全 文 ：山莨菪碱与旋覆花素及苦碟子对过度训练大鼠
肾组织上皮钙黏素表达的影响＊
＊　本课题为全军“十一·五”医药卫生科研基金资助项目(No.06MA071)①　白求恩国际和平医院肾脏病科 ,北京军区肾脏病研究诊疗中心　(石家庄　050082)
吴广礼①　黄旭东①
　　〔摘　要〕　目的:探讨过度训练大鼠肾组织上皮钙黏素表达的变化及山莨菪碱 、旋覆花素 、苦碟子干预的影响。方法:将
80 只雄性Wistar大鼠随机分为安静对照组(CN)、力竭运动组(ES)、山莨菪碱干预组(AD)、旋覆花素干预组(IB)、苦碟子干
预组(IS)。CN 组为安静对照;ES 组又根据力竭后恢复时间分为力竭即刻(ESI)、力竭后 6 h(ES 6 h)和力竭后 24 h(ES 24 h);
AD组 、IB 组 、IS 组均分别于力竭后 6 h 和力竭后 24 h 取材观察各项指标。每个时间点 8 只大鼠。采用大鼠游泳至力竭建立
过度训练模型。采用免疫组织化学法检测各组肾组织 E-Cadherin 蛋白表达的变化;采用 CMIAS 病理图像分析仪测量 E-
Cadherin 蛋白表达的平均光密度。结果:对照组大鼠肾组织有 E-Cadherin的丰富表达 , 广泛分布于肾小管上皮细胞膜上及
细胞浆内;力竭即刻 、6 h 及 24 h E-Cadherin 表达逐渐减弱(P <0.05)。山莨菪碱 、旋覆花素和苦碟子组大鼠肾组织 E-
Cadherin 表达比同期力竭组明显增强(P<0.05)。结论:过度训练可引起肾组织 E-Cadherin 的表达下调 , 山莨菪碱 、旋覆花
素和苦碟子干预后可逆转这种变化 ,这可能是过度训练引起急性肾损伤及上述 3 种药物减轻 OTIAKI的重要机制之一。
〔关键词〕　过度训练　急性肾损伤　钙黏素　山莨菪碱　旋覆花素　苦碟子
The Effects of Anisodamine , Inula Britannica and Ixeris Sonchifolia Hance
on the Expression of Renal Tissue E-Cadherin in Exhausted Rats
WU Guangli , HUANG Xudong
Renal Div ision , Bethune Internat ional Peace Hospital
of PLA , Shij iazhuang (050082)
　　ABSTRACT　Objective:To observ e the changes of the expression of renal tissue E-Cadherin and the influences of Aniso-
damine , I nula Britannica and Ixeris Sonchifolia Hance in overtraining-induced acute kidney injury(OTIAKI)rats , and to investigate
the role of E-Cadherin signal pathw ay in the development of OT IAKI.Methods:Eighty male Wistar rats were randomly divided in-
to five g roups:control g roup(CN , n=8), exhaustive sw imming(ES , n=24), Anisodamine(AD , n=16), Inula Britannica(IB , n =
16)and Ix eris Sonchifolia(I S , n=16).The rats of CN were quiet and no swimming.The rats of ES swimed to exhaustive state and
sacrificed at immediately(ESI), 6 hour(ES 6 h)and 24 hour (ES 24 h)after exhaustiv e swimming.The rats of AD received in-
traperitoneal injection of Anisodamine at the dose o f 10 mg/ kg body weight at 20 minutes before swimming and then swimed to ex-
haustiv e condition.The rats of IB took orally Inula Britannica at the dose of 25 ml/ kg body w eight at 24 h before swimming and then
swimed to exhaustive condition.The rats of IS receiv ed intraperitoneal injection of Ix eris Sonchifolia Hance at the dose of 20 g/ kg
body weight at 20 minutes befo re sw imming and then swimed to exhaustive condition.The rats of AD , IB and IS group were sacri-
ficed at 6 hour(AD 6 h , IB 6 h , I S 6 h)and 24 hour(AD 24 h , IB 24 h , IS 24 h)after exhaustive swimming.The animal model of
ov ertraining-induced acute kidney injury w as developed by exhaustive swimming.The expression of E-Cadherin in renal tissue
were observed by immunohistochemistry.Results:Immunohistochemistry staining showed that the obvious positiv e expressions of E
-Cadherin were observed in renal tubular epithelial cells of co tex and medullar area in CN rats.The expressions of E-Cadherin de-
creased prog ressively in ESI , ES 6 h , ES 24 h rats(P <0.05).The expressions of E-Cadherin increased remarkably in AD , IB and
IS rats compared with ES ra ts(P<0.05).Conclusion:Overtraining could induce the down-regulation of expressions of renal tissue
E-Cadherin.Pretreatment with Anisodamine , I nula Britannica and Ix eris Sonchifolia Hance could reverse the changes of expressions
of renal tissue E-Cadherin induced by exhaustive swimming.
