全 文 ：收稿日期:2011 － 12 － 20;修回日期:2012 － 04 － 10
基金项目:西北师范大学青年教师科研能力提升计划项目
(NWNU － LKQN －10 － 30) ;西北师范大学学生学术科研项
目资助
作者简介:曹 海(1991) ，男，生物技术专业本科生，主要研
究方向为微藻培养技术(E-mail)caohai230@ 163． com。
通信作者:孔维宝，副教授，博士(E-mail)kwbao@ 163． com。
综合利用
利用啤酒废水培养普通小球藻生产微藻生物质和油脂
曹 海，张馨允，孔维宝，杨 红，杨 琪，王科荣
(西北师范大学 生命科学学院，兰州 730070)
摘要:研究了普通小球藻在未处理啤酒废水及改良啤酒废水中的生长及积累油脂特性，并优化了改
良啤酒废水培养小球藻的营养盐组成。优化得到适于培养小球藻生产微藻生物质和积累油脂的改
良啤酒废水培养基组成为:在未经处理的啤酒废水中添加 KNO3 0． 50 g /L、MgSO4 0． 75 g /L、
Na2HPO4 0． 75 g /L，调整 pH至 8． 0。在此培养基中小球藻细胞质量浓度达 0． 94 g /L，为对照组的
2． 69 倍;体积油脂产率达 11． 84 mg /(L·d) ，为对照组的 1． 97 倍。研究表明，利用改良的啤酒废
水培养小球藻可同时实现有机废水的资源化利用与降低微藻培养成本的双重目的，具有潜在的应
用前景。
关键词:普通小球藻;啤酒废水;微藻;生物质;油脂
中图分类号:TS222;Q949． 2 文献标志码:A 文章编号:1003 － 7969(2012)09 － 0065 － 05
Cultivation of Chlorella vulgaris in brewery wastewater for production
of microalgal biomass and lipid
CAO Hai，ZHANG Xinyun，KONG Weibao，YANG Hong，YANG Qi，WANG Kerong
(College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China)
Abstract:The growth characteristics and lipid accumulation of Chlorella vulgaris in crude and modified
brewery wastewater(BWW)were investigated． Furthermore，the modified BWW medium components were
optimized． The results indicated that the optimized components of modified BWW medium for biomass
production and lipid accumulation were that KNO3(0． 50 g /L) ，MgSO4(0． 75 g /L)and Na2HPO4
(0． 75 g /L)were added in crude BWW and the pH value was adjusted to 8． 0． The biomass content of
0． 94 g /L(2． 69 － fold compared with control)and the lipid productivity of 11． 84 mg /(L·d) (1． 97 －
fold compared with control)were obtained in the modified BWW medium． The study suggested that culti-
vation of Chlorella vulgaris with organic wastewater exhibited potential application prospect since it could
couple the resource utilization of organic wastewater and cost reduction of algae cultivation．
Key words:Chlorella vulgaris;brewery wastewater;microalgae;biomass;lipid
微藻具有生长快速、培养周期短、光合效率高等
特点，每年固定的 CO2 约占全球净光合产量的
40%［1］，是目前所知的唯一可能替代化石能源的原
料［2］。同时，微藻生长过程中会吸收大量的氮、磷
等元素作为营养物质供细胞生化组分的合成，既可
生产有效生物质，又可用来处理工农业生产废
水［3］。因此，基于光合作用，微藻细胞可以用来去
