全 文 ：新疆农业科学 , 一
幼
以抖 一
棉铃虫中肠谷胧甘肤 一转移酶 对新疆
一枝篙黄酮提取物和菇类提取物的响应
何 海 , ,朱 燕 ,刘 宁“,晃群芳 ,`刘小宁 `
新任大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室 ,乌鲁木齐
国家棉花工程技术研究中心 ,乌导木齐
拼
摘 要 【目的】研究新疆一枝篙提取物黄酮及菇类提取物对棉铃虫解毒酶谷胧甘肤 一转移酶 的影
响 ,探明外源有毒物质对该解毒酶表达规律的影响 ,阐明棉铃虫与植物次生物质相互作用的机制 ,为发展新型
无公害植物源农药提供理论依据。 【方法】从新疆一枝篙中分离提纯黄酮与菇类提取物 ,以室内饲养棉铃虫
龄幼虫 为对象 ,利用生物测定 、实时荧光定量 及酶联免疫吸附测定法 ,分别测定新疆一枝篙中黄酮
与菇类提取物对棉铃虫的毒杀效果及其在 水平和蛋白水平上对 表达的影响。【结果 黄酮和菇类
提取物对棉铃虫 龄幼虫在 时的半致死浓度 分别是 和 岁 ,在 时的半致死浓度
分别是 和 岁 实时荧光定量 结果表明 在 水平的表达量受到诱导 ,时间效
应为当黄酮和掂类提取物浓度分别为 和 扩 时 , 在 时能够被两种物质显著诱导表达 ,而
在 时表达受到抑制 浓度效应为在 时 ,黄酮和菇类提取物浓度分别为加 和 岁 时显著诱导
的表达 ,而在 和 岁 时抑制 的表达 酶联免疫吸附测定结果表明 ,枯类和黄酮在时间和浓
度效应上都能显著诱导 蛋白表达 ,并且蛋白水平在时间与浓度效应中的表达趋势与 水平相类似。
【结论】 对外源物质新疆一枝篙的黄酮提取物和菇类提取物存在积极响应 ,低浓度或短时间内黄酮和菇
类均能诱导 的过表达 ,从而化解外源毒性 ,而浓度过高或时间过长则抑制其表达。
关键词 新疆一枝篙 棉铃虫 谷胧甘肤 一转移酶 生物测定 表达规律
中图分类号 十 文献标识码 文章编号 一 一 一
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收稿日期 一 一
基金项目 新疆维吾尔自治区自然科学基金 新疆维吾尔自治区科技支疆项目 阅
作者简介 何海 一 ,男 ,新疆乌鲁木齐人 ,硕士研究生 ,研究方向为昆虫毒理 , 一 动
通讯作者 刘小宁 一 ,女 ,陕西人 ,副教授 ,博士 ,硕士生导师 ,研究方向为农业昆虫与害虫防治 , 一 义」 ,
期 何海等 棉铃虫中肠谷脱甘肤 一转移酶 对新疆一枝篇黄酮提取物和菇类提取物的响应
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引 言
【研究意义】棉铃虫 况创甲 啥 是鳞翅目夜蛾科杂食性昆虫 ,能危害棉花 、玉米 、小麦 、大
豆 、花生 、蔬菜 、水稻等 种栽培植物和 种野生植物 ,是造成农作物减产的重要害虫之一 ,在新疆对
棉花危害最大 。目前世界上对棉铃虫的防治大多基于大量使用神经毒素类杀虫剂 ,不但对周围环境的
破坏非常严重 ,并且其残留物还威胁着公共食品安全以及意外泄漏所造成的潜在风险。同时不断加大
杀虫剂的使用量 ,则会导致棉铃虫种群抗性急剧升高 。自 世纪 年代中期开始 ,中国田间棉铃虫抗
