之间的差异.
关键词:蛋白核小球藻;自养;异养;混养
中图分类号:TS201.3　　　　文献标识码:B
0　前言
小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属的普生
性单细胞藻类 ,包括约十个种 ,常见的有蛋白核小
球藻(C.pyrenoidosa)、椭圆小球藻(C.ellipsoidea)、
普通小球藻(C.vulgaris)等[ 1] .小球藻细胞中含丰
富的蛋白质 、不饱和脂肪酸 、生物多糖 、膳食纤维 、
氨基酸 、维生素 、微量元素及其他活性物质.具有
防治消化性溃疡 、抗肿瘤 、增强免疫力 、抗辐射 、防
治贫血 、降血脂和抗动脉粥样硬化等保健功效 ,是
优质健康的绿色食品和良好的医疗保健品[ 2] .
从应用角度看 ,小球藻最初是作为单细胞蛋
白(SCP)资源进行开发利用 ,但其生长繁殖速度
比细菌和酵母慢 ,与这些单细胞生物竞争难以居
于优势 ,所以逐渐转向生产保健食品 、美容食品和
食品添加剂 ,并进一步开发利用小球藻的有效成
分作为医药和生化制剂 ,这反映了目前小球藻应
用研究的方向.譬如 ,从小球藻干粉中分离叶绿
素 、类胡萝卜素 ,作为天然色素原料;脱色后的藻
体再用于分离提取多糖 、糖蛋白 、小球藻生长因子
(CGF)、氨基酸 、ATP 和核酸等物质 , 作为医药原
料 、调味品 ,所以今后将会出现越来越多的小球藻
制成的商品[ 3] .
小球藻除了可以利用光能和CO2进行正常的
光合自养生长外 ,还可以在无光条件下利用有机
碳源和 O2进行异养生长繁殖 ,生长速率比自养条
件下快得多 ,类似于细菌的发酵;以及在光照条件
下 ,利用有机碳源进行混养培养.由于小球藻这一
特性和其较高的应用价值 ,所以有关培养方式 、转
化的机制 、细胞结构的变化 、生化成分和代谢调控
方面的研究尤为引人注目.但国内外的研究多集
中在异养方面 ,对混养机制的研究较少 ,特别是自
养 、异养 、混养三者之间的比较则几乎没有报道.
所以本研究把小球藻 3种培养方式同时进行了比
较 ,以期为大规模商业化培养小球藻 ,充分利用这
一宝贵资源提供科学依据和技术参考.
1　材料与方法
1.1　实验材料
蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)15 2070:由
Carolina Biological Supply Co.(Burlington , USA)提
供 , 用 Basal培养基制成的固体斜面低温保存.
Basal培养基[ 4] :分为自养 、异养和混养液体
培养基 ,组成见表 1.
1.2　实验仪器
舱式光照恒温摇床(New Brunswick Scientific
Co., USA),照度计(北京师范大学光电仪器厂),
恒温干燥箱(武汉市武昌实验仪器厂),真空冷冻
干燥器(Karl Kolb Scientific Technical Supplies ,Ger-
many), 721 型分光光度计(上海第三分析仪器
第26卷第 5期 河南工业大学学报(自然科学版) Vol.26 ,No.5
2005年 10月 Journal of Henan University of Technology(Natural Science Edition) Oct.2005
DOI :10.16433/j.cnki.issn1673-2383.2005.05.013
厂),微量凯氏定氮仪(湖北恒康化玻仪器公司),
索氏抽提器(湖北恒康化玻仪器公司),马福炉(河
南省鹤壁市热工仪器厂).
