全 文 ：#博导风采#
虫草肾茶胶囊对 5 /6肾切除大鼠
残肾组织 MMP - 2与 TIMP - 1表达的影响
宋立群1,于思明 1,郭丹丹 2, 马晓鹏1
( 11黑龙江中医药大学附属第一医院肾内科, 黑龙江 哈尔滨 150040;
21黑龙江中医药大学附属第二医院心内一科,黑龙江 哈尔滨 150001)
摘 要:目的: 观察虫草肾茶胶囊对 5 /6肾切除大鼠残肾组织基质金属蛋白酶 - 2(MM P - 2)与基质金属蛋白酶抑
制因子 -1( T IM P - 1)表达的影响。方法:取雄性 W istar大鼠 60只, 采用 5 /6肾切除法制作肾脏纤维化模型,随机分为 5
组:正常组、假手术组、模型组、治疗组、对照组。治疗组给予虫草肾茶胶囊 ( 0147g# kg -1 # d- 1 )灌胃,对照组给予福辛普
利钠片 ( 71 5mg# kg - 1# d- 1 )灌胃,其余各组给予等量的蒸馏水灌胃, 1次 /d。连续给药 8周后处死大鼠, 检测 24h尿蛋
白定量、血清肌酐、尿素氮、血清白蛋白、血清总蛋白、总胆固醇、三酰甘油等指标。用 RT - PCR法检测肾组织 MMP - 2、
T IMP -1的表达。结果: 虫草肾茶治疗组的 24h尿蛋白定量、BUN、Scr、Cho l、LDL低于模型组 (P < 0105, P < 01 01) , TP、
A lb高于模型组 (P < 0101)。治疗组与对照组明显增加了残肾组织 MMP - 2的表达 (P < 0101), 抑制了 T IM P - 1的表达
(P < 0105), 两组间比较无统计学差异。结论: 虫草肾茶胶囊通过减少尿蛋白, 升高 TP、A lb水平, 降低 BUN、Scr、Cho l、
LDL水平,增加肾组织 MMP - 2的表达, 下调 T IMP -1的表达, 起到改善肾脏纤维化的作用。
关键词:虫草肾茶胶囊; 肾脏纤维化; 基质金属蛋白酶 -2; 基质金属蛋白酶抑制因子 -1; 大鼠
中图分类号: R6921 5 文献标识码: A 文章编号: 1000 - 1719( 2009) 11 - 1860 -03
收稿日期: 2009 - 04 - 15
基金项目:黑龙江中医药大学校科研基金重大项目 ( 200701 )
作者简介:宋立群 ( 1957 - ) ,男,主任医师,博士研究生导师,主要从事
中医药治疗肾脏疾病的研究。
通讯作者:于思明,主治医师,博士,主要从事肾脏纤维化的研究。
虫草肾茶胶囊是治疗慢性肾衰竭的中药复方制
剂, 由发酵虫草菌粉、猫须草 (别名肾茶 )、草豆蔻、水
蛭等 6味药物组成。以往的临床研究结果显示:虫草
肾茶在 CKD 3、4期疗效较好,此外还对改善慢性肾衰
竭患者的营养状态与微炎症状态有益 [1 - 3]。本研究采
用 5 /6肾切除大鼠模型, 观察虫草肾茶胶囊对肾脏纤
维化大鼠残肾组织 MMP - 2与 TIM P - 1表达的影响,
探讨其作用机制。
1 材料与方法
11 1 实验材料
11 111 实验动物 雄性 W istar大鼠 60只, 6 ~ 8周
龄, 体重 180~ 220g, 由吉林大学实验动物中心提供。
11 112 实验药物 虫草肾茶胶囊由发酵冬虫夏草菌
粉、猫须草 (别名肾茶 )、制大黄、草豆蔻等 6味药物组
成, 每粒胶囊重 01 45g,相当于生药 21 41g, 由本院中药
制剂室加工而成。发酵冬虫夏草菌粉由江西金水宝制
药有限公司提供。福辛普利钠片由中美上海施贵宝制
药有限公司生产,批号: 0302086。
11 113 主要试剂及仪器 焦碳酸二乙酯 ( DEPC )由
瑞兴化学提供, DEPC处理水、GAPH 引物合成、MMP
-2引物合成、TIM P - 1引物合成、SYBRG reen PCR试
剂盒由宝生物工程有限公司提供, T rizol总 RNA提取
试剂购自 ABI基因公司。AB I7300荧光定量 PCR仪
(美国 AB I公司 ) , 2700型 PCR System扩增仪 (App lied
Biosystem s公司 )。
11 2 实验方法
11 211 模型制作与分组 60只 W istar大鼠适应性饲
养 1周, 其中 44只大鼠切除 5 /6肾组织, 手术分 2期
完成。先行背部切口暴露左侧肾脏, 切除左肾 2 /3,明
胶海绵压迫止血, 1周后将大鼠右肾蒂结扎并摘除右