KEY　WORDS　Overtraining　Acute kidney injury　E-Cadherin　Anisodamine　Inula britannica　Ixeris sonchifolia hance
　　过度训练可引起明显的肾脏损伤[ 1～ 3] ,但其损伤
机制尚未完全明了。文献报道 ,钙黏素信号途径在缺
血性急性肾损伤中发挥重要作用[ 4] 。上皮钙黏素
(E-Cadherin)是钙黏素信号途径中的关键分子 ,在上
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皮细胞极性 、细胞间黏附和屏障功能的形成和维持中
发挥重要作用[ 5 , 6] 。然而 ,有关过度训练致急性肾损伤
(overtraining-induced acute kidney injury ,OTIAKI)时肾
组织 E-Cadherin的表达变化尚未见文献报道 ,迄今
为止 ,OTIAKI 在临床上还缺乏有效的防治措施 。中
药作为传统医学的重要组成部分 ,具有多层次 、多靶
点防治疾病的优势。结合现代药理学及化学手段在
分子水平阐明其作用靶点 ,对实现中药的现代化和国
际化具有重要意义。山莨菪碱为天然植物 ,人工合成
品属抗乙酰胆碱药;旋覆花为菊科旋覆花属植物;苦
碟子为菊科苦荬菜属植物 ,分布于我国东北及内蒙古
等地 , 3 种药物均具有多种药理作用 , 极具开发价
值[ 7 ～ 9] 。本课题组最近的研究表明 ,山莨菪碱 、旋覆
花素和苦碟子可明显减轻过度训练引起的大鼠急性
肾损伤 ,但其作用的分子靶点尚未阐明[ 1 ～ 3] ,它们对
OTIAKI时肾组织 E-Cadherin表达的影响 ,文献尚
未见报道 。本研究观察了过度训练大鼠力竭后不同
时间肾组织 E-Cadherin表达的变化及山莨菪碱 、旋
覆花素和苦碟子干预的影响。
材料与方法
1　材料
1.1　实验动物　雄性 Wistar 大鼠 80 只 ,体重
200 ～ 220 g ,常规分笼喂养 ,由河北医科大学实验动物
中心提供 。
1.2　试剂与药品　E-Cadherin兔抗人多克隆
抗体由美国 Santa Cruz公司提供 。PV 免疫组化染色
试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供 。盐
酸消旋山莨菪碱注射液 ,由杭州民生药业集团有限公
司生产(批号:0409202);旋覆花素由河北医科大学药
学院药理研究室提供;苦碟子注射液由沈阳双鼎制药
有限公司生产(批号:20025449)。
2　方法
2.1　实验分组及处理　将大鼠随机分为对照组
(control , CN , n =8)、力竭运动组(exhaustive sw im-
ming ,ES , n=24)、山莨菪碱干预组(anisodamine ,AD ,
n =16)、旋覆花素干预组(inula britannica , IB ,
n=16)、苦碟子干预组(ixeris sonchifolia , IS , n =16)。
对照组大鼠未进行力竭运动;力竭组又根据力竭后恢
复时间分别于力竭即刻 、力竭后 6 h 和力竭后 24 h取
材观察各项指标的变化;山莨菪碱组于力竭运动前腹
腔注射山莨菪碱 10 mg/kg 后进行力竭运动;旋覆花
素组于力竭运动前 24 h给予旋覆花素 25 ml/kg 灌胃