性一直在增长 〔一 〕。就菊醋类杀虫剂来说 ,棉铃虫在 年之前 ,对菊酷类杀虫剂尚未产生抗性 ,但到
年 ,棉铃虫对澳氰菊醋 、氰戊菊醋的抗性已分别猛增 一 和 倍 。 年棉铃虫对这两种杀
虫剂的抗性继续增长 ,分别提高 和 倍 。到 年 ,棉铃虫对澳氰菊醋的抗性也超过 倍 〔` 。
棉铃虫抗性问题在澳大利亚 〔 、泰国 〔` 、印度尼西亚和印度陈 均有相关的报道 。这一系列问题主要
是因为长期使用化学合成杀虫剂 ,以及其残留物无法分解而导致的。对非靶标生物无害 ,并且能够自然
降解的环保型杀虫剂 ,目前已经成为世界各国研究的新方向。 前人研究进展 谷胧甘肤 一转移酶
砂 一 ,简称 是催化还原型谷胧甘肤 , 与各种亲电子化合物进
行亲核加成反应的一类酶 。 的底物非常广泛 , 和各种亲电有毒化合物的扼合可以保护细胞中
其它亲核中心 如蛋白质和核酸等 免受侵害 。 的扼合物易溶于水 ,因此更易排出体外 。 具有
多种功能 ,主要表现在以下二个方面 ,对异源有毒物质解毒 、保护细胞免受氧化损伤 、对激素 、内源代谢
物和外源化合物进行细胞间运输 川。棉铃虫 活性的增高使其对杀虫剂抗性的增强￡” 。使用紫外
分光光度测定酶活性发现 可被外源有毒物质诱导 ,如敌敌畏可以诱导棉铃虫 酶活性提高
倍以上 〔” ,而一些植物次生物质烟碱 、番茄昔 、棉酚和辣椒素则不能显著诱导棉铃虫 的酶活性 〔咚 ,
但是 一十三烷酮却能明显地诱导棉铃虫幼虫不同组织的 活性增加 〔`, 〕,在黄酮类物质懈皮素以较
低剂量长时间诱导下 ,棉铃虫 活性最高可增加 倍 〔“ 当棉铃虫受到榭皮素与 一十三烷酮诱导
时 ,使用实时荧光定量 法测定发现 的表达量最高分别可达 与 倍 〔 。 的可诱
22 56 新疆农业科学 卷
导性有利于验证外源有毒物质对昆虫的作用影响〔` 。 【本研究切人点 】新疆一枝篙为菊科
篙属植物 ,是维吾尔医药传统的常用药物 ,具有解毒 、抗癌 、治疗消化不良 、退烧等功效 ,划 。新疆
一枝篙分布于中国新疆 、中亚 、欧州等地 ,在新疆主要分布于阿尔泰山 、天山和昆仑山区 ,生长在海拔
一 的森林草原带。在野外考察中发现 ,在新疆一枝篙植株的周围没有昆虫活动 ,目前还没有
关于新疆一枝篙驱避或毒杀昆虫的报道 。课题组曾对新疆一枝篙进行了粗提 ,并发现其醇提物对棉铃
虫具有极好的毒杀 、驱避 、生长抑制等作用 ,但未探明在醇提物中起毒杀效果的具体为何种物质 川 。研
究中 ,从新疆一枝篙中分别获得了黄酮提取物和菇类提取物 ,并使用提取物对 龄棉铃虫进行了生物测
定 ,发现两种提取物的毒杀效果较好 ,为进一步研究其对棉铃虫的毒杀机理 ,以棉铃虫体内的一种解毒
酶 一谷胧甘肤 一转移酶 为研究对象 ,从核酸与蛋白质水平分别检测新疆一枝篙的菇类与黄酮
提取物对 的诱导结果 。 拟解决的关键问题 为探明新疆一枝篙提取物对棉铃虫的毒杀机理 ,分别
用黄酮与菇类提取物处理 龄棉铃虫幼虫 ,研究分析棉铃虫体内 在 水平和蛋白质水平的表
达规律 。新疆一枝篙的黄酮与菇类提取物对棉铃虫都有毒杀效果 ,且在短时间和低浓度下就能诱导解
毒酶 的表达 ,在高浓度长时间时则会抑制 的表达 ,为新疆一枝篙提取物作为新型环保生物杀