肾。第二次手术 2周后将大鼠随机分为 3组, 即模型
组、治疗组、对照组。其余 16只随机分为正常组与假
手术组各 8只, 假手术组大鼠同期手术, 剥离肾脏脂肪
包膜,但不切除肾脏。
11 212 给药方法 各组大鼠以普通饲料喂养,自由饮
水。治疗组予虫草肾茶胶囊 01 47g# kg- 1 # d- 1灌胃,
对照组予福新普利 71 5mg# kg- 1 # d- 1灌胃, 1次 /d,模
型组、假手术组、正常组大鼠予等量蒸馏水灌胃,给药
容积均为 2mL /100g体重,连续给药 8周。
11 3 标本采集
末次给药后,将各组大鼠置于清洁代谢笼中,禁食给
水,收集 24h尿液。收集尿液后进行腹主动脉采血,分离
血清待检测,并取肾组织放入液氮中保存以备检测。
11 4 实验室指标检测
用双缩脲法检测 24h尿蛋白定量;用全自动生化
分析仪检测血清肌酐、尿素氮、血清白蛋白、血清总蛋
白、总胆固醇、三酰甘油等血清生化指标。
11 5 检测肾组织基质金属蛋白酶 - 2(MMP - 2) 基质
金属蛋白酶抑制因子 - 1( TIM P -1)的表达
11 511 大鼠肾脏总 RNA的提取 按照 RNA试剂盒
说明进行,取大鼠肾组织,用 T rizo l总试剂盒提取组织
RNA。取左侧残肾近皮质处的肾组织约 100mg, 加入
01 5mL的 Trizo l试剂, 反复冰冻匀浆。加预冷氯仿
200LL,在振荡器上震荡摇匀 15s, 4e , 12000r /m in,离
心 15m in后, 转移水相。加 600LL预冷异丙醇混匀,
沉淀 RNA, 置于 - 20e 冰箱 30m in, 4e , 10000r /m in,
离心 15m in后弃去上清液, 留沉淀。加入 75%预冷乙
醇 650LL漂洗沉淀 RNA, 4e , 8000 r /m in, 离心 5m in,
弃去上清液,留沉淀。打开管盖,干式恒温器 65e ,烘
干 5~ 10m in, 加入 20LL DEPC处理水溶解 RNA, -
#1860# 辽宁中医杂志 2009年第 36卷第 11期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2009.11.41.songlq.061
20e 冰箱保存待用。
11 512 逆转录反应 ( RT反应 ) 按照 cDNA合成试剂
盒说明书进行。将经过稀释后的 RNA样本进行 RT, 反
应体系如下:依次加入 5 @逆转录 buffer 4LL, oligo( dT)
01 5LL, dNTPs015LL, 逆转录酶 MMLV 1LL, DEPC处理
水 10LL, RNA模板 4LL, 37e ,水浴, 1h, 行 cDNA合成。
然后置于 PCR热循环仪内, 95e , 5m in,灭活逆转录酶
MMLV。逆转录后的 cDNA, -20e 保存。
11 513 RT -PCR反应 将制备好的 cDNA进行 PCR
扩增,扩增体系如下: SYBR G reenM ix 321 5LL,上游引
物 F 01 5LL, 下游引物 R 01 5LL, ddH2O水 1415LL, cD-
NA模板 2LL。大鼠 MMP - 2, TIMP - 1及 GAPDH特
异的 cDNA引物序列分别如下: MMP - 2引物序列上
游为 5cTGG TGG ACA CGG GCA GTA GTA A 3c,下游
为 5c TCG GAG GTC TCG GTA TGT ACT GG 3c; T IM P
-1引物序列上游为 5c ACA GGT TTC CGG TTC GCC
TAC 3c,下游为 5c CTG CAG GCA GTG ATG TGC AA
3c; GAPDH 引物序列上游为 5c GGC ACA GTC AAG
GCT GAG AAT CG 3c, 下游为 5c ATG GTG GTG AAG
ACG CCA GTA 3c。扩增条件为:离心混匀后,将反应
管置于 AB I7300荧光定量 PCR仪, PCR热循环参数为
95e 10m in; 95e 20s, 55e 30 s, 72e 30s; 40个循环。
反应结束后, 72e 10m in,使反应更彻底。进行数据和
熔解曲线分析, 数据采用仪器自带软件分析: ABI
Prism 7300 SDS So ftw are。