除废水中的氮、磷和其他有机化合物，并以有机物的
形式将其储存在细胞中。其中，可作为生物柴油原
料的油脂为微藻细胞内主要的贮藏物质之一。
当前，利用微藻生产生物质能源和去除废水中
氮、磷的研究均得到了广泛的重视。但是，将二者结
合起来的研究报道较少［4 － 5］。将微藻培养和废水处
理技术结合起来，可实现微藻培养基的低成本化、废
水中有机质的资源化利用、微藻生物质生产和水资
562012 年第 37 卷第 9 期 中 国 油 脂
源循环利用多重目的的耦合［6］。因此，针对目前微
藻培养过程中养殖成本高、水体富营养化和水资源
短缺问题，选择具有排放量大、无毒、有机化合物含
量高、可生化性强等特点的啤酒废水(BWW)为主
要培养基质［7 － 8］，利用普通小球藻(Chlorella vulgar-
is)的混合营养特性，探索利用 BWW 低成本培养普
通小球藻和 BWW 生物处理的技术，实现微藻生物
质生产与废水资源化利用的技术耦合。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
实验用普通小球藻(Chlorella vulgaris － 31#)购
自中科院水生生物研究所淡水藻种库。藻种基础培
养基为土壤浸出液培养基(SoilEM)。啤酒生产废
水取自华润雪花啤酒(甘肃)有限公司。
KNO3、Na2HPO4、MgSO4、NaOH、HCl、正己烷等，
均为分析纯试剂。
TDL －5000B 低温冷冻离心机，LDZX － 40BI 型
立式自动电热压力蒸汽灭菌器，分析天平，恒温光照
摇床，日立 UV － 1800 紫外可见分光光度计，GY92 －
2D超声波细胞破碎仪，电热烘箱，冷冻干燥机。
1． 2 实验设计
首先将培养至对数期的小球藻种子培养液接种
于经灭菌处理的 BWW 原液中进行培养，通过测定
小球藻细胞生长曲线，分析其生长特性。然后根据
BWW的组成特性，进行外加营养盐(尿素或 KNO3、
MgSO4、Na2HPO4)的单因素实验，再通过正交实验
优化 BWW中小球藻的生物量生产和产油条件。最
后，在优化条件下分析小球藻在改良 BWW 培养基
中的生长特性和产油特性。
1． 3 小球藻培养方法
根据各个实验方案配制培养基，经适当调节 pH
等处理后在 121℃高压灭菌 20 min。无菌条件下吸
取对数生长期的藻种液 10 mL 接入 100 mL 的培养
液中，摇匀后将接入小球藻的锥形瓶置于恒温光照
摇床中培养，平均光强度为 2 500 lx，温度为(25 ±
1)℃，光周期为 12 光、12 暗，培养 6 d。
1． 4 小球藻细胞质量浓度的测定方法
取 4 mL培养液置于已预先烘干称重的 5 mL离
心管中，3 000 r /min离心 10 min后，弃去上清液，加
4 mL蒸馏水，振荡重新悬浮，再次离心，弃去上清
液，以上过程重复 2 次。将离心管敞口放入烘箱中，
80℃下烘至恒重，取出置于干燥器中，待冷却至室
温后测定管重。以 3 次重复测定的平均值计为小球
藻细胞质量浓度(g /L)。
1． 5 小球藻油脂含量的测定方法
将萃取油脂的具塞玻璃试管清洗烘干后称重
(m0) ，取适量经冷冻干燥的藻粉并研磨破壁成细粉
后置于已称重的萃取试管中一同称重(m1) ，加入
5 mL正己烷在 50℃水浴中浸提油脂 5 次，每次 1 h，
每次浸提后在 3 000 r /min下离心 10 min，收集上清
液，蒸发去除溶剂后即得粗油脂;同时将含离心沉淀
藻渣的试管在 70℃烘箱中烘干至恒重，冷却至室温
后称重(m2) ，按公式计算粗油脂含量。
油脂含量 =(m1 － m2)/(m1 －m0)× 100%
2 结果与讨论
2． 1 未处理 BWW中小球藻的生长特性
将小球藻接种于经灭菌处理的 BWW 原液中连
续培养 6 d，每天测定小球藻细胞质量浓度。随着培
养时间的延长，小球藻细胞质量浓度先增加后达到
稳定，接种 3 d 后，小球藻细胞质量浓度达最大值
(0． 42 g /L) ，之后由于 BWW中的营养物质匮乏，导
致细胞质量浓度略有下降，且小球藻细胞颜色发黄，
培养结束时，小球藻细胞质量浓度为 0． 35 g /L。
2． 2 BWW 中外加营养盐对小球藻细胞质量浓度
和油脂含量的影响
2． 2． 1 KNO3 质量浓度的影响
BWW中添加 KNO3，质量浓度分别设为 0． 25、
0． 50、0． 75 g /L和 1． 0 g /L，接种后培养 6 d，分别测
定小球藻细胞质量浓度和油脂含量，结果如图 1
所示。
图 1 KNO3 质量浓度对小球藻细胞质量浓度和
油脂含量的影响
由图 1 可见，在一定质量浓度范围内，随着
KNO3 质量浓度的增加小球藻细胞质量浓度显著增
加，当 KNO3 的质量浓度为 0． 50 g /L 时，小球藻细
胞质量浓度达最大值为 1． 03 g /L，是对照组的 1． 50