后进行力竭运动;苦碟子组于力竭运动前腹腔注射苦
碟子 20 ml/kg 后进行力竭运动。3种药物干预组分
别于力竭后6 h及 24 h取材观察各项指标。每组8只
大鼠 。
2.2　过度训练动物模型的建立　按文献[ 1 ～ 3]报
道的方法自制 150 cm ×60 cm×80 cm 玻璃钢游泳池 。
采用大鼠游泳至力竭建立过度训练模型[单次力竭不
加负重 ,水深 70 cm ,水温(30±2)℃] 。力竭标准:(1)
沉入水底超过10 s;(2)游泳动作明显不协调;(3)捞出
后没有逃避反应 ,且放在平面上无法完成翻正反射 。
所有 ES组大鼠均达力竭标准 ,成模。
2.3　取材及标本收集　将各组大鼠使用乙醚麻
醉 ,腹正中切开 ,摘取双肾 ,纵形剖开 ,一半置入 4 ℃
4%多聚甲醛中固定 ,另一半置于-80 ℃冻存待用 。
标本于4%多聚甲醛中固定 2 h后 ,常规梯度浓度酒精
脱水 ,二甲苯透明 ,常规石蜡包埋。连续切片 6 ～ 8张 ,
厚度 4 μm ,用涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片 , 52 ℃烘
烤 48 h ,备用。
2.4　肾组织病理学观察　肾组织常规切片行
HE染色 ,应用日本奥林巴斯 AHB-2-HL 光学显微
镜观察各组大鼠肾脏组织结构的改变。
2.5　免疫组织化学法检测肾组织 E-Cadherin
的表达　4 μm切片 ,常规脱蜡水化 ,一抗为 E-Cad-
herin兔抗人多克隆抗体 ,二抗为生物素化羊抗兔或鼠
IgG(1∶100)稀释 ,以 PBS 代替一抗作为阴性对照 ,
DAB显色 ,光镜观察阳性信号 。应用北航图像分析系
统测定肾组织 E-Cadherin表达的平均光密度。光镜
下每组分析 6个标本 ,每个切片随机选取 5个高倍视
野(×400)进行分析 。
3　统计学方法 　实验数据用( x ±s)表示 ,用
SPSS 12.0软件包进行统计学分析 ,组间差异用单因
素方差分析(one w ay ANOVA), 有统计学差异者用
Newman-Kuels q检验进行两两比较 ,以 P<0.05为
有统计学差异。
结　　果
1　过度训练大鼠肾组织病理学变化及山莨菪
碱 、旋覆花素和苦碟子的影响 　光镜观察发现 ,力竭
即刻和力竭后 6 h 大鼠肾组织结构变化轻微 ,可见部
分肾小球囊及肾小管扩张 ,在皮髓质交界处及髓质小
血管内可见大量红细胞堆积;力竭后 24 h 大鼠可见肾
小管上皮细胞刷状缘不规整 ,部分脱落 ,肾小管管腔
内可见颗粒管型和透明管型 ,在皮髓质交界处及髓质
可见大量细胞的细胞核深染 ,有固缩现象 ,间质可见
浸润细胞。山莨菪碱 、旋覆花素及苦碟子 6 h 及 24 h
组大鼠肾组织病变与同时间点力竭组比较明显减轻 ,
仅见肾小管上皮细胞轻度水肿 ,肾小球及间质未见明
显病理变化 。
2　过度训练对大鼠肾组织 E-Cadherin 表达的
影响　免疫组化显示 ,对照组大鼠肾组织有 E-Cad-
herin的丰富表达 ,广泛分布于皮质及髓质的肾小管上
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皮细胞膜上及细胞浆内 ,DAB显色为深棕色;力竭后
即刻 、6 h 及 24 h肾组织 E-Cadherin表达逐渐减弱 ,