11 6 统计学方法
各组实验数据以 (€x ? s)表示, 两组间比较用 t检
验, 采用 SPSS 1310统计学软件进行统计学分析。
2 结 果
21 1 大鼠死亡情况
在模型制作过程中, 共有 4只大鼠死亡。在实验
过程中,治疗组有 3只大鼠死亡,对照组有 2只大鼠死
亡, 模型组有 4只大鼠死亡。
21 2 各组大鼠肾功 血浆蛋白与 24h尿蛋白定量的比较
与模型组比较,治疗组降低了大鼠血清 BUN, Scr
水平 ( P < 01 01) , 对照组也降低了大鼠的血清 BUN,
Scr水平 ( P < 0105, P < 01 01); 治疗组、对照组的 TP、
A lb水平均高于模型组 (P < 01 01)。治疗组、对照组的
24h尿蛋白定量均低于模型组 (P < 01 01)。见表 1。
表 1 各组大鼠肾功 血浆蛋白与 24h尿蛋白定量的比较 (€x ? s)
组别 n BUN( mm o l /L) Scr( Lm o l/L) TP ( g /L ) A lb( g /L) 24h尿蛋白 (mg /24h)
正常组 8 6. 86 ? 0. 52 25. 23 ?1. 25 67. 81? 5. 63 34. 86? 3. 55 7. 86 ? 0. 82
假手术组 8 7. 12 ? 0. 76 29. 07 ?0. 90 64. 38? 4. 29 31. 35? 2. 77 7. 33 ? 1. 65
模型组 10 19. 32 ? 4. 93 80. 21 ?25. 22 38. 94? 6. 10 14. 80? 2. 50 117. 33 ? 31. 65
治疗组 10 12. 79 ? 1. 93* * 50. 70 ?6. 55* * 52. 27? 5. 02* * 24. 17? 4. 33* * 67. 44 ? 23. 37* *
对照组 11 13. 32 ? 1. 88* * 64. 01 ?17. 94* 56. 01? 6. 52* * 26. 70? 4. 02* * 64. 17 ? 21. 33* *
注: 与模型组比较, * P< 0105,* * P < 0101。
21 3 各组大鼠 Cho l TG LDL的比较
与模型组比较,治疗组明显降低了大鼠血清 Chol
水平与 LDL水平 ( P < 01 05, P < 01 01) , 但对血清 TG
水平无明显影响。见表 2。
21 4 各组大鼠残肾组织 MMP -2与 TIM P - 1的表达
与模型组比较,治疗组与对照组明显增加了残肾
组织 MMP - 2的表达 (P < 01 01) ,抑制了 T IM P - 1的
表达 ( P < 01 05 ), 两组间比较无统计学意义 ( P >
01 05)。
表 2 各组大鼠 Chol TG LDL的比较 ( €x ? s)
组别 n TG (mm ol /L) Chol(mm ol /L) LDL( mm ol /L)
正常组 8 0170 ? 0141 1163 ? 0118 0148 ? 0127
假手术组 8 0167 ? 0144 1155 ? 0127 0153 ? 0121
模型组 10 2106 ? 0151 5105 ? 1107 1197 ? 0121
治疗组 10 2101 ? 0119 3132 ? 0158* * 1141 ? 0109*
对照组 11 2111 ? 0140 4112 ? 0177* 1183 ? 0120
注:与模型组比较, * P < 0105, * * P < 0101。
表 3 各组大鼠残肾组织 MMP -2与 TIMP -1表达的比较 (€x ? s)
组别 n MMP - 2(m RNA% ) T IMP - 1(m RNA% )
正常组 8 3166 ? 0176 0142 ? 0121
假手术组 8 3187 ? 0144 0155 ? 0127
模型组 10 0143 ? 0165 3141 ? 1109
治疗组 10 2177 ? 0140* * 2167 ? 0171*
对照组 11 2192 ? 0119* * 2174 ? 0190*
注:与模型组比较, * P < 0105, * * P < 0101。
3 讨 论
5 /6肾切除是目前公认的研究肾脏纤维化的良好
