全 文 ：第 47卷　第 4期　　　　　　　　　　　　　 武汉大学学报 (理学版 )　　　　　　　 Vo l. 47　 No. 4　
　 2001年 8月　　　　　　　　　　　　 J. Wuhan Univ . ( Nat. Sci. Ed. )　　　 　　 Aug. 2001, 449～ 452
文章编号: 0253-9888( 2001) 04-0449-04
α-萘酚胁迫对普通小球藻生长
及抗氧化酶活性的影响

彭金良 , 严国安 , 沈国兴 , 常利英 , 王　昀 , 杨方星
(武汉大学 资源与环境科学学院 ,湖北 武汉 430072)
　　摘　要: 研究了α-萘酚对普通小球藻的生长、光合色素和 M DA含量及抗氧化酶 ( SOD、 CAT、 POD)活性的影
响 . 结果表明 ,随着 α-萘酚浓度的升高 ,藻的生长速率、叶绿素 a与类胡萝卜素的含量 , SOD、 CAT、 POD活性均先
升高后下降 ,除 POD活性在 5. 00 mg· L- 1时达到最大值外 ,其余均在 2. 00 mg· L- 1达到最大 . 而在α-萘酚浓度
低于 2. 00 mg· L- 1时 , M DA含量变化不大 ,只有当 3种抗氧化酶活性呈不同程度的下降后 , M DA含量才急剧上
升 ,膜脂过氧化加剧 . 说明α-萘酚导致普通小球藻膜脂过氧化是其致毒机制之一 ,而抗氧化酶在一定污染物浓度
范围内具有防御保护作用 .
关　键　词: α-萘酚 ; 普通小球藻 ;生长速率 ;丙二醛 ;抗氧化酶
中图分类号: X 171. 5　　　文献标识码: A
　　α-萘酚是一种多环芳烃类 ( PAHs)有机污染物 ,
很多研究表明 PAHs主要通过光诱导致毒效应即
通过光促反应产生活性氧自由基或降解为活性中间
代谢产物而破坏细胞膜及细胞内其它大分子物质的
结构与功能 [1 ] . 已有报道主要集中在其对动物或细
菌的毒性效应上 [2 ] . 有关 PAHs对的藻类生长影响
亦有报道 [3 ] ,但其致毒机理尚不明确 ,本文通过α-萘
酚对普通小球藻生长速率、叶绿素 a与类胡萝卜素
( CAR)含量 ,丙二醛 ( MDA)含量及 3种抗氧化酶:
超氧化物歧化酶 ( SOD)、过氧化氢酶 ( CA T)、过氧
化物酶 ( PO D)影响的研究 ,以证明 PAHs对藻类的
活性氧致毒机理 ,并通过 SO D、 CAT、 POD的变化
揭示 3种抗氧化酶在清除细胞内活性氧成分、维持
细胞正常生理功能方面的作用 .
1　实验材料与方法
1. 1　实验材料
α-萘酚: 分析 纯 ,亭 新化工 厂 ; 二甲 亚砜
( DM SO):分析纯 ,上海凌峰化学试剂有限公司 ;硫
代巴比妥酸 ( TBA): 上海试剂二厂 ;氮蓝四唑
( NBT):前进试剂厂 ;蛋氨酸: GIBCO;核黄素: 上海
源聚生物科技有限公司 ;愈创木酚: 分析纯 ,天津试
剂一厂 .
普通小球藻 (chlorella vulgaris )由中科院水生
生物研究所淡水藻种库提供 .
1. 2　实验方法
1. 2. 1　藻类的培养
普通小球藻接种于 200 mL水生四号培养基 ,
培养温度 ( 24± 0. 5)°C,光照强度 2 500～ 3 000 lx,
连续 24 h光照 ,静置培养 ,每天摇动 3～ 5次 . 待藻
进入指数生长期即浓度达到 105～ 106个· mL- 1时
加入α-萘酚 ,设一对照及 5个浓度梯度: 1. 00, 2. 00,
5. 00, 10. 00, 20. 00 mg· L- 1 , 96 h后测各项指标 .
1. 2. 2　普通小球藻生长速率、叶绿素 a与类胡萝卜
素含量的测定
通过血球计数板及测藻液 OD65 0确定细胞数与
吸光值之间的关系: y= 0. 877+ 69. 14x , y为细胞数
( 10
5个· mL- 1 ) , x 为 650 nm处 ( 1 cm )藻液吸光
值 ,由公式 k= ( lnN 1 - lnN 0 ) /( T1 - T0 )计算生长速
收稿日期: 2000-07-05基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39870152)作者简介:彭金良 ( 1976-) ,男 ,硕士生 ,现从事细胞毒理学研究 .