表 1　Basal培养基组成　mg/L
组　分 自养培养基 异养培养基 混养培养基
Glucose·H2O — 40 000 40 000
KNO3 1 250 7 000 7 000
KH2PO4 1 250 1 250 1 250
MgSO4·7H2O 1 000 1 000 1 000
EDTA 500 500 500
H3BO 3 114.2 114.2 114.2
CaCl2·2H2O 111 111 111
FeSO4·7H2O 49.8 49.8 49.8
ZnSO 4·7H2O 88.2 88.2 88.2
MnCl2·4H2O 14.2 14.2 14.2
MoO3 7.1 7.1 7.1
CuSO4·5H2O 15.7 15.7 15.7
Co(NO3)2·6H2O 4.9 4.9 4.9
pH 6.1 6.1 6.1
1.3　实验方法
1.3.1　培养方式
采用自养 、异养 、混养 3种培养方式对蛋白核
小球藻 15 2070进行培养.用 500 mL 三角瓶装
200 mL 液体培养基 , 121 ℃灭菌 20 min ,接种量
5%(V/ V).同时放入舱式光照恒温摇床中 ,光源
在摇床内部 ,由 6只 40 W 日光灯管组成 ,连续光
照.自养和混养的三角瓶直接曝露在光照下 ,而异
养的三角瓶用 3层黑色塑料袋包起来(露出棉塞
便于通气),使其不透光.用照度计测定摇床上各
点的光照强度 ,发现光强均匀 ,均为(4 000±100)
lx.然后开始恒温摇瓶培养 ,28 ℃,转速150 r/min ,
每隔 24 h取样一次 ,每次 5 mL ,测细胞干重(测定
方法见1.3.2).3种培养方式培养条件的不同之
处见表2 ,其余条件均相同.
表 2　3种培养方式培养条件的区别
碳源 、氮源和光照 自养 异养 混养
培养基中葡萄糖含量/(g·L -1) — 40 40
培养基中KNO3 含量/(g·L -1) 1.25 7 7
光照强度/ lx 4 000 — 4 000
1.3.2　细胞干重和最大比生长速率(μ)的测定
取1 mL藻液于已预烘干的离心管中 , 6 000
r/min离心 1 min ,弃去上清液 ,用吸水纸吸去管壁
表面附着的水分 ,把离心管敞口放入烘箱中 , 80
℃烘至恒重 ,测定干重.做 3个重复 ,取其平均值 ,
得到细胞干重.
最大比生长速率(μ)=(lnX2-lnX1)(t2-t1)
式中:X 1、X2 为对数生长期的细胞干重 , g/L;t 1、t2
为对应的培养时间 , d.
1.3.3　藻粉的制备
培养完毕后 ,收集培养液 ,6 000 r/min离心 4
min ,弃去上清液 ,收集藻泥 ,在真空冷冻干燥器中
干燥 ,把干燥后的藻体用研钵磨碎成藻粉 ,过 60
目筛 ,放入密封容器中 , -18 ℃保存备用.
1.3.4　藻细胞成分的测定
1.3.4.1　水分含量的测定
常压烘箱干燥法[ 5] .80 ℃恒温烘至恒重.
1.3.4.2　粗蛋白的测定
微量凯氏定氮法[ 6] .
1.3.4.3　粗脂肪的测定
索氏抽提法[ 5 , 6] .
1.3.4.4　粗灰分的测定
灼烧法[ 5 ,6] .
1.3.4.5　碳水化合物的测定
差减法[ 6] .碳水化合物(%)=100%-水分
(%)-粗蛋白(%)-粗脂肪(%)-粗灰分(%).
1.3.4.6　抗坏血酸的测定
2 ,6 二氯酚靛酚法[ 5] .
1.3.4.7　叶绿素的测定[ 5]
准确称取 0.1 g 藻粉 ,加入少许 CaCO3 ,再加
入80%丙酮 5 mL ,用细胞破碎器进行细胞破碎
(10 000 r/min , 5 min),离心(6 000 r/min , 4 min),
收集上清液;重复以上操作 ,直至提取液近乎无
色.收集所有提取液 ,用甲醇定容至 100 mL ,以甲
醇为对照 ,测定 663 nm 、645 nm处的吸光值.根据
下列公式 ,计算叶绿素 a 、叶绿素 b和总叶绿素的
含量.整个提取过程控制在 30 min 以内 ,并在弱
光下进行.