虫剂提供新的素材 。
材料与方法
材 料
棉铃虫源自中国农业大学昆虫毒理室 ,已在室内饲养多年 。棉铃虫的饲养条件为 ℃,相对湿度
为 ,光照周期为 。成虫的饲养条件同幼虫 ,只是在饲养过程中为其提供 的蜂蜜
水 。实验所使用的棉铃虫均为初蜕皮的 龄幼虫 。
方 法
生物测定
将新疆一枝篙的菇类提取物以 、 、 、 和 岁 为梯度浓度加人棉铃虫饲料中 ,混合均匀
将新疆一枝篙的黄酮提取物以 、 、 、 和 扩 为梯度浓度加人棉铃虫饲料中 ,混合均匀 。
选用 龄棉铃虫幼虫 一 进行实验 ,每个浓度梯度处理下进行三次重复实验 ,每个重复
头棉铃虫 ,并以普通饲料饲养的 龄幼虫作为对照 ,分别于 及 后调查统计 ,根据死亡机率值
和浓度对数值 均计算毒力回归线 二 研 、相关系数 及 几。。
试虫诱导处理
分别以菇类提取物和黄酮提取物以不同的浓度和时间处理初蜕皮的 龄棉铃虫幼虫 ,实时荧光定
量 与酶联免疫吸附测定试虫 。
一 试虫的处理 分别将黄酮提取物以 、 岁 为浓度梯度 将菇类
提取物分别以 、 、 和 留 为浓度梯度加入棉铃虫饲料中混合均匀饲喂棉铃虫 后解剖 ,
取中肠放液氮中冻存备用 分别以黄酮 岁 ,菇类 扩 的浓度加人棉铃虫饲料中混合均
匀饲喂棉铃虫 、 和 后解剖中肠液氮冻存备用 设置使用普通饲料饲养的棉铃虫作为空白对照
组 ,解剖中肠存于液氮中冻存备用 。
酶联免疫吸附 测定试虫的处理 分别将黄酮提取物以 、 、 和 梦 为浓度梯
度 将菇类提取物分别以 、 、 和 酬 为浓度梯度加人棉铃虫饲料中混合均匀饲喂棉铃虫
后解剖中肠提取总蛋白备用 并以黄酮 扩 ,菇类 酬 的浓度加人棉铃虫饲料中混合
均匀饲喂棉铃虫 、 、 、 后解剖中肠 ,提取总蛋白备用 。设置使用普通饲料饲养的棉铃虫作为
空白对照 组 ,解剖中肠 ,提取总蛋白备用 。
总 提取与 合成
将不同处理组解剖好的棉铃虫肠从液氮中取出 ,用 法 提取总 。总 经过
期 何海等 棉铃虫中肠谷耽甘肤 一转移酶 对新疆一枝篙黄酮提取物和菇类提取物的响应
用紫外 可见分光光度计 一 精确定量后取 林 反转合成 ,
全部提取步骤依照 公司总 提取与 说明书。
实时荧光定量
采用实时荧光定量 来检测 基因与内参基因 的表达量 ,所用试剂盒为 公
司产品 。在 上查得棉铃虫 与 注册号 全长序列 ,用
软件设计两对引物用于实时定量 扩增 。表
表 棉铃虫 与 上下游引物序列
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、 们 ,
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在荧光定量 仪 中进行反应 。采用实时荧光定量 林 反应体系如下
林 , 林 染料 ,上下游混合引物共 林 ,无 酶水 林 。将构建好的
与 认 标准质粒分别用无 酶水以 、 、 , 、 、 , 、 、 , 为浓度梯度稀
释进行 反应绘制标准曲线 。实时荧光定量 扩增程序如下 ℃预变性 ℃ , ℃
, ℃ 读板 ℃ 读板 个循环 ,循环条件为 ℃ , ℃ , ℃ 最后 ℃
