全 文 ：　＊基金项目:国家自然科学基金资助项目(30472167);河北省自
然科学基金资助课题(200500072)
收稿日期:2006-07-18;修回日期:2007-08-31
作者简介:李娟娟(1980-), 女 , 硕士 , 主要从事心血管分子生
物学研究。■通讯作者 , E-mai l:w jk@hebmu.edu.cn
旋覆花素抑制血管内皮损伤诱导的基质
重构酶表达与活化＊
李娟娟 , 温进坤■ , 韩　梅
(河北医科大学基础医学研究所 , 河北省医学生物技术重点实验室 , 河北 石家庄 050017)
摘要　目的:观察旋覆花素对大鼠血管球囊损伤后内膜增生和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及组织金属蛋白酶抑制
剂-2(T IMP-2)表达的影响 , 探讨旋覆花素防治血管再狭窄的可能作用和机制。方法:用球囊内皮剥脱法复制血管
内膜增生模型;通过 HE 染色观察血管壁形态学变化;明胶酶图分析 MMP-2 的活性改变;Western blot 和免疫组
织化学检测 MMP-2 和 T IMP-2 的表达变化。结果:旋覆花素显著减轻血管损伤后内膜增生 , 抑制 MMP-2 的蛋白
水解活性 ,降低 MMP-2 和 T IMP-2 的表达以及 MMP-2/ T IMP-2 比值 , 并使其接近正常水平。结论:旋覆花素对球
囊血管损伤后内膜增生的抑制作用与其对 MMP-2/ T IMP-2 系统平衡调节有关。
关键词:　基质金属蛋白酶-2;　组织金属蛋白酶抑制剂-2;　旋覆花素;　血管再狭窄
中图分类号:R543.1;Q556 文献标识码:A 文章编号:1000-6834(2008)02-156-05
　　经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄的病理机制
和防治是目前心血管疾病领域的一个研究热点 ,许多
学者认为再狭窄的发生是一个非感染性炎症反应过
程[ 1] 。参与调节血管壁细胞外基质代谢的基质金属
蛋白-2(matrix metalloproteinase-2 , MMP-2)和其内源
性抑制剂组织金属蛋白酶抑制剂-2(tissue inhibitors of
metalloproteinase-2 , TIMP-2)在此过程中起重要作
用[ 2] 。旋覆花素(Inulicin)是旋覆花的氯仿提取物 ,其
中的主要有效成分为旋覆花内酯(1-o-acetylbritan-
nilactone , ABL)及不同酰化水平的同系物。基于其具
有抗炎活性[ 3] ,本实验通过球囊内皮剥脱术复制大鼠
血管内膜增生模型 ,观察了旋覆花素对新生内膜形成
和MMP-2及其抑制剂表达的影响 ,以探讨旋覆花素
防治血管再狭窄的作用和机制。
1　材料与方法
1.1　主要试剂 、仪器
旋覆花素(含 ABL 2.67 mg/ml)由本校药学院
分离及鉴定 。雄性 SD 大鼠由河北省实验动物中心
提供。小鼠抗人 MMP-2 单克隆抗体 、兔抗人
TIMP-2 多克隆抗体及发光试剂购自 Santa Cruz 公
司。明胶购自 Sigma 公司 。免疫组化染色 H-SP 试
剂盒为北京中山公司产品。2F 球囊导管购自 Bax-
ter Healthcare 公司 。 ID 数码成像分析系统为 Ko-
dak 公司产品 。其余试剂为进口或国产分析纯 。
1.2　动物模型的复制及分组
选用雄性 SD大鼠 15 只 ,体重 0.3 ～ 0.35 kg ,
随机分为 3 组(n=5)。对照组 ,不做任何处理;模
型组 ,行球囊导管内皮剥脱术;治疗组 ,术前 3 d至
术后 14 d灌胃服用旋覆花素 ,剂量为 26 mg.kg-1·
d
-1 。参照文献[ 4]报道的方法 ,后两组实验动物用
25 %乌拉坦(3 ml/kg)腹腔注射麻醉 ,于颈总动脉
远端剪一楔形切口 ,球囊导管自切口处经颈总动脉
到达腹主动脉远心端 。注入约 0.1 ml生理盐水充