Ca=(12.72A663-2.59A645)×100 /(1 000×W)
Cb=(22.88A645-4.67A663)×100 /(1 000×W)
C总=(20.29A645+8.05A663)×100 /(1000×W)
式中:Ca 、Cb 、C总分别为叶绿素 a、叶绿素 b和总
叶绿素的含量 , mg/g;A663、A645分别为提取液在
663 nm 、645 nm 处的吸光值;W 为藻粉干重 , g.
1.3.4.8　叶黄素的测定
高效液相色谱法[ 7] :Millennium 2010 色谱工
作站(采用美国 Waters 高效液相色谱系统)、510
高压泵 、717 自动进样器 、996 光二极管阵列检测
器 ,以甲醇-二氯甲烷(2∶1 , V/ V)混合溶剂为叶
黄素提取剂 , 色谱柱为 Nova-Pak® C18柱 , 柱温
第 5期 桂林等:蛋白核小球藻不同培养方式的比较 53　
25 ℃,以甲醇-乙腈-水(80∶10∶10 , V/V/ V)和甲
醇-乙腈(40∶60 , V/ V)为流动相 ,梯度洗脱 ,流速
0.8 mL/min ,进样量 10μL ,在 447 nm 下用光电二
极管阵列检测器检测.
2　结果与分析
2.1　3种培养方式的比较
采用自养 、异养 、混养 3种方式培养蛋白核小
球藻 15 2070 ,并在其生长过程中测定生物量等参
数 ,结果见图 1和表 3.
图 1　3种培养方式的蛋白核小球藻生长曲线
表 3　蛋白核小球藻在 3种培养
方式下的生长参数
培养方式 最高生物量细胞干重/(g·L -1) 出现时间/ d μ/ d
-1
自养 0.4 4 0.13
异养 19.8 6 0.76
混养 20.9 6 0.81
注:μ=最大比生长速率
　　由图 1和表 3可知 ,蛋白核小球藻在自养条
件下生长极其缓慢 ,生物量增长不明显;而进行异
养和混养生长时生物量提高很快 ,异养和混养培
养的小球藻的最高生物量远大于自养时的最高生
物量 ,比生长速率分别是自养时的 5.8 倍和 6.2
倍;并且混养生长的速度比异养生长则更快一些.
2.2　以 3种培养方式获得的藻细胞成分的比较
由3种培养方式培养蛋白核小球藻 ,获得干
藻粉 ,并测定细胞的主要成分 ,结果见表 4.
表 4　3种培养方式藻细胞成分的比较(干藻粉)
细胞成分 自养 异养 混养
水分/ % 8.7 8.7 8.7
粗蛋白/ % 51.75 28.85 45.63
粗脂肪/ % 18.81 38.66 27.65
粗灰分/ % 7.80 8.74 7.15
碳水化合物/ % 12.94 15.05 10.87
抗坏血酸/(μg·g -1) 134.7 244.9 265.7
总叶绿素/(mg·g -1) 28.61 13.82 24.79
叶黄素/(mg·g -1) 3.87 2.81 3.34
　　由表 4可见 ,蛋白核小球藻具有很高的蛋白
质含量 ,而蛋白质含量与其生长方式和生长条件
有很大关系.自养方式得到的藻细胞蛋白质含量
最高 ,占到细胞干重的 50%以上 ,但自养生长生
物量极低 ,蛋白质的总产量就很低;混养方式得到
的细胞蛋白质含量也比较高 ,但混养方式需要添
置光照设施 ,造价很高;而异养方式得到的细胞蛋
白质含量则低得多 ,只有自养的 56%,导致这种
差异的原因在于异养(无光照)生长小球藻的代谢
方式和途径与自养生长 、混养生长(有光照)相比
发生了很大的改变.从营养学角度来看 ,具有高蛋
白含量并不等于具有高营养性 ,还应具有平衡的
必需氨基酸.杨鹭生等[ 8] 分析了蛋白核小球藻
(C.pyrenoidosa)的氨基酸组成 ,计算出其蛋白质
必需氨基酸指数为 64.3.小球藻蛋白质的必需氨
基酸指数处于面粉 、玉米和花生仁等植物蛋白质
这一等级.