倍;当质量浓度高于 0． 50 g /L 时，小球藻细胞质量
浓度呈下降趋势;而油脂的含量与 KNO3 的质量浓
度呈现负相关，油脂含量随 KNO3 的质量浓度的增
加而不断降低。说明 BWW 中添加一定量的 KNO3
有利于小球藻的生长和生物质的积累，但对油脂的
合成有抑制作用。王立柱等［9］的研究表明，在高氮
66 CHINA OILS AND FATS 2012 Vol. 37 No. 9
源条件下有利于小球藻生物量的合成但油脂的含量
低，本研究得到相同的结论。
2． 2． 2 MgSO4 质量浓度的影响
图 2 为 BWW中添加不同质量浓度 MgSO4 对小
球藻细胞质量浓度和油脂含量的影响。
图 2 MgSO4 质量浓度对小球藻细胞质量浓度和
油脂含量的影响
由图 2 可见，随着 BWW 培养基中 MgSO4 质量
浓度的增加，小球藻细胞质量浓度先增后减，当
MgSO4质量浓度为 0． 75 g /L 时，小球藻细胞质量浓
度达到最大值为 0． 94 g /L，是对照组的 1． 36 倍，说
明在 BWW原液中添加一定量的 MgSO4 可促进小球
藻的生长。但是随着 BWW中MgSO4 质量浓度的增
加，油脂含量先增后减。当 MgSO4 质量浓度为 0． 25
g /L时，油脂含量达 16． 31%，说明添加一定量的
MgSO4有利于油脂的积累，但当 MgSO4 质量浓度过
高时，反而不利于油脂的合成。
2． 2． 3 Na2HPO4 质量浓度的影响
图 3 为 BWW中添加不同质量浓度 Na2HPO4 对
小球藻细胞质量浓度和油脂含量的影响。
图 3 Na2HPO4 质量浓度对小球藻细胞质量浓度和
油脂含量的影响
由图 3 可见，BWW 中添加不同质量浓度
Na2HPO4 培养小球藻，当 Na2HPO4 的质量浓度在
0 ～ 0． 75 g /L范围内时，Na2HPO4 质量浓度的提高，
有利于小球藻的生长，Na2HPO4 的质量浓度为
0． 75 g /L时，小球藻细胞质量浓度达 1． 13 g /L，明
显高于对照组(0． 88 g /L) ，但当 Na2HPO4 质量浓度
高于 0． 75 g /L 时，小球藻细胞质量浓度有下降趋
势。小球藻细胞中油脂的含量随着 Na2HPO4 质量
浓度的增大，油脂含量呈不断上升的趋势，当
Na2HPO4 质量浓度为 1． 0 g /L 时，油脂含量达
15． 85%。由 此 可 见，BWW 中 添 加 一 定 量 的
Na2HPO4 不仅有利于小球藻的生长，而且能显著提
高小球藻细胞中油脂的含量。
2． 3 初始 pH 对小球藻细胞质量浓度和油脂含量
的影响
为了确定小球藻在 BWW中生长和油脂积累的
最适 pH，将培养液的初始 pH 分别调至 6． 0、6． 5、
7． 0、7． 5 和 8． 0，接种小球藻培养 6 d 后测定其小球
藻细胞质量浓度和油脂含量，结果如图 4 所示。
图 4 初始 pH对小球藻细胞质量浓度和油脂含量的影响
由图 4 可知，当 pH小于 7． 5 时，小球藻细胞质
量浓度随 pH 的升高而升高，当 pH 为 7． 5 时，质量
浓度达最大值(0． 88 g /L) ，当 pH 高于 7． 5 时，对其
生长有抑制作用。结果表明小球藻在 BWW 中生长
的最适 pH 为 7． 5。小球藻细胞中油脂含量随 pH
的增大而不断提高，由于 BWW 的初始 pH 一般为
6． 8 ～ 7． 5，因此利用 BWW培养小球藻时，需适当地
提高 BWW 的 pH，以利于小球藻的生长和油脂的
合成。
2． 4 正交实验优化 BWW培养基
通过 BWW中添加不同质量浓度营养盐的单因
素实验和 BWW不同初始 pH实验，发现单独添加一
种营养盐对小球藻的生长和油脂积累的影响各有优
劣，并不能完全满足小球藻的生长要求。因此，在此
基础上设计了四因素三水平正交实验，以期确定适
合小球藻生长和小球藻油脂合成的最佳培养基组
成。正交实验设计见表 1。
表 1 正交实验设计
水平
A KNO3 /
(g /L)
B MgSO4 /
(g /L)
C Na2HPO4 /
(g /L)
D pH
1 0． 25 0． 25 0． 25 6
2 0． 50 0． 50 0． 50 7
3 0． 75 0． 75 0． 75 8
在设计的条件接种培养 6 d 后，测定小球藻细
胞质量浓度和油脂含量，实验结果见表 2。由表 2
762012 年第 37 卷第 9 期 中 国 油 脂
结果分析可知，利于小球藻生长的 3 种外加营养盐
的最佳质量浓度和废水的初始 pH 分别为 KNO3
0． 50 g /L，MgSO4 0． 75 g /L，Na2HPO4 0． 75 g /L，pH
8． 0;适于油脂积累的营养盐的最佳质量浓度和废水
的初始 pH 分别为:KNO3 0． 25 g /L，MgSO4 0． 75 g /