盈球囊 ,然后将球囊拖回到胸主动脉起始部 。其间
以导丝为轴线旋转球囊 。如此反复三次以确保血管
内皮充分剥脱。退出球囊 ,结扎颈总动脉 。于术后
21 d处死动物 。
1.3　病理形态学观察
经股动脉放血后 ,打开腹腔 ,取腹主动脉中段 1
cm 左右置冷 PBS 中洗净残留血液 ,放入 10 %福尔
马林/PBS 中固定至少 24 h ,乙醇梯度脱水 ,低温石
蜡垂直定向包埋 , 5 μm 厚度切片 , 常规 HE 染色。
并于光镜下观察 、照相 、进行图像学分析 ,计算内膜
厚度 、中膜厚度和内膜/中膜厚度之比(I/M)。
1.4　蛋白提取液的制备
取损伤部位血管 , 用生理盐水洗净后 , 按 100
mg 组织加入 1 ml提取液(150 mmol·L-1NaCl , 50
mmol·L-1 Tris-HCl , pH 7.8 , 0.1% NP-40 , 0.5%
脱氧胆酸钠 ,0.1%SDS , 0.1%EDTA)匀浆 。冰浴
反应30 min;4 ℃, 8 000 r/min离心 10 min ,取上清
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DOI :10.13459/j.cnki.cjap.2008.02.009
用改良酚试剂法测定提取液的蛋白含量 。
1.5　明胶酶图分析
用含明胶的 SDS-PAGE 检测 MMP-2 活性 , 分
离胶浓度为 8%(含 0.2%明胶), 浓缩胶为 5%。
取各组血管组织提取液(各含 30 μg 蛋白), 进行非
还原 SDS-PAGE。电泳结束后 , 凝胶经 2.5% Tri-
ton X-100漂洗 2 次 , 每次 30 min , 使酶蛋白复性 ,
随后加入反应缓冲液(50 mmol·L-1 Tris-HCl , 50
mmol·L-1 NaCl , 10 mmol·L-1 CaCl2), 37 ℃温育 9
h , 0.5%考马斯亮蓝染色 1.5 ～ 2 h ,脱色液(10%
乙酸 , 40%甲醇)脱色至蓝色背景下白色条带清
晰。用凝胶成像分析系统对凝胶中明胶降解所形成
的透明区带进行相对定量分析 ,以透明区带的相对
灰度值表示酶的活性 。
1.6　Western 印迹分析
各组均取含 100 μg 蛋白的血管组织提取液 ,经
12 %SDS-PAGE分离后 ,通过电转移将蛋白印迹至
PVDF 膜上 ,用 5%脱脂奶粉封闭膜上非特异性结合
位点 ,继之分别与抗MMP-2抗体(1∶300)、抗 TIMP-2
抗体(1∶300)室温反应 5 h ,洗膜3 次。随后加入辣根
过氧化物酶标记的二抗(1∶10000)室温反应 2 h ,用化
学发光法进行检测。显影条带经凝胶图像分析系统
进行定量分析 , 并以 GAPDH 为内参照。
1.7　免疫组织化学染色
采用 SABC 法进行免疫组织化学染色。血管组
织切片常规脱蜡 , 3%过氧化氢孵育 5 min ,抗原微
波修复 10 min。随后分别加入 1∶100 稀释的抗
MMP-2 和 TIMP-2 抗体 ,其余过程按试剂盒说明书
进行。镜下观察相关抗原的表达变化 ,以细胞内出
现棕黄色颗粒为阳性信号 。
1.8　统计学处理
实验结果采用均数±标准差( x ±s)表示 ,组间
资料应用单因素方差(One way ANOVA)分析 ,各项
统计均用 SPSS 10.0 软件在计算机上完成。
2　结果
2.1　病理形态学改变
对照组大鼠主动脉壁各层结构完整 ,内膜光滑 ,
中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells ,
VSMCs)排列整齐 。模型组 ,内膜呈弥漫性增厚 ,管
腔变小 ,增厚的内膜中以细胞成分为主 ,中膜细胞排
列完整 。给予旋覆花素治疗组 ,血管内膜增生明显
被抑制(图 1A)。形态测量分析表明(图 1B 、C),与
对照组相比 ,模型组的血管内膜增生明显 ,血管内膜