DOI : 10. 14188 /j . 1671 -8836. 2001. 04. 017
率 ,其中 N 0 , N 1分别为起始和 T 1时间的细胞数 .
叶绿素 a与类胡萝卜素含量采用分光光度法测
定 ,丙酮黑暗抽提 24 h,测抽提液 663, 645, 440 nm
处吸光值 ,计算叶绿素 a与类胡萝卜素含量 .
1. 2. 3　酶液提取
一定藻液 4 000 g离心 10 min收集藻细胞 ,加
预冷 0. 05 mol· L- 1的磷酸缓冲液 ( MDA、 SOD、
CAT、 PO D缓冲液 pH分别为 7. 8, 7. 0, 7. 0, 5. 5)和
少量石英砂在 0～ 4°C条件下研磨 ,匀浆液 4 000 g
离心 10 min,上清液即为粗酶提取液 ,低温保存待
用 .
1. 2. 4　丙二醛含量测定
1 mL粗酶提取液加 2 mL 0. 5%硫代巴比妥酸
的 20%三氯乙酸溶液 [4 ] ,混合物于 100°C水浴加热
30 min,迅速冷却 , 1 800 g离心 10 min,上清液于
532 nm及 600 nm测吸光值 ,计算得每毫克蛋白所
对应的丙二醛含量 .
1. 2. 5　超氧化物歧化酶 ( EC1. 15. 1. 1)活力测定
2 mL反应介质包括: 50 mmol· L- 1 ( pH 7. 0)
磷酸缓冲液 [5 ] , 77. 12μmo l· L- 1 NBT, 0. 1 mmol·
L
- 1
EDT A, 13. 37 mmol· L- 1蛋氨酸 ,加 0. 1 mL核
黄素溶液 ( 80. 2μmo l· L- 1 ,用含 0. 1 mmo l· L- 1
EDTA的 50 mmo l· L- 1 , pH 7. 8的磷酸缓冲液配
制 ) . 于 560 nm测吸光值 ,定义每分钟每毫克蛋白
改变 A5600. 01单位为一个酶活力单位 .
1. 2. 6　过氧化氢酶 ( EC1. 11. 1. 6)活性测定
取粗酶提取液用碘量法滴定测酶活 . 定义每分
钟每微克蛋白分解 1μg H2O2为一个酶活力单位 .
1. 2. 7　过氧化物酶 ( EC1. 11. 1. 7)活性测定
反应体系: 1 mL 2% H2O2 , 1 m L 0. 05μmo l·
L
- 1愈创木酚 , 1 mL酶液 ,反应由加入 H2O2启动 ,
25°C时每分钟记录 A470变化 [ 6] ,定义每分钟每毫克
蛋白改变 A470 0. 01单位为一个酶活力单位 .
1. 2. 8　总蛋白测定
采用 Folin-酚法测定 [7 ] ,以牛血清蛋白作标准
曲线 .
2　结果与分析
2. 1　α-萘酚对普通小球藻生长速率、叶绿素 a和类
胡萝卜素含量的影响
α-萘酚对普通小球藻生长速率、叶绿素 a和类
胡萝卜素含量均有明显影响 (表 1) ,当α-萘酚浓度
为 1. 00、 2. 00 mg· L- 1时促进了普通小球藻的生
长 ,叶绿素 a和类胡萝卜素含量也有所升高 ,且都在
2. 00 mg· L- 1时达到最大值 ,分别较对照组高
29. 1%、 13. 8%和 24. 1% ,而在较高浓度下 ( 5. 00,
10. 00, 20. 00 mg· L- 1 ) ,普通小球藻的生长受到抑
制 ,生长速率明显下降 ,在 20. 00 mg· L- 1时只有对
照组的 29. 5% ,叶绿素 a和类胡萝卜素的含量也明
显下降 ,这可能是藻细胞数降低及叶绿素 a和类胡
萝卜素合成受影响的结果 .
表 1　不同浓度的 α-萘酚条件下普通小球藻的测试指标值
测试指标 c(α-萘酚 ) /mg· L- 1
0(对照组 ) 1. 00 2. 00 5. 00 10. 00 20. 00
生长速率 0. 220 0. 276 0. 284 0. 172 0. 165 0. 065
叶绿素 a /mg· ( g· 干重 )- 1 9. 012 9. 673 10. 254 8. 949 8. 641 7. 243
类胡萝卜素 /mg· ( g· 干重 ) - 1 2. 518 2. 641 3. 125 2. 349 2. 014 1. 859
2. 2　α-萘酚对普通小球藻丙二醛 (MDA)含量的影
响
丙二醛既是膜脂过氧化的产物 ,也可氧化对维
持细胞膜系统及蛋白质正常构象极为重要的— SH
基 ,其含量的高低可反映细胞膜脂过氧化的程度 .