模型,被广泛用来研究慢性肾衰竭的发病机制 [4 ]。5 /6
肾脏切除后,残余肾的病理变化随时间而加重,早期肾
脏代偿性肥大,肾小球高灌注、高滤过、高压力,继之出
现肾脏纤维化、毛细血管囊萎陷、系膜进行性扩张、小
管间质性损害、小管细胞萎缩、小管扩张、间质炎症细
胞浸润、纤维化,最终发展为进行性肾衰竭。这一病理
变化过程与人类的慢性肾衰竭比较相似。
肾脏纤维化以细胞外基质 ( ex trace lluar matrix,
ECM )积聚和系膜细胞增殖为病理特征, ECM积聚是
导致肾脏纤维化的重要因素。目前认为, ECM的降解
系统主要有纤溶酶原激活物及其抑制物系统 ( tPA /
tPA I) ,基质金属蛋白酶及其抑制系统 (MMPs /TIMPs)
等。MMPs是一类含有锌离子的具有高度同源性的水
解酶类,其活性依赖钙离子, 可以降解 ECM中的主要
大分子物质, 如 FN、LN、IV型胶原等。 TIM Ps能特异
性的与 MMPs催化活性中心的锌离子结合, 而封闭其
催化活性。有研究表明基质金属蛋白酶抑制因子 - 1
( TIM P -1)通过抑制 ECM的降解过程导致 ECM积
聚,其表达在许多肾脏纤维化疾病中增高, 故认为
TIM P -1可能是比较重要的一种参与肾脏纤维化的降
解酶 [5]。减少 TIMP - 1在肾组织中的表达, 可以促进
ECM的降解,达到延缓肾脏纤维化进展的作用。
肾脏纤维化是慢性肾衰竭的病理基础。目前多数
研究认为,肾脏纤维化是由多种肾系疾病迁延不愈而
在肾脏形成的固定病变,本因脏腑虚损引起,是因虚致
实的病理变化,具有病情胶固、缠绵难愈的特点。其本
虚以脾、肾二脏虚损为主,标实则以痰、瘀、水、浊、毒五
邪为多见。基于此病机特点,课题组在/虫草肾茶方0
的基础上研制了虫草肾茶胶囊。方中虫草、黄芪合用
以补虚、治本, 辅以大黄活血、泄浊、排毒。猫须草清
热、利湿, 草豆蔻芳化湿浊,水蛭活血化瘀,并能引诸药
入血分,全方温、清、补、消并用,共奏养护正气,祛痰逐
瘀,推陈致新之功效。中药药理学研究表明,冬虫夏草
发酵菌丝体延缓慢性肾衰竭进展的机理可能与降低中
分子物质,补充必需氨基酸, 促进蛋白质代谢, 纠正脂
质代谢紊乱, 抑制系膜细胞增殖等有关 [6 ]。而在调节
ECM降解方面,大黄素对纤溶酶系统和基质金属蛋白
#1861# 辽宁中医杂志 2009年第 36卷第 11期
酶系统都有调节作用。有研究表明大黄素可降低 Ang
- II诱导 KFBI型胶原的表达及 PA I- 1的活性,促进
FN的降解,能拮抗 TGF -B1刺激的 MC分泌 FN [7 ]。
水蛭也可以活化纤溶酶、抑制胶原合成,减少细胞外基
质的产生,具有增强免疫与延缓肾脏病理进程的作用。
本实验的研究结果表明, 虫草肾茶胶囊能够明显
降低 5 /6肾切除大鼠的血清 SC r、BUN水平,减少尿蛋
白, 升高血清总蛋白、白蛋白水平, 降低 Cho l、LDL水
平。虫草肾茶治疗组、福辛普利对照组均增加了残肾
组织 MMP - 2的表达,下调了 TIM P -1的表达。ACEI
对肾脏具有确切的保护作用, 能够抑制肾小管间质单
核 -巨噬细胞及成纤维细胞积聚, 促进 ECM蛋白酶活
性, 并降低其抑制物的活性, 从而促进基质降解 [8 ]。
ACEI可以通过对基质金属蛋白酶及其抑制系统等
(MMPs /TIM Ps)的调节作用完成对 ECM 的降解。而
收稿日期: 2009 - 04 - 16
基金项目:广东省自然科学基金 ( 04010055, T004847 )
作者简介:卢传坚 ( 1964 - ) ,女, 教授、主任医师, 博士研究生导师, 博
士,主要从事皮肤病性病的临床、教学及科研。
本研究观察到,虫草肾茶胶囊也可对肾组织基质金属
蛋白酶系统产生明显的调节作用,与这可能是其减少
ECM的积聚,延缓肾脏纤维化进展的主要机制之一。
参考文献
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[7 ] 秦建华,陈明.大黄素抗肾间质纤维化研究进展 [ J ].中国中西医
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[8 ] 林善琰,吴永贵,马骥.实用内科学 [M ]. 11版.北京:人民卫生出
版社, 2001: 1929 - 1948.