厚度和内膜/中膜厚度(I/M)比值显著升高(P <
0.05);旋覆花素治疗组 ,上述指标均有不同程度的
降低 ,与模型组比较具有显著差异(P <0.05)。以
上统计结果表明 ,旋覆花素能够明显抑制大鼠血管
内皮剥脱诱导的新生内膜增生。
Fig.1 　I nhibition of inucilin on neointimal proliferation after
balloon injury in rat aorta( x ±s , n =5)
A:HE staining of rat aorta section(×40);B:Value of in-
tima and medial thickness;C:Ratio of intima and medial
thickness
＊P <0.05 vs control;#P <0.05 vs mo ldel
2.2　MMP-2活性变化
MMP-2 是水解血管细胞外基质的主要酶类。
明胶酶图结果显示(图 2A),在分子量为 64 kD 的位
置上形成一条透明区带 ,表明本实验检测的明胶酶
主要为 MMP-2的活性形式 。将酶图结果进行图像
分析发现(图 2B),模型组中 MMP-2(64 kD)活性较
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对照组显著升高 ,而旋覆花素治疗组 MMP-2(64
kD)活性明显降低(P <0.05),约为模型组的 38.5
%,且与对照组相比无明显差别 。这说明该药物具
有减缓基质降解活性的作用。
Fig.2　Effect of inucilin on MMP-2 activity in rat arota after
balloon injury( x±s , n=5)
A:Gelatin zymog ram analy sis fo r MMP-2;B:Densitomet-
ric scanning
＊P <0.05 vs control;#P <0.05 vs model
2.3　MMP-2及 TIMP-2水平的变化
Western blot 结果显示 ,在对照组 、治疗组和模
型组的血管壁中 , 72 kD 的MMP-2 酶原(pro-MMP-
2 ,)水平无显著差别。但模型组中 , 64 kD 的活性型
MMP-2(active MMP-2)和 TIMP-2水平以及二者比
值明显高于对照组(P <0.05),治疗组上述指标均
显著降低 , 分别为模型组的 39.7%、67.2%和
59.1%,并接近至对照组水平(图 3)。这说明旋覆
花素对 MMP-2酶原(72 kD)的表达无影响 ,但可抑
制损伤诱导的 MMP-2 活化 、TIM P-2 的表达 ,使二
者比值恢复至正常状态 。
免疫组织化学结果显示 ,正常组血管内膜和中
膜处均可见少量散在分布的 MMP-2 和 TIMP-2 的
阳性染色颗粒;模型组中 ,MMP-2 和 TIM P-2 主要
在新生内膜中表达 ,胞浆和基质内出现大量 MMP-2
和 T IM P-2 特异性的阳性颗粒;治疗组的新生内膜
中 ,MMP-2和 TIM P-2特异性的阳性颗粒与模型组
相比显著减少(图 4)。该结果与明胶酶图和 West-
ern blot 分析结果相一致。
Fig.3　Effect o f inucilin on MMP-2 and T IMP-2 expression in rat arota af ter balloon injury( x±s , n=5)
A:Western blo t analysis for MMP-2 and T IMP-2;B:Densitome tric scanning fo r mmP-2;C:Densitometric scanning fo r
T IMP-2;D:Ratio of MMP-2/ T IMP-2
＊P <0.05 vs control;#P <0.05 vs model