L，Na2HPO4 0． 75 g /L，pH 8． 0。
表 2 正交实验结果
实验
号
A B C D 细胞质量
浓度 /(g /L)
油脂含
量 /%
1 1 1 1 1 0． 61 6． 92
2 1 2 2 2 0． 85 7． 17
3 1 3 3 3 1． 17 9． 39
4 2 1 2 3 0． 93 8． 52
5 2 2 3 1 0． 90 7． 03
6 2 3 1 2 0． 92 6． 28
7 3 1 3 2 0． 99 5． 51
8 3 2 1 3 0． 94 6． 15
9 3 3 2 1 0． 79 5． 86
细胞质量浓度
k1 0． 877 0． 843 0． 823 0． 767
k2 0． 917 0． 897 0． 857 0． 920
k3 0． 907 0． 960 1． 020 1． 013
R 0． 040 0． 117 0． 197 0． 246
油脂含量
k1 7． 827 6． 983 6． 450 6． 603
k2 7． 277 6． 783 7． 183 6． 320
k3 5． 840 7． 177 7． 310 8． 020
R 1． 987 0． 394 0． 860 1． 700
对正交实验结果运用统计学方法分别对影响小
球藻细胞质量浓度和油脂含量的 4 个因素进行方差
分析，如表 3、表 4 所示。
表 3 细胞质量浓度方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P
A 0． 002 2 0． 001 01． 000 P ＞ 0． 05
B 0． 013 2 0． 006 08． 693 P ＞ 0． 05
C 0． 042 2 0． 021 28． 442 P ＜ 0． 05*
D 0． 057 2 0． 029 38． 820 P ＜ 0． 05*
表 4 油脂含量方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P
A 6． 353 2 3． 177 27． 570 P ＜ 0． 05*
B 0． 230 2 0． 115 01． 00 P ＞ 0． 05
C 1． 294 2 0． 647 05． 615 P ＞ 0． 05
D 4． 964 2 2． 482 21． 540 P ＜ 0． 05*
由表 3、表 4 可知，在设定的外加营养盐质量浓
度范围内，KNO3、MgSO4 对小球藻生长的影响不显
著，Na2HPO4 和 pH对其影响显著;KNO3 和 pH对小
球藻油脂积累的影响显著，而 Na2HPO4 和 MgSO4 对
其影响不显著。
综合考虑上述实验结果以及过多添加营养盐为
去除废水 COD造成的负荷，确定了适于培养小球藻
生长的 BWW 改良培养基组成为:KNO3 0． 50 g /L，
MgSO4 0． 75 g /L，Na2HPO4 0． 75 g /L，pH 8． 0;利于油
脂积累的 BWW 改良培养基组成为:KNO3 0． 25 g /
L，MgSO4 0． 75 g /L，Na2HPO4 0． 75 g /L，pH 8． 0。
2． 5 改良 BWW中小球藻的生长与产油特性
在上述研究基础之上，以未处理的 BWW 为对
照组，考察了经正交实验优化的 BWW 培养基中小
球藻的生长状况和产油特性。图 5 为不同改良
BWW培养基中小球藻的生长曲线。
图 5 不同改良 BWW培养基中小球藻的生长曲线
由图 5 可知，对照组小球藻生长缓慢，培养 3 d
后小球藻细胞质量浓度达最大值为 0． 42 g /L，相比
之下，改良的 BWW 培养基中小球藻的生长明显优
于对照组，培养 6 d 后小球藻细胞仍表现出良好的
增长趋势，且用于生产小球藻生物质的改良 BWW
培养基与用于生产油脂的改良 BWW 培养基相比，
更有利于小球藻的生长。
表 5 为不同改良 BWW培养基中小球藻的产油
特性。由表 5 可知，对照组中油脂含量为 10． 32%，
但小球藻细胞质量浓度仅为 0． 35 g /L;用于生产油
脂的改良的 BWW培养基和用于生产生物质的改良
BWW 培养基中培养小球藻的油脂含量分别为
8． 49%、7． 56%，反而低于对照组中油脂的含量，但
是小球藻细胞质量浓度远高于对照组，分别
为 0． 84、0． 94 g /L。出现上述结果的原因可能是因
为对照组中氮源缺乏，抑制了小球藻生物量的合成，
却有利于油脂的合成;改良的 BWW 培养基中添加
的氮源促进了小球藻细胞的生长，但抑制了积累
油脂。
从小球藻细胞的质量油脂产率分析可知，用未
经处理的 BWW直接培养的小球藻细胞因油脂含量
较高而获得了最大的质量油脂产率(17． 20 mg /
(g·d) ) ，但是 BWW 原液中的小球藻细胞质量浓