保温 。
棉铃虫 相对表达量是棉铃虫 表达量和内参 表达量的比值 ,用
下列公式计算 ,其中 为扩增效率 , 值为荧光信号达到设定的阑值时所经历的循环数 。将棉铃虫
相对表达量使用 软件单因素方差分析并绘图 。
靶基因的相对表达量 二 靶却 ■ 对照组 一样品组参照却 ■ 对照组 一样品组
酶联免疫吸附测定检测
采用间接 法检测不同处理组的蛋白样品。不同处理组的蛋白抗原以 林岁 包被 孔酶标
板 , 林 孔 , ℃过夜 ,经 酬 封闭后 , 洗涤 次 。各孔加人 稀释的带 标签的
小鼠抗血清 ℃孵育 , 洗涤 次 。各孔加人经稀释的辣根过氧化物酶标二抗 抗鼠 ℃
孵育 , 洗涤 次 。加人显色液与终止液后检测各孔 值。另设不加抗原蛋白 ,仅加人
一抗二抗孔位做空白对照 ,实验组 空白组 为可信值 川 。
数据分析
生物测定结果使用 软件分析 。 与 一 结果使用 软件单因素方差分
析并绘图 。
结果与分析
新孤一枝禽黄酮与菇类提取物对 龄棉铃虫的毒力
新疆一枝篙黄酮与菇类提取物对棉铃虫处理后毒力测定的结果表明 , 越小说明该提取物对棉
铃虫的毒力效应越大 。可以看出新疆一枝篙中黄酮与菇类提取物均对棉铃虫具有较好的毒杀效果 。无
论是 还是 的结果 ,新疆一枝篙菇类提取物对棉铃虫的 均为最低 ,其 时半致死浓度
气 仅为 盯 ,黄花篙 乓。为 岁 。这说明新疆一枝篙中菇类提取物在杀虫能力方
面强于其黄酮提取物 。此外 ,无论是黄酮还是菇类提取物对棉铃虫 与 的 相差不大 ,说明这
两种新疆一枝篙提取物对棉铃虫具有速杀性 。表
2258 新疆农业科学 卷
表 新疆一枝篙黄酮与菇类提取物对 龄棉铃虫的毒力测定
画 几祀 扮 一 加 月”匆`
时间 黄酮 菇类
毒力回归方程 二 二 二
相关系数 一
优阅 置信区间 一 一 一
毒力回归方程 娜 二
相关系数
与 以 置信区间 一 一
注 死亡机率值 浓度对数值
核酸水平上棉铃虫 对新疆一枝篙黄酮和菇类提取物的响应
棉铃虫中肠 在 水平上对黄酮提取物的响应
黄酮提取物对棉铃虫 龄幼虫 基因在 水平诱导的浓度效应表明 图 , 在
水平上的表达量随着黄酮提取物的浓度增加表现为先增加后降低的趋势 ,在 留 的黄酮提
取物处理棉铃虫 时 , 在 水平上的表达量达到最高阂值 ,与对照组相比较差异极显著 尸
黄酮提取物对棉铃虫 龄幼虫 基因在 水平诱导的时间效应表明 图 , 岁
浓度的黄酮处理棉铃虫 ,在 时开始诱导其 基因在 水平上的过量表达 ,在 时达
到最高阂值 ,与对照组相比较差异极显著 尸 ,诱导倍数可达 倍 ,在 时表达量下降 ,
基因的表达被抑制 。图
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注 小写字母不同者表示在 水平差异显著 ,相同则表示差异不显著
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图 新疆一枝篙黄酮提取物对棉铃虫 龄幼虫 基因在 水平诱导的浓度和时间效应
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菇类提取物处理棉铃虫 相对表达情况