结果如图 1所示 ,在低浓度α-萘酚 ( 1. 00, 2. 00, 5. 00
mg· L- 1 )胁迫下 ,普通小球藻 MDA含量变化不
大 ,但当 α-萘酚浓度为 10. 00 mg· L- 1时 MDA高
出对照组 79. 80% ,而 α-萘酚浓度为 20 mg· L- 1
时 ,更是高出对照组 113. 18% . 说明高浓度的α-萘
酚胁迫造成了普通小球藻膜脂化过氧化加剧 ,导致
细胞受到严重伤害 . 图 1　α-萘酚对普通小球藻丙二醛含量的影响
450 武汉大学学报 (理学版 ) 第 47卷
2. 3　α-萘酚对普通小球藻 SOD、CAT、POD活力影
响
在植物体内 , SOD、 CAT、 POD协同起保护作
用 , SOD歧化 O—·2 产生 H2O2 ,随后 H2O2再通过
CAT和 POD分解成 H2O和 O2 ,以消除活性氧的伤
害 .α-萘酚对普通小球藻 3种抗氧化酶的影响如图
2所示 ,在α-萘酚胁迫下 , 3种酶的变化趋势大体相
同 , SO D、 CAT在 1. 00, 2. 00, 5. 00 mg· L- 1 , POD
在 1. 00, 2. 00, 5. 00, 10. 00 mg· L- 1 α-萘酚浓度下
酶活性有不同程度的升高 ,最大值分别较对照组酶
活高 102. 69% 、 114. 66% 、 43. 78% . 而随着毒物浓
度的继续增大 , 3种酶的活力开始下降 ,可见普通小
球藻可以通过自身的防御酶系统对α-萘酚的胁迫
有一定的抗性 ,但这只限于一定的浓度范围 ,当 α-
萘酚浓度过高时 ,酶的合成及活性受到影响 ,降低了
普通小球藻清除活性氧的能力 ,造成细胞膜脂过氧
化而受到伤害 .
图 2　α-萘酚对普通小球藻 SOD、 CAT、 POD活性的影响
3　讨　论
有关 PAHs在低浓度下刺激藻类生长而高浓
度时却有抑制作用的研究已有报道 [8, 9 ] . Shubert等
认为这是藻类对有机污染物胁迫的可能反应之
一 [10 ] . 本文研究表明低浓度α-萘酚促进了普通小球
藻生长 ,其可能原因是α-萘酚胁迫激活了体内的某
些生理生化反应过程中相关酶的活性 ,促进了小球
藻的代谢和繁殖 ,同时 α-萘酚能作为生长碳源 ,被
藻体所吸收和利用 . 另外在相应α-萘酚浓度下 ,叶
绿素 a含量增加 ,提高了藻细胞光合作用水平 ,加快
了体内物质的合成 ,这也对小球藻的生长起了促进
作用 .
PAHs对藻类有明显的光诱导致毒效应 . 在光
激发下 , PAHs变成三重态的分子 ,它将能量传递给
氧 ,产生单线态氧 (’ O2 ) ,’ O2能与蛋白质中的氨基
酸、核酸中的碱基反应 ,亦能使不饱和脂肪酸氧化生
成脂质过氧化物 . 同时三重态的 PAHs参与光引发
的电子转移反应 ,形成具有反应活力及潜在毒性的
中间体 ,如超氧阴离子自由基 ,它能通过 H2O2形成
更活泼 ,氧化性更强的 HO , HO 与大多有机化合
物及许多无机离子反应 ,造成生物毒性或产生其他
毒性物质 . 此外 , PAHs还可产生光降解产物 ,部分
代谢物或中间物能与细胞内的大分子如 DNA,
RN A及蛋白质结合 ,影响其结构与功能 [11 ] . 而藻类
在有氧代谢过程中 ,产生氧自由基是必然的 ,而且一
般处在一种动态的平衡中 . 消除自由基对膜伤害的
关键是氧自由基的清除 ,在低浓度α-萘酚胁迫下 ,
虽然其体内 O—·2 产生加快 ,但并未造成积累 ,作为膜
脂过氧化程度标志的 MDA并未有大的变动 . 这主
要是 O—·2 及其它过氧化产物激活了藻体的酶抗性系
统与非酶抗性系统 ,清除了藻体内的活性氧 ,维持着
正常的生理功能 . 但当α-萘酚浓度较高时 ,其光降
解产生的活性氧或活性中间物 ,它们或直接作用于
膜上不饱和脂肪酸或通过影响酶的结构与功能及通
过作用于 DNA、 RNA影响蛋白质的合成等 ,造成细
胞内活性氧清除系统失活 ,不能有效的与 O—·2 等活
性氧建立新平衡 ,造成膜脂过氧化 . 这与实验所得
的当 CAR含量和 SOD、 CAT、 POD活性下降时 ,
M DA急剧上升相符 ,另外 MDA本身是一种能强烈
与细胞内各种成分反应的活性物质 ,它可引起对蛋
白质、酶和膜的严重损伤 ,最终导致膜结构与功能的
破坏 .
