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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
人类研究利用各种杀虫物质来防治有害昆虫，
减轻有害昆虫对作物的危害，保证作物产量和品质，
满足人类不断增长的需求。从天然产物中研究、提
取具有杀虫活性的化合物，是开发新杀虫剂和克服
或延缓害虫产生抗药性的有效途径之一。新疆一枝
收稿日期 ：2013-01-31
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260444），新疆维吾尔自治区自然基金项目（2012211A018）
作者简介 ：何海，男，硕士研究生，研究方向 ：昆虫分子毒理学 ；E-mail ：hehai0528@sohu.com
通讯作者 ：刘小宁，女，博士，研究方向 ：农业昆虫与害虫防治 ；E-mail ：liuxn0103@sina.com
新疆一支蒿提取物诱导棉铃虫解毒酶 P450
CYP6B6的表达规律
何海1 刘宁2 朱燕1 刘小宁1
（1. 新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046 ；
2. 国家棉花工程技术研究中心，乌鲁木齐 830091）
摘 要： 旨在利用实时荧光定量 PCR和 Western blot分别研究新疆一枝蒿提取物黄酮及萜类对棉铃虫 P450 CYP6B6在
mRNA水平和蛋白水平上表达的影响。实时荧光定量 PCR结果表明，P450 CYP6B6在 mRNA水平的表达量受到诱导。时间效应为
P450 CYP6B6在处理的 12 h时能够被黄酮和萜类提取物显著诱导表达，并且在 24 h时表达受到抑制；浓度效应为处理 24 h时，黄
酮和萜类提取物浓度分别为 20 mg/100 g和 1 mg/100 g时显著诱导 P450 CYP6B6的表达，并且在 40 mg/100 g和 2 mg/100 g时抑制
P450 CYP6B6的表达；Western blot检测结果表明，萜类和黄酮在时间和浓度效应上都能显著诱导 P450 CYP6B6蛋白表达，并且蛋
白水平在时间与浓度效应中的表达趋势与 mRNA水平相似。
关键词： 新疆一枝蒿提取物 棉铃虫 P450 CYP6B6 表达规律
Effect of Extracts from Artemisia rupestris on P450 CYP6B6 Expression
Profile from Cotton Bollworm（Helicoverpa armigera）
He Hai1 Liu Ning2 Zhu Yan1 Liu Xiaoning1
（1. Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，
Urumqi 830046；2. National Cotton Engineering &Technology Research Center，Urumqi 830091）
Abstract: In order to investigate the cytochrome P450 CYP6B6 in midgut induced by flavones and terpenes extracts from Artemisia
rupestris, we detected the CYP6B6 expression in mRNA level by Real-time quantitative PCR（qPCR）, and at protein level by Western blot.
qPCR results showed that the P450 CYP6B6 mRNA levels in the midgut of the larvae were induced by these two extracts. For the time effect,
when the larvae were exposed to 20 mg/100 g flavones extracts and 2 mg/100 g terpenes extracts respectively for 12 h the relative expression
level of P450 CYP6B6 mRNA in the midgut was over-expressed, while at 24 h the expression was inhibited. For the concentration effect, when
the larvae were treated with these two exyracts for 24 h, the relative expression level of P450 CYP6B6 mRNA was over-expressed by 20 mg/100
g flavones and 1 mg/100 g terpenes extracts, respectively, while the expression was inhibited by 40 mg/100 g flavones and 2 mg/100 g terpenes
extrcts in the diet, respectively.