染色强度减弱 ,阳性分布区域减少(见图 1)。图像分
析结果显示 ,大鼠于力竭后即刻肾小管上皮细胞 E-
Cadherin表达明显减弱(P<0.05),力竭后 6 h 及 24 h
E-Cadherin表达减弱更加明显(P <0.05)。见表 1。
3　山莨菪碱 、旋覆花素和苦碟子对过度训练大
鼠肾组织 E-Cadherin表达的影响　与同期力竭组比
较 ,山莨菪碱 、旋覆花素和苦碟子组大鼠肾组织 E-
Cadherin表达明显增强(见图 1)。图像分析结果显
示 ,3种药物组大鼠肾组织 E-Cadherin 表达均显著
增高达对照组水平(P <0.05)。见表 1 。
表 1　各组大鼠肾组织 E-cadherin 表达的变化　( x ±s , n =8)
组别 力竭前 力竭即刻 力竭后 6 h 力竭后 24 h
对照组　　 0.155±0.013 — — —
力竭组　　 — 0.116±0.008＊ 0.084±0.009＊ 0.062±0.014＊☆
山莨菪碱组 — — 0.146±0.010■ 0.151±0.010■
旋覆花素组 — — 0.144±0.005■ 0.156±0.004■
苦碟子组　 — — 0.139±0.007■ 0.152±0.006■
　注:与对照组比较 , ＊P <0.05;与力竭 6 h组比较 , ☆P<0.05;与同时间点力竭组比较 , ■P<0.05
讨　　论
过度训练致急性肾损伤已成为危害人类健康的
重要疾病。然而 ,长期以来 ,由于对 OTIAKI 缺乏全
面认识 , 使 OTIAKI 的临床诊断和治疗水平难于提
高。深入研究 OT IAKI 的发病机制并进而寻找新的
治疗靶位点是提高 OTIAKI 临床防治水平的前提和
基础 。
有关过度训练致急性肾损伤机制的研究很少 。
Maeda等[ 10]报道 ,剧烈运动可增加肾组织中的肾素血
管紧张素活性 ,引起肾血管收缩 ,造成肾血流量下降 。
我们以往的研究表明 ,力竭即刻大鼠血浆 Ang Ⅱ明显
增高 ,之后则逐渐降低 ,至力竭后 24 h恢复到对照组
水平;而力竭后即刻至力竭后 24 h大鼠肾组织 AngⅡ
进行性增高 , 且与肾组织细胞凋亡率呈明显正相
关[ 11] 。这些结果提示 ,过度训练大鼠血浆 AngⅡ浓度
的变化主要参与力竭后早期肾损伤的发生 ,而肾组织
中Ang Ⅱ的增加在力竭后延迟性肾损伤中发挥重要
作用。本研究表明 ,游泳至力竭大鼠肾组织结构有明
显改变 ,可见肾小管上皮细胞刷状缘不规整 ,部分脱
落 ,小管腔内可见颗粒管型和透明管型 ,在皮髓质交
界区及髓质可见大量细胞的细胞核深染 ,有固缩现
象 ,提示有明显的细胞凋亡 。电镜观察显示 ,力竭后
大鼠肾小球滤过膜足突融合 ,近曲小管微绒毛排列稍
紊乱 ,上皮细胞质明显水肿 ,线粒体大部或全部嵴和
膜融合或消失 ,粗面内质网有脱颗粒现象[ 12] 。但关于
过度训练致大鼠肾小管上皮细胞损伤的机制尚未阐
明。钙黏素信号途径在过度训练致急性肾损伤中的
作用 ,文献尚未见报道 。为此 ,本文观察了钙黏素信
号途径中的关键分子上皮钙黏素(E-Cadherin)在过
度训练大鼠肾组织中的表达变化。
E-Cadherin 是钙依赖的细胞黏附分子 ,在上皮
细胞极性 、细胞间黏附和屏障功能的形成和维持中发
挥关键作用[ 5 ,6] 。正常情况下 ,E-Cadherin在髓质区