蛋白核小球藻在不同的生长方式下脂肪含量
的差异也较大.异养细胞的粗脂肪含量是自养的
一倍多 ,混养处于两者之间.3种生长方式获得的
蛋白核小球藻细胞碳水化合物和粗灰分的含量差
异并不大.异养和混养藻细胞抗坏血酸含量较高 ,
自养细胞最低 ,只有混养细胞的 51%.细胞叶绿
素含量以自养为最高 ,混养其次 ,异养最低.
3　讨论
现在国内外小球藻生产中使用较多的是开放
式或封闭式池塘培养系统(即自养方式),这种培
养系统造价和运转费用较低 ,但最大的问题在于
细胞浓度太低(通常干重<1 g/L),从而造成细胞
收获和后加工成本很高 ,而且还存在培养液容易
污染 、培养条件不易控制 、产品质量不稳定等缺
点.小球藻能够进行高细胞浓度异养培养 ,为扩大
其生产规模开辟了广阔的前景.异养培养的优点
在于:可以借用发酵企业现有的厂房和设备 ,扩展
了生产的通用性;不需要光照辅助设备 ,降低了成
本;发酵罐 、管道系统和培养基很容易灭菌 ,可以
有效防止污染;受环境因素影响的程度小 ,培养条
件容易控制;微生物发酵中的流加培养技术 、连续
培养技术均可用于小球藻的异养培养 ,大大提高
产量.
不过 ,本项研究的结果表明 ,小球藻的异养生
长速度和细胞浓度均低于在光照和有机质同时存
在时的混养培养 ,并且其异养代谢产物同自养代
54　 河南工业大学学报(自然科学版) 第 26卷
谢和混养代谢有很大差异.要解决这个问题 ,一般
认为可采取以下方式:(1)采用混养培养方式.但
那样需要在发酵罐中安装光照设备 ,投资和运转
费用将会大大增加 ,而且在设备设计和制造上有
很大的困难.是否采用这种方式主要取决于产物
的价值和成本之间的比较.(2)采用两步法的培养
方式:第一步用异养培养系统获得高细胞浓度的
培养液 ,第二步将培养液曝露在光照条件下 ,完成
细胞的光合代谢过程.由于此时细胞密度很大 ,光
线穿透率很低 ,应将发酵罐与透明玻璃钢制成的
螺旋式盘管相连 ,构成封闭的培养体系.培养液在
透明管道和发酵罐之间循环 ,同时管道曝露于光
照之中(自然光或人造光源)[ 9] ,这样就可以提高
小球藻色素(叶绿素 、叶黄素等)的含量 ,使最终产
品的颜色同在开放式池塘培养系统中获得的产品
颜色相近 ,在生产依赖于光照的产物时可考虑这
种方法.
参考文献:
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COMPARISON OF THE DIFFERENT CULTIVATION SYSTEMS
FOR CHLORELLA PYRENOIDOSA
GUI Lin
1 , SHI Xian-ming2 , LI Lin1 , HU Song-qing1 , LIU Guo-qin1
(1.College of Light Industry and Food Technology , South China University of Technology ,
Guangzhou 510640 , China;2.Department of Food Science and Technology ,
Shanghai Jiaotong University , Shanghai 201101 , China)
Abstract:Chlorella pyrenoidosa 15 2070 was cultivated in three culture systems , from which the maximal biomass
concentrations(dry weight)and the specific growth rates were obtained.The chemical compositions of C.pyrenoi-
dosa cells from three culture systems were determined and their differences were compared.
Key words:Chlorella pyrenoidosa;autotrophy;heterotrophy;mixotrophy
第 5期 桂林等:蛋白核小球藻不同培养方式的比较 55