Key words: Extracts from Artemisia rupestris Helicoverpa armigera P450 CYP6B6 Expression profile
蒿为菊科 Compositae 蒿属植物，生长在海拔 1 600-
4 500 m 的森林草原带，是新疆维吾尔族传统的常
用药物，具有解毒、抗癌、治疗消化不良、退烧等
医学用途［1，2］，新疆一支蒿是维吾尔族传统常用药
品，亦对农业害虫具有一定的驱避和毒杀活性。通
DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2013.09.016
2013年第9期 131何海等 ：新疆一支蒿提取物诱导棉铃虫解毒酶 P450 CYP6B6 的表达规律
过对新疆一枝蒿粗提物的研究表明，对棉铃虫具有
一定的驱避和毒杀作用［3］，但其作用机理尚不明确，
亟需深入研究。细胞色素 P450 CYP6B6 是存在于棉
铃虫等昆虫体内的一种解毒酶，在植物与昆虫的交
互作用中扮演着重要角色［4，5］，当昆虫受到植物次
生物质或外源有毒物质侵害时，昆虫体内的 P450
CYP6B6 含量、活性就会产生应激性反应，其最大
的特点就是容易被诱导并在表达量上产生系列变
化［6-8］。我们在前期研究的基础上，对新疆一枝蒿
粗提物对棉铃虫的细胞色素 P450 CYP6B6 在核酸水
平上的诱导及表达规律进行深入研究和分析，进一
步阐明其杀虫作用和毒理机制，旨在对利用新疆一
枝蒿这一植物资源研发新型的环境友好植物杀虫剂，
提供必要的基础理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
棉铃虫源自中国农业大学昆虫毒理室，已在室
内饲养多年。棉铃虫的饲养条件为 ：25℃，相对湿
度为 75%，光照周期为 16 h∶8 h（L∶D）。成虫的
饲养条件同幼虫，只是在饲养过程中为其提供 10%
的蜂蜜水。本试验所使用的棉铃虫均为初蜕皮的 3
龄幼虫。
1.2 方法
1.2.1 试虫诱导处理 分别以萜类提取物和黄酮提
取物以不同的浓度和时间处理初蜕皮的 3 龄棉铃虫
幼虫，实时荧光定量 PCR 与酶联免疫吸附测定的试
虫处理如下。
Real-time qPCR（RT-PCR）试虫的处理 ：分别
将黄酮提取物以 20 mg/100 g 和 40 mg/100 g 为浓度
梯度 ；将萜类提取物分别以 0.5 mg/100 g、1 mg/100
g、2 mg/100 g 和 4 mg/100 g 为浓度梯度加入棉铃虫
饲料中混合均匀饲喂棉铃虫 24 h 后解剖，取中肠放
液氮中冻存备用 ；分别并以黄酮 20 mg/100 g，萜类
2 mg/100 g 的浓度加入棉铃虫饲料中混合均匀饲喂
棉铃虫 6、12 和 24 h 后解剖中肠液氮冻存备用 ；设
置使用普通饲料饲养的棉铃虫作为空白对照 CK 组，
解剖中肠存于液氮中冻存备用。
酶联免疫吸附（ELISA）测定试虫的处理 ：分
别将黄酮提取物以 10 mg/100 g、20 mg/100 g、40
mg/100 g 和 80 mg/100 g 为浓度梯度 ；将萜类提取
物分别以 0.5 mg/100 g、1 mg/100 g、2 mg/100 g 和 4
mg/100 g 为浓度梯度加入棉铃虫饲料中混合均匀饲
喂棉铃虫 12 h 后解剖中肠提取总蛋白备用 ；并以黄
酮 20 mg/100 g，萜类 2 mg/100 g 的浓度加入棉铃虫
饲料中混合均匀饲喂棉铃虫 12、24、36 和 48 h 后
解剖中肠，提取总蛋白备用。设置使用普通饲料饲
养的棉铃虫作为空白对照 CK 组，解剖中肠，提取
总蛋白备用。
1.2.2 总 RNA 提取与 cDNA 合成 将不同处理
组解剖好的棉铃虫肠从液氮中取出，用 Trizol 法
（Invitrogen）提取总 RNA。总 RNA 经过用紫外 / 可
见分光光度计（NanoDrop ND-1000 Spectrophotome-
ter）精确定量后取 1 μg 反转合成 cDNA，全部提取步
骤依照 Invitrogen 公司总 RNA 提取与 cDNA 说明书。
1.2.3 实时荧光定量 PCR 采用实时荧光定量 PCR