远端小管和集合管有丰富表达[ 13] 。本研究则发现 ,在
皮质和髓质区的肾小管均有丰富表达。蛋白激酶 C
可调节 E -Cadherin 的内噬和再循环[ 14] , E -Cad-
herin与 Catenin的复合物介导细胞与细胞的黏附 ,保
持细胞的极性[ 15] ;E-Cadherin的 EC1域的凸凹区的
多肽能抑制 Cadherin与 Cadherin的相互作用 ,引起细
胞侧面连接的开放[ 16] 。文献还表明 ,在缺血和 ATP
耗竭时 ,犬肾上皮细胞 E-Cadherin明显丢失 ,细胞极
性丧失 , 细胞间连接破坏[ 4] 。研究发现 , 肾缺血后
E-Cadherin的丢失 ,伴随着约 80 kD 片段的出现和
聚集 , 说明上皮细胞极性的维持和产生取决于
E-Cadherin介导的细胞之间的黏附 , E -Cadherin 的
快速降解及从其黏附连接中分离是缺血引起上皮细胞
损伤的关键步骤[ 4] 。进一步的研究表明 , E-Cadherin
的快速降解及其从黏附连接中分离不被主要的蛋白
水解通路的抑制剂和细胞间钙的螯合而抑制 ,而是通
过细胞凋亡途径的激活 ,由Caspase 介导产生[ 17] 。本研
究结果显示 ,力竭后即刻肾小管上皮细胞 E-Cadherin
表达明显减弱 ,力竭后 6 h及 24 h E-Cadherin 表达
减弱更加明显 ,这些结果与肾组织形态学损伤平行 ,说
明过度训练可通过下调肾小管上皮细胞 E-Cadherin
的表达引起急性肾损伤 ,这为 OTIAKI 的防治提供了
新的分子靶位点 。
山莨菪碱为天然植物 ,人工合成品属抗乙酰胆碱
药 ,具有多种药理作用 。文献报道 ,山莨菪碱可减轻
缺血造成的急性肾损伤[ 7] 。旋覆花(Flos Inulae)为菊
科旋覆花属植物 ,始载于《神农本草经》 ,是一种有重
大开发价值的药用植物 。最近的分子药理学研究表
明 ,从旋覆花中提取的活性成分均有很强的抗氧化和
抗炎作用[ 8 , 18 ,19] 。苦碟子为菊科苦荬菜属植物 ,具有
多种药理作用 ,极具开发价值。最近 , Lu等[ 20]在细胞
水平证实从苦碟子中提取的 6种类黄酮成分均可抑
制过氧化物的产生。本课题组最近的研究也显示 ,应
用山莨菪碱 、旋覆花素及苦碟子后 ,大鼠力竭后一般
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情况及肾功能明显改善 ,肾组织结构损伤明显减轻 ,
肾组织凋亡的细胞明显减少[ 1 ～ 3] ,说明 3种药物均可
减轻过度训练引起的大鼠急性肾损伤。本研究结果
显示 ,山莨菪碱 、旋覆花素和苦碟子均可上调力竭大
鼠肾小管上皮细胞 E-Cadherin的表达 ,说明 3 种药
物均能通过调控钙黏素信号途径逆转过度训练引起
的肾组织 E-Cadherin的表达变化 ,进而减轻了肾小
管上皮细胞的损伤。但山莨菪碱 、旋覆花素和苦碟子
调控钙黏素信号途径的确切机制尚有待进一步研究。
(本文图见插页 1-2)
参　考　文　献
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(收稿:2008-07-19　修回:2008-09-01)
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