86 CHINA OILS AND FATS 2012 Vol. 37 No. 9
度较低。从培养液的体积油脂产率分析，两种改良
的 BWW 培养基中均获得了较对照组(6． 02 mg /
(L·d) )高的体积油脂产率(11． 84、11． 89 mg /
(L·d) ) ，而改良培养基中小球藻体积油脂产率的
差异性不显著。因此，用于生产生物质的改良
BWW可用于小球藻生物质和油脂的生产。
表 5 不同改良 BWW培养基中小球藻的产油特性
废水类型
小球藻细胞质量
浓度 /(g /L)
油脂含量 /
%
质量油脂产率 /
(mg /(g·d) )
体积油脂产率 /
(mg /(L·d) )
未处理 BWW 0． 35 10． 32 17． 20 6． 02
用于生产生物质的改良 BWW 0． 94 07． 56 12． 60 11． 84
用于生产油脂的改良 BWW 0． 84 08． 49 14． 15 11． 89
3 结 论
(1)BWW中添加一定量的氮源有利于小球藻
的生长和生物质的积累，但高氮源条件对油脂的合
成有抑制作用;BWW 中添加适量的磷源，对小球藻
生物质的积累和油脂合成都有一定的促进作用。
BWW培养液的 pH 对小球藻的生长和油脂积累影
响显著。
(2)通过正交实验，综合分析优化得到适于培
养小球藻生产生物质和合成油脂的改良 BWW 培养
基为:在未经处理的 BWW 原液中添加 KNO3
0． 50 g /L，MgSO4 0． 75 g /L，Na2HPO4 0． 75 g /L，调整
pH至 8． 0。在此培养基中小球藻细胞质量浓度达
0． 94 g /L，为对照组的 2． 69 倍;体积油脂产率达
11． 84 mg /(L·d) ，为对照组的 1． 97 倍。
(3)利用改良的 BWW 培养微藻具有工业化应
用潜力，此举可同时实现有机废水的资源化利用与
微藻的低成本培养。
参考文献:
［1］ANITHAN B，ROHIT S，YUSUF C，et al． Botryococcus brau-
nii:a renewable source of hydrocarbons and other chemicals
［J］． Critical Reviews in Biotechnology，2002，22(3) :
245 － 279．
［2］VASUDEVAN P T，BRIGGS M． Biodiesel production—cur-
rent state of the art and challenges［J］． Journal of Industri-
al Microbiology and Biotechnology，2008，35 (5 ) :
421 － 430．
［3］HILTON J，O’HARE M，MICHAEL J，et al． How green is
my river?A new paradigm of eutrophication in rivers［J］．
Science of the Total Environment，2006，365 (1 /2 /3) :
66 － 83．
［4］郑爱榕，赵立清，詹力扬，等． 利用啤酒废水养殖螺旋藻
研究［J］． 海洋科学，2004，28(7) :26 － 31．
［5］曲春波，史贤明． 利用啤酒废水小球藻异养培养［J］．
微生物学报，2009，49(6) :780 － 785．
［6］胡洪营，李鑫，杨佳． 基于微藻细胞培养的水质深度净
化与高价值生物质生产耦合技术［J］． 生态环境学报，
2009，18(3) :1122 － 1127．
［7］WANG S G，LIU X W，GONG W X，et al． Aerobic granula-
tion with brewery wastewater in a sequencing batch reactor
［J］． Bioresource Technology，2007，98(11) :2142 － 2147．
［8］PARAWIRA W，KUDITA I，NYANDOROH M G，et al． A
study of industrial anaerobic treatment of opaque beer brew-
ery wastewater in a tropical climate using a full － scale
UASB reactor seeded with activated sludge ［J］． Process
Biochemistry，2005，40(2) :593 － 599．
［9］王立柱，温皓程，邹渝，等． 产油微藻的分离、筛选及自
养培养氮源、碳源的优化［J］． 微生物学通报，2010，37
(3) :336 － 341．
·广告·
962012 年第 37 卷第 9 期 中 国 油 脂