的方法来检测 CYP6B6基因与内参基因 actA3a 的
表达量，所用试剂盒为 Invitrogen 公司产品。在
GenBank 上查得棉铃虫 P450 CYP6B6（GenBank 登
录 号 ：AY950636） 与 actA3a（GenBank 登 录 号 ：
X97614）全长序列，用 Primer 5.0 软件设计两对引
物用于实时定量 PCR 扩增（表 1）。
表 1 棉铃虫 CYP6B6与 actA3a引物序列
引物名称 引物序列（5-3）
Actin-A1 ATCATCGACGCTCCCGGACA
Actin-A2 TAGCTGCTTGACTCCGAGGGTGA
CYP6B6-Y1 TTCAAACTTATACCATGTCCACAATT
CYP6B6-Y2 CCAATTGACGGAGCTCTAGAATCA
在荧光定量 PCR 仪（GeneAmp 9600）中进行
反应。采用实时荧光定量 PCR 20 μL 反应体系如
下 ：1 μL cDNA，10 μL SYBR Green 染料，上下游混
合引物共 0.3 μL，无 RNA 酶水 8.7 μL。将构建好的
CYP6B6与 actA3a 标准质粒分别用无 RNA 酶水以
1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、
1∶107为浓度梯度稀释进行PCR反应绘制标准曲线。
实时荧光定量 PCR 扩增程序如下 ：94℃预变性 5
min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s；读板；81℃ 1 s；
读板；40 个循环，循环条件为：95℃ 30 s，65℃ 30 s，
72℃ 30 s ；最后 72℃保温 10 min。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期132
棉铃虫 CYP6B6 mRNA 相对表达量是棉铃虫
CYP6B6 mRNA 表达量和内参 actA3a mRNA 表达量
的比值，用下列公式计算。将棉铃虫 CYP6B6 mRNA
相对表达量使用 Prism 4.0 软件单因素方差分析并绘
图。靶基因的相对表达量 =E靶基因ΔCt靶基因（对照组 -
参照组）/E参照基因ΔCt参照组（对照组 - 参照组）。
1.2.4 黄酮与萜类提取物对棉铃虫 P450 CYP6B6 表
达的影响 将处理后的 3 龄棉铃虫解剖后取出中肠，
在液氮中研磨并溶于蛋白提取液中提取蛋白，提取
好的蛋白经过定量后使用 12% 的 SDS-PAGE 电泳分
离并转膜，将膜使用带 CYP6B6 标签的一抗孵育，
清洗，使用羊抗兔的二抗孵育，清洗，DAB 显色后
拍照。
1.2.5 数据分析 Western blot 与 RT-PCR 结果使用
Prism 4.0 软件单因素方差分析并绘图。
2 结果
2.1 核酸水平上新疆一枝蒿黄酮和萜类提取物对
棉铃虫P450 CYP6B6表达的影响
2.1.1 黄酮提取物对棉铃虫 P450 CYP6B6基因表
达的影响 图 1-A 为黄酮提取物对棉铃虫 3 龄幼虫
CYP6B6基因在 mRNA 水平诱导的浓度效应。从图
1-A 可以看出使用 20 mg/100 g 的黄酮提取物处理棉
铃虫 24 h 时，CYP6B6在 mRNA 水平上的表达量达
到最高阈值，与对照组相比较差异极显著（P<0.01），
并且在浓度增加到 40 mg/100 g 后抑制 CYP6B6基因
的表达。图 1-B 为黄酮提取物对棉铃虫 CYP6B6基
因在 mRNA 水平诱导的时间效应。从图 1-B 可以看
出 20 mg/100 g 浓度的黄酮处理棉铃虫，在 6 h 时开
始诱导其 CYP6B6基因在 mRNA 水平上的表达，在
12 h 时达到最高阈值，与对照组相比较差异极显著
（P<0.01），可达 22 倍左右的诱导倍数，在 24 h 时抑
制了 CYP6B6基因的表达。
2.1.2 萜类提取物对棉铃虫 P450 CYP6B6基因表
达的影响 图 2-A 显示，使用 1 mg/100 g 的萜类提
取物处理棉铃虫 24 h 时，CYP6B6在 mRNA 水平上