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Fig.4　Immunohistochemistry for MMP-2 and T IMP-2 in rat arota after balloon injury(×40)
3　讨论
血管再狭窄的发生是一个血管损伤后新生内膜
增生和血管重构的过程[ 5] 。血管平滑肌细胞的增
殖和迁移 ,细胞外基质代谢异常以及血管壁的弹性
回缩是造成再狭窄的主要原因[ 4] 。
旋覆花素中的主要有效成分———旋覆花内酯
(ABL)属于苯并呋喃酮衍生物[ 3] 。业已证明 , ABL
可通过抑制 NF-κB激活来降低单核/巨噬细胞[ 3]和
血管内皮细胞[ 6]的炎症反应 。为了观察旋覆花素
抑制血管炎症的整体疗效 ,本实验用球囊内皮剥脱
法复制血管内膜增生模型 ,该模型的基本病理改变
就是内皮损伤所致的血管炎症性增生。在此过程中
伴有细胞外基质转换加快及 MMP-2 的活性升高 。
研究发现 ,行颈动脉结扎术的 MMP-2 缺陷型小鼠
较野生型内膜增生显著减轻 ,且源于 MMP-2 缺陷
型小鼠的 VSMC 迁移能力和侵袭能力都显著降
低[ 7] 。局部过度表达 TIM P-2 可有效抑制 VSMC
从中膜向内膜的迁移以及新生内膜的形成[ 8] ,这说
明MMP-2/ TIM P-2 系统与血管内膜增生密切相
关。
本实验首先证实 ,旋覆花素能够有效抑制球囊
损伤所致的内膜增生 。与正常血管比较 ,球囊损伤
后 ,血管组织中 MMP-2 水解活性及其表达升高的
同时也伴随着 T IM P-2 表达的增加 ,但从 MMP-2/
T IM P-2 的比值可以看出 , MMP-2 表达升高幅度大
于 T IM P-2 ,使此系统的平衡有选择地向 MMP-2 升
高的方向转变 ,从而促进基质降解 ,导致 VSMC 迁
移和新生内膜的形成。内皮损伤后 TIM P-2 表达变
化与 MMP-2 活性的一致性说明内皮损伤所诱导的
MMP-2蛋白水解活性的升高并不是因为其内源性
抑制剂 TIM P-2 表达降低所致 ,而是与 MMP-2 的
表达和酶原激活增加有关。此外 ,损伤后 T IM P-2
表达的升高又可以认为是机体自身的一种防御机
制 ,它可将 MMP-2 对基质的降解限制在细胞的周
围 ,防止新生内膜的过度膨胀 ,并有利于新生内膜细
胞间基质稳态的建立 。在旋覆花素治疗组中 ,
MMP-2水解活性 , MMP-2 和 TIMP-2 的表达及其
比值较模型组都显著降低 , MMP-2水解活性也受到
抑制 ,并接近于对照组水平。这说明旋覆花素具有
抑制 MMP-2 水解活性 ,并使 MMP-2/ TIM P-2 平
衡恢复正常水平 ,从而抑制基质降解 ,减轻新生内膜
增生的药理作用 。液相色谱分析显示 ,除 ABL 外 ,
旋覆花素中尚含有另外两种 ABL 的同系物 ,它们含
有相同的母核结构 ,只是乙酰化程度不同 ,且都具有
抑制 NF-κB 活化的作用(结果另文发表)。由于炎
性细胞中 MMP-2 的表达有赖于 NF-κB的激活[ 9] ,
因此推测 ,旋覆花素对 MMP-2/ TIM P-2 平衡的调
节可能也是其抗炎 、抑制血管内膜增生的作用途径
之一。
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4　参考文献
[ 1] 　Welt F G , Rogers C.Inflamma tion and restenosis in
the stent era [ J] . Arterioscler Thromb Vasc Biol ,
2002 , 22(11):1769-1776.
[ 2] 　Kuzuya M , Iguchi A.Role of matrix metalloproteinases
in vascular remodeling [ J] . J Atheroscler Thromb ,
2003 , 10(5):275-282.