/银屑灵片 0中药提取液对肿瘤坏死因子 - A
刺激后角朊细胞分泌细胞因子 IL - 8的影响
卢传坚 1,刘凤年 2
( 11广东省中医院皮肤科, 广东 广州 510120; 21 东莞市中医院, 广东 广州 510120)
摘 要:目的: 观察不同剂量的 /银屑灵片0对 TNF -A刺激产生的 IL - 8的抑制作用。方法: 将 COLO -16传代, 二
氧化碳培养箱中培养,取培养良好的 COLO - 16细胞, 分为 10组, 空白对照组, TNF -A对照组, 其余分别为 TNF -A加
不同浓度的 /银屑灵片0中药提取液组,培养 4h后用酶标仪测量各组 OD值, 建立标准曲线, 用 ELISA法测定各组 IL - 8
的含量。结果: /银屑灵片0的药液浓度越高, 对 TNF -A刺激产生的 IL - 8的抑制作用就越明显。结论: /银屑灵片0对
IL -8具有抑制作用, 这可能是其治疗银屑病的免疫作用机制之一。
关键词:银屑病; 银屑灵片; IL - 8; TNF -A
中图分类号: R7581 63 文献标识码: A 文章编号: 1000 - 1719( 2009) 11 -1862 - 02
银屑病是一种常见的慢性皮肤病, 亦是难治病之
一。其病理机制至今尚未完全阐明。目前证实在其发
病过程中,有多种免疫因子参与了其反应,有关 TNF -
A和 IL - 8在其发病过程中发挥的作用方向的研究日
益增多。研究认为 TNF -A可诱导 IL - 8的生成,从
而加重炎症反应, 加重病情 [1 ]。因此, 减少 IL - 8的生
成可成为药物治疗作用之一。 /银屑灵片0是本院名
老中医禤国维教授的经验方, 应用于临床治疗银屑病
已 5年余,收到了较好的临床效果。本研究利用 TNF
-A诱导 IL - 8的生成,同时加用 /银屑灵片0中药提
取液干预, 通过对 IL - 8剂量的测定来探讨 /银屑灵
片0治疗银屑病的免疫作用机制。
1 材料和方法
11 1 中药提取液
将/银屑灵片0的中药水煎、萃取, 放至冰箱 -
20e 保存。
11 2 细胞
角质形成细胞株 COLO - 16购自北京医科大学,
中国医学科学院中国协和医科大学皮肤病研究所保
存,复苏后应用。
11 3 药物及试剂
人 TNF - A 液购自 Pepro tech 公司, ED50 <
01 05ng /mL。 IL - 8试剂盒购自上海森雄科技公司。
RPM I -1640培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT(噻唑
蓝 )、二甲基亚砜 ( DM SO ) (晶美生物有限公司 )。
11 4 仪器
流式细胞仪 (美国 COULTER公司, EPICS ELITE
型 )孵箱 (H arris HSO301T -UBA ) ( 美国 )
11 5 实验方法
11 511 细胞传代及加药 角质形成细胞株在含 10%
的胎牛血清的完全 RPM I- 1640培养液中以 1B4的传
代密度传代,置于 37e 、5%二氧化碳培养箱中贴壁生
长 48h。在显微镜下观察 4瓶 COLO - 16细胞贴壁生
长情况良好, 已长满瓶壁的 70% ~ 80%, 取生长状态
良好的 COLO - 16细胞, 按 5 @ 104 /mL密度、100LL /
孔接种到 96孔板中, 使细胞密度达到 5 @ 104 /孔。置
于 37e 、5%二氧化碳培养箱中贴壁生长 48h。显微镜
下观察细胞贴壁生长良好, 达到 50% ~ 60%融合, 吸
#1862# 辽宁中医杂志 2009年第 36卷第 11期