的表达量达到最高阈值，与对照组相比较差异极显
著（P<0.01），并且在浓度增加到 2 mg/100 g 后抑制
CYP6B6基因的表达。图 2-B 为萜类提取物对棉铃虫
CYP6B6基因在 mRNA 水平诱导的时间效应。从图
CK 为不作任何处理的对照组。同一幅图内小写字母不同者
表示在 0.01 水平差异极显著，相同则表示差异不显著
图 1 新疆一枝蒿中黄酮提取物对棉铃虫 3龄幼虫 CYP6B6
基因在 mRNA水平诱导的浓度（A）和时间效应（B）
2-B 可以看出使用 1 mg/100 g 浓度的萜类提取物处理
棉铃虫在 6 h 时，CYP6B6在 mRNA 水平的表达量有
所降低，但是在 12 h 时表达量达到最高阈值，与对
照组相比较差异极显著（P<0.01），在 24 h 时抑制了
CYP6B6基因的表达。
2.2 蛋白水平上新疆一枝蒿黄酮和萜类提取物对
棉铃虫P450 CYP6B6表达的影响
2.2.1 黄酮提取物对棉铃虫 P450 CYP6B6 蛋白表达
的影响 图 3-A 显示，使用 10 mg/100 g 的黄酮提
取物处理棉铃虫 24 h 时，CYP6B6 在蛋白水平上表
达有一定增长，当黄酮浓度增加到 40 mg/100 g 时
CYP6B6 蛋白表达量达到最高阈值，与对照组相比
差异显著（P<0.05）；图 3-B 显示，20 mg/100 g 浓度
的黄酮提取物处理棉铃虫在 6 h 时，CYP6B6 基因在
蛋白水平上的表达就达到最高阈值，与对照组相比
差异显著（P<0.05）。综上，在时间效应与浓度效应上，
棉铃虫 CYP6B6 在蛋白水平上均无抑制表达现象。
2.2.2 萜类提取物对棉铃虫 P450 CYP6B6 蛋白表达
的影响 从图 4-A 可以看出，当用 0.5 mg/100 g 与 1
mg/100 g 的黄酮提取物处理棉铃虫 24 h 时，CYP6B6
2013年第9期 133何海等 ：新疆一支蒿提取物诱导棉铃虫解毒酶 P450 CYP6B6 的表达规律
在蛋白水平上表达有一定增长，当萜类浓度增加到
4 mg/100 g 时 CYP6B6 蛋白表达量达到最高阈值，与
对照组相比差异显著（P<0.05）；从图 4-B 中可以看
出，2 mg/100 g 浓度的萜类提取物处理棉铃虫在 6 h
时，CYP6B6蛋白水平上的表达有一定增长，并在
24 h 和 36 h 时达到较高表达量，与对照相比差异显
著（P<0.05），萜类对棉铃虫 CYP6B6 蛋白的诱导与
黄酮对其诱导结果相似 ：无论是时间效应还是浓度
效应，棉铃虫 CYP6B6基因在蛋白水平上均无抑制
表达现象。
3 讨论
本试验是在前期研究发现新疆一枝蒿粗提物对
棉铃虫具有良好的毒杀效果基础上，进一步对新疆
一枝蒿粗提物进行二次分离提纯成黄酮与萜类提取
物两种，分别研究其对棉铃虫的毒杀作用。毒力测
定表明，新疆一枝蒿中提取的黄酮与萜类提取物对
棉铃虫均表现出良好的毒力效果。其中萜类提取物
对棉铃虫 24 h 与 48 h 时 LC50 分别为 4.1 mg/100 g
与 3.1 mg/100 g，与黄酮提取物对棉铃虫 24 h 与 48 h
时 LC50 分别为 21.4 mg/100 g 与 19.3 mg/100 g 相比，
毒杀效果更好［3］。这不仅表明新疆一枝蒿粗提物对
棉铃虫具有良好的毒杀作用，同时也证明其内在成
分对棉铃虫的毒杀效果存在较大差异。
细胞色素 P450 CYP6B6 是棉铃虫等昆虫体内重
要的解毒酶，能够被杀虫剂或植物性次生物质等外
CK 为不作任何处理的对照组。同一幅图内小写字母不同
者表示在 0.01 水平差异极显著，相同则表示差异不显著
图 2 新疆一枝蒿中萜类提取物对棉铃虫 3龄幼虫 CYP6B6
基因在 mRNA水平诱导的浓度（A）和时间效应（B） A ：CK ：对照 ；1 ：10 mg/100 g ；2 ：20 mg/100 g ；3 ：40 mg/100 g ；4 ：80 mg/100 g ；B ：CK ：对照 ；1 ：6 h ；2 ：12 h ；3 ：24 h ；4 ：36 h ；CK 不作任
何处理的对照组。同一幅图内小写字母不同者表示在 0.05 水平差异显著，
相同则表示差异不显著