[ 3] 　Han M , Wen J K , Zheng B , et al. Acetylbri-
tannila tone suppresses NO and PGE2 synthesis in RAW
264.7 macrophages through the inhibition of iNOS and
COX-2 gene expression[ J] .L ife Sci , 2004 , 75(6):
675-684.
[ 4] 　聂　磊 , 韩　梅 , 温进坤.血管内膜增生过程中核酸
代谢相关酶活性变化的研究[ J] .中国应用生理学杂
志 , 2003 , 19(3):241-244.
[ 5] 　Galis Z S , Khatri J J.Matrix metallopro teinases in vas-
cular remodeling and atherogenesis:the good , the bad ,
and the ug ly[ J].Circ Res , 2002 , 90(3):251-262.
[ 6] 　陈英珠 , 温进坤 , 韩　梅.旋覆花内酯对人血管内皮
细胞环加氧酶 2 和细胞间黏附分子 1 表达的影响
[ J].中国动脉硬化杂志 , 2005 , 13(2):129-132.
[ 7] 　Kuzuya M , Kanda S , Sasaki T , et al.Deficiency of
gelatinase A suppresses smooth muscle cell invasion and
development of experimental intimal hyperplasia [ J] .
Circulation , 2003 , 108(11):1375-1381.
[ 8] 　Cheng L , Mantile G , Pauly R , et al.Adenovirus-me-
diated gene transfer of the human tissue inhibito r of
metallopro teinase-2 blocks vascular smooth muscle cell
invasiveness in vitro and modulates neointimal develop-
ment in vivo[ J] .Circulation , 1998 , 98(20):2195-
2201.
[ 9] 　Yoshida M , Korfhagen T R , Whitse tt J A.Surfactant
pro tein D regulates NF-κB and matrix metallopro teinase
production in alveolar macrophages via oxidant-sensitive
pathways[ J] . J Im munol , 2001 , 166(12):7514-
7519.
INULICIN INHIBITS ACTIVATION AND EXPRESSION
OF VASCULAR REMODELING ENZYMES
INDUCED BY DE-ENDOTHELIUM
LI Juan-juan , WEN Jin-kun , HAN Mei
(Hebei Laboratory of Medical Biotechnology , Inst itute of Basic Medicine , Heibei Medical
University , Shijiazhuang 050017 , C hina)
ABSTRACT
Aim:To observe the effects of inulicin on the neointimal hyperplasia and expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and
tissue inhibito r of metalloproteinase-2(T IMP-2)after balloon injury in ra t aorta.Methods:The intimal hyperplasia model w as repli-
cated by balloon injury.The histological changes in vascular wall were observed by HE staining.MMP-2 activation w as tested by
gelatin zymogram analy sis;MMP-2 and T IMP-2 expression was de tected by Western blo t and immunohistochemistry analy sis.Re-
sults:Neointimal hyperplasia induced by balloon injury was significantly inhibited by inulicin.The pro teoly tic activity and the expres-
sion of MMP-2 and ra tio of MMP-2 and T IMP-2 were also returned to contro l level by inulicin af ter balloon injury.Conclusion:　
Inulicin inhibits hyperplasia of neointima by modulating the balance of MMP-2 and T IMP-2.
KEY WORDS:　metalloproteinase-2;　tissue inhibitor of metallopro teinase-2;　inulicin;　resteno sis
关于图 、表的要求
图应具有自明性 ,需精选 、精制 ,其内容不可与文字 、表格重复。图中的量 、单位 、符号 、缩写词和文字等
须与正文一致。病理组织照片 ,应标注染色方法和放大倍数 ,必要时应附有表示目的物尺寸大小的标度 。表
一般采用三线式 ,应力求简洁 ,主谓合理 。表须置于文中相应处 ,图可附另页。图表的题目 、内容和注释须用
英文。统计结果用平均数±标准差( x ±s)表示 ,一般不用平均数±标准误( x ±s x);统计符号中的 P 、F 用
大写的斜体 , t 、r 、q 用小写的斜体 。
本刊编辑部　　　　
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