褚类提取物处理棉铃虫的浓度效应表明 图 ,使用 岁 的菇类提取物处理棉铃虫
时 , 在 水平上的表达量达到最高值 ,与对照组相比差异极显著 尸 ,并且在浓度增加
到 扩 后转而抑制 基因的表达 菇类提取物处理棉铃虫的时间效应表明 图 ,使用
岁 浓度的菇类提取物处理棉铃虫在 时 , 在 水平的表达量开始增加 ,并且在
时表达量达到最高值 ,与对照组相比差异极显著 尸 ,在 时抑制了 基因的表达 。图
期 何海等棉铃虫中肠谷耽甘肤 一转移酶 对新疆一枝篙黄酮提取物和掂类提取物的响应
增长或外源物质浓度的增加 ,棉铃虫体内脂肪等能源物质消耗过度 , 解毒酶活性被抑制 ,无法再继
续发挥强力解毒作用 ,使棉铃虫死亡 ,这表明 对棉铃虫受到外源有毒物质侵害时的保护作用不是
无限的 ,它只能在一定的范围内起作用 。曾有人使用棉子酚处理棉铃虫 ,在棉铃虫另一类解毒酶系
中也观察到这一实验现象 〔, 〕。
在毒力反应中瓜 蛋白的表达变化取决于转录与翻译水平 ,因为蛋白质是基因功能的表现形式 ,
不管 在 水平变化有多大 ,如果没有 蛋白执行功能 ,棉铃虫幼虫是无法得到解毒酶的保
护的。所以 ,了解 的转录与翻译之间的动态关系是极其重要的 。酶联免疫吸附测定检测是从蛋白
水平上验证黄酮与菇类提取物对棉铃虫的毒杀机理 。从 的结果中发现 ,菇类提取物对棉铃虫
解毒酶基因在蛋白水平相对 水平上的响应在浓度效应上具有一定的相关性 都是在 酬
处理组达到最高表达倍数 ,但时间效应上具有一定滞后性 。菇类诱导棉铃虫 蛋白在 才
能有明显的诱导差异 ,在 之后会达到最高诱导倍数 倍 黄酮提取物对棉铃虫 解毒酶基因
在蛋白水平与 水平上的响应时间一样 ,但响应倍数则是 水平上较高 。可能的原因是
的 和蛋白质对外源有毒物质侵害的应答快慢程度是不同的。由于转录和翻译在时间上的先后
顺序 ,蛋白质表达的应答晚于转录是正常的 。这也许可以解释为基因水平的响应灵敏度超过蛋白水平 。
研究发现新疆一枝篙中黄酮与菇类提取物诱导棉铃虫三龄幼虫 水平与蛋白水平的表达量
增加趋势是一致的 ,说明黄酮与菇类提取物处理后 表达量的增加不是由于基因突变导致的。
结 论
新疆一枝篙作为新疆特有植物 ,生长环境高温干旱且盐碱性较大 ,这造就了其与内地植物不同的特
色 。研究已证明 ,新疆一枝篙的黄酮与菇类提取物对棉铃虫都有毒杀效果 ,且在短时间和低浓度下就能
诱导解毒酶 盯 的表达 ,在高浓度长时间时则会抑制 的表达 。其黄酮与菇类粗提物对棉铃虫的毒
杀效果较好 ,且对棉铃虫 解毒酶在基因水平和蛋白水平上都有一定的诱导作用 。这为将来新疆一
枝篙提取物作为植物杀虫剂的应用前景提供了理论依据 。但在实际生产应用过程中 ,很难直接从植物
本身来提取杀虫成分 。为了能更好地开发利用野生植物资源 ,防治棉田害虫 ,今后将继续纯化分离新疆
一枝篙菇类与黄酮提取物 ,具体了解是某种或某几种单体化合物在起杀虫作用 〕,然后将具有杀虫活
性的各个化合物有机的组合起来 ,为将来新型杀虫剂的研发以及工业化生产进一步奠定基础 。
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