图 3 新疆一枝蒿中黄酮提取物对棉铃虫 3龄幼虫 CYP6B6
在蛋白水平诱导的浓度（A）和时间效应（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期134
源有毒物质所诱导，这一点有助于准确研究外源有
毒物质对棉铃虫的毒杀机理。新疆一枝蒿中黄酮与
萜类提取物均能够显著诱导棉铃虫幼虫中肠CYP6B6
的表达，以不同浓度、不同时间处理，CYP6B6 的
表达量各不相同。在 mRNA 水平上，新疆一枝蒿黄
酮提取物能够显著诱导棉铃虫 CYP6B6基因的表达，
其表达量相对空白对照组最高能增长超过 20 倍 ；而
新疆一枝蒿萜类提取物虽然也能显著提升 CYP6B6
基因表达量，但是对棉铃虫 CYP6B6基因表达量的
诱导倍数较低，最高约是空白对照组的 4 倍。从而
证明一支蒿提取物对棉铃虫解毒酶的诱导作用强度
不同，毒杀效果亦不同，外源有毒物质诱导作用强
的毒杀效果差。
新疆一支蒿黄酮与萜类提取物对棉铃虫CYP6B6
基因诱导表达在时间与浓度效应上都表现出先升后
降的趋势。从中推测这两种外源物质毒杀棉铃虫的
分子机理 ：当有害物质入侵 6 h 左右，棉铃虫体内
CYP6B6 解毒酶开始发挥解毒作用，到 12 h 左右可
以达到最强解毒效果，随着在昆虫体内作用时间的
延长或外源物质吸收（渗入）浓度的增加，棉铃虫
解毒活动增强，大量消耗体内脂肪等能源物质，过
度消耗造成能量供应不足时，CYP6B6 解毒酶活性
开始被抑制，表明 CYP6B6 对棉铃虫受到外源有毒
物质侵害时的保护作用是有限的，它只能在一定的
范围内起作用。使用棉酚处理棉铃虫，也观察到这
一试验现象［9］。
P450 CYP6B6 蛋白的表达变化取决于转录与翻
译水平，因为蛋白质是基因功能的表现形式，不管
CYP6B6 在 mRNA 水平变化有多大，若没有 CYP6B6
蛋白执行功能，棉铃虫幼虫是无法得到解毒酶的保
护的。所以了解 CYP6B6 的转录与翻译之间的动态
关系是极其重要的。由 Western blot 结果发现，萜
类提取物对棉铃虫 CYP6B6 解毒酶基因在蛋白水平
相对 mRNA 水平上的响应具有一定滞后性。24 h 才
能有明显的诱导差异，在 36 h 之后会达到最高诱导
倍数 ；黄酮提取物对棉铃虫 CYP6B6 解毒酶在蛋白
水平与 mRNA 水平上的响应时间一样，但响应倍数
则是 mRNA 水平上较高。可能的原因是 CYP6B6 的
mRNA 和蛋白质对浓度的应答快慢程度不同。由于
转录和翻译在时间上的先后顺序，蛋白质表达的应
答晚于转录是正常的。这也许可以解释为基因水平
的响应灵敏度超过蛋白水平。
综上所述，新疆一枝蒿作为新疆特有植物，生
长环境高温干旱且盐碱性较大，这造就了其与其它
省份植物不同的特色。本研究已证明其黄酮与萜类
粗提物对棉铃虫的毒杀效果较好，在一定浓度和时
间范围对棉铃虫 P450 CYP6B6解毒酶有一定的诱导
过表达以抵御有毒物质对自身的毒害，否则就会抑
制该解毒酶的表达造成棉铃虫的生长发育受阻甚至
死亡［3］。这为将来新疆一枝蒿提取物作为植物杀虫
剂的应用前景提供了理论依据。在接下来的工作中，
A ：CK ：对照 ；1 ：1 mg/100 g ；2 ：2 mg/100 g ；3 ：4 mg/100 g ；
4 ：8 mg/100 g ；B ：CK ：对照 ；1 ：6 h ；2 ：12 h ；3 ：24 h ；4 ：36 h ；
CK 为不作任何处理的对照组。同一幅图内小写字母不同者表示在
0.05 水平差异显著，相同则表示差异不显著
图 4 新疆一枝蒿中萜类提取物对棉铃虫 3龄幼虫 CYP6B6
在蛋白水平诱导的浓度（A）和时间效应（B）
2013年第9期 135何海等 ：新疆一支蒿提取物诱导棉铃虫解毒酶 P450 CYP6B6 的表达规律
我们将继续纯化分离新疆一枝蒿某种或某几种单体
化合物具有杀虫作用，为将来新型杀虫剂的研发以
及工业化生产奠定基础。
4 结论
新疆一枝蒿提取物黄酮及萜类对 P450 CYP6B6
的诱导存在明显的时间和浓度效应。时间效应为
P450 CYP6B6在处理的 12 h 时能够被黄酮和萜类
提取物显著诱导表达，并且在 24 h 时表达受到抑