CAR和 SOD、 CAT、 POD等植物酶抗性系统
一起协同防御活性氧或其它过氧化物自由基对细胞
膜系统的伤害 ,抵抗逆境胁迫及防止细胞衰老 . 它
们的含量或活性都在一定 α-萘酚浓度范围内升高 ,
CAR含量、 SOD和 CA T活性在 2 mg· L- 1最高 ,
POD在 5 mg· L- 1达到最大 . 它们达到最大值时
α-萘酚浓度不同可能与它们的激活物及其本身性质
有关 . SOD是需氧生物普遍存在的一种含金属的
酶 ,是细胞内最重要的超氧阴离子自由基的清除
剂 .在逆境胁迫下 ,藻体中 O—·2 积累 ,从而诱导 SO D
活性迅速升高 ,歧化 O—·2 生成 H2O2 , H2O2由 CAT
加以清除 ,这两者协同作用将 O—·2 转变为 H2O和
O2 ,使藻细胞免遭伤害 . 图 2很好的反应了这种协
同关系 . POD是植物代谢的末端氧化酶之一 ,属植
物呼吸功能酶 ,它能催化分解逆境下产生的 H2O2
等过氧化物及α-萘酚降解产生的活性中间物 ,随着
POD底物浓度的增加 ,其活性也随之提高 ,且落后
451第 4期 　　　　　　彭金良 等: α-萘酚胁迫对普通小球藻生长及抗氧化酶活性的影响
于 SOD、 CA T达到最大值 ,但当 POD活性达到最
大值时 , M DA作为膜脂过氧化产物已有较大幅度
的提高 ,说明体内活性氧的清除是多种活性成分协
同作用的过程 . 当 CAR、 SOD、 CAT、 POD受胁迫
导致其合成或结构受破坏而引起含量与活力下降
后 ,藻清除活性氧的能力亦下降 ,使得 O—·2 、 H2O2及
HO 等的积累 ,进而引起膜脂过氧化 ,细胞膜被破
坏 ,这可从高浓度α-萘酚胁迫下 , M DA迅速升高可
以看出 . 本实验通过对 MDA、 CAR、 SOD、 CAT、
POD的研究 ,证明了α-萘酚可通过活性氧或其它过
氧化产物造成对普通小球藻的伤害 ,也证明了
CAR、 SOD、 CAT、 POD清除活性氧 ,维护藻细胞正
常生理功能是藻细胞抗逆境胁迫的重要途径之一 .
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The Effects ofα-Naphthol on the Growth and
the Antioxidase Activities of Chlorel la Vulgaris
PENG Jin-liang, YAN Guo-an, SHEN Guo-xing, CHANG Li-ying, WANG Yun, YANG Fang-xing
( Co llege o f Resour ces and Envir onment Science, Wuhan Univ ersity, Wuhan 430072, Hubei, China )
　　 Abstract: Deals wi th the impact of α-naphtho l on the grow th, chlo rophy ll a, ca ro tenoid, MDA and
the antio xidase of chlorella vulgaris . The resul ts indicated that , wi th the increasing o f the concentration of
α-naphtho l, the g row th rate, chlo rophyl l a content, carotenoid content and the activi ties o f SO D, CAT
and POD increased first and decreased af terwa rds, except POD ( 5. 00 mg· L- 1 ) , they reached their most
va lues a t 2. 00 mg· L- 1 . The MDA contents changed lit t le until the activi ties of SOD, CAT and PO D
decreased, the results show ed that the lipid peroxidant ag grega ted. It suggested tha t led up to lipid
peroxidant of chlorella vulgaris is one toxic mechanism o fα-naphthol, and only wi thin a cer tain limit , the
antio xidase had a po sitiv e protectiv e ef fect.
Key words: α-naphthol; chlorella vulgaris; g row th rate; malondialdehyde; antioxidase
452 武汉大学学报 (理学版 ) 第 47卷