制 ；浓度效应为在处理 24 h 时，黄酮和萜类提取
物浓度分别为 20 mg/100 g 和 1 mg/100 g 时显著诱
导 P450 CYP6B6的表达，并且在 40 mg/100 g 和 2
mg/100 g 时抑制 P450 CYP6B6的表达。萜类和黄酮
在时间和浓度效应上也都能显著诱导 P450 CYP6B6
蛋白表达，并且蛋白水平在时间与浓度效应中的表
达趋势与 mRNA 水平相似。
参 考 文 献
［1］ Liang YH, Tan Y, Sun Y. The pharmacological studies progress of
Artemisia rupestris［J］. Xinjiang Journal of Traditional Chinese
Medicine, 2005, 23（2）：67-68.
［2］ Song WX, Ji TF, Si YK. Studies on chemical constituents in herb
from Artemisia rupestris［J］. China Journal of Chinese Materia
Medica, 2006, 31（21）：1790-1792.
［3］ 何海 , 黄丽 , 刘小宁 , 等 . 新疆一枝蒿与黄花蒿粗提物抗棉铃虫
与棉蚜特性研究［J］. 新疆农业科学 , 2011, 5 ：889-895.
［4］ Gonzalez FJ, Nebert DW. Evolution of the P450 gene superfamily ：
animal-plant warfare, molecular drive and human genetic differences
in drug oxidation［J］. Trends Genetics, 1990, 6 ：182-186.
［5］ Schuler MA. The role of cytochrome P450 monooxygenases in plant-
insect interactions［J］. Plant Physiol, 1996, 112 ：1411-1419.
［6］ Harrison TL, Zangerl AR, Schuler MA, Berenbaum MR. Developme-
ntal variation in cytochrome P450 expression in Papilio polyxenes in
response to xanthotoxin, a hostplant allelochemicals［J］. Arch Insect
Biochem Physiol, 2001, 48（4）：179-189.
［7］ Liu XN, Liang P, Gao XW, Shi XY. Induction of the cytochrome
P450 activity by plant allelochemicals in the cotton bollworm,
Helicoverpa armigera（Hübner）［J］. Pesticide Biochemistry and
Physiology, 2006, 84（2）：127-134.
［8］ Stevens JL, Snyder MJ, Koener JF, Feyereisen R. Inducible P450s
of the CYP9 family from larval Manduca sexta midgut［J］. Insect
Biochem Mol Biol, 2000, 30（7）：559-568.
［9］ Zhou XJ, Sheng CF, Li M, et al. Expression responses of nine cytoch-
rome P450 genes to xenobiotics in the cotton bollworm Helicoverpa
armigera［J］. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2000, 97（3）：
209-213.
（责任编辑 马鑫）