全 文 ：旋覆花素及苦碟子对过度训练大鼠肾组织
细胞凋亡调控基因的影响＊
＊　本课题为全军“十一五”医药卫生科研基金资助项目(No.06MA071)①　白求恩国际和平医院肾脏病科 ,北京军区肾脏病研究诊疗中心　(石家庄　050082)②　河北省人民医院　(石家庄　050001)③　河北医科大学基础医学院生物化学和分子生物学研究室　(石家庄　050001)
吴广礼①　黄旭东①　容俊芳②　温进坤③　韩　梅③
　　〔摘　要〕　目的:观察旋覆花素及苦碟子对过度训练大鼠肾组织细胞 Bax 和 Bcl-2 的表达以及 Bax/Bcl-2比值变化的
影响 ,探讨上述二种药物抗肾组织细胞凋亡的分子机制。方法:采用大鼠游泳至力竭建立过度训练模型 , 将大鼠随机分为安
静对照组 、力竭运动组(力竭 6 h 、力竭 24 h)、旋覆花素防治组(旋覆花素 6 h 、旋覆花素 24 h),苦碟子防治组(苦碟子 6 h、苦碟
子 24 h)。采用免疫组织化学方法检测大鼠肾组织 Bax 、Bcl-2 蛋白的表达;采用 CMIAS 病理图像分析仪测量 Bax 、Bcl-2 蛋
白表达的平均光密度。结果:力竭后 6 h 及 24 h 大鼠肾组织 Bax的表达增强(P <0.05), Bcl-2的表达减弱(P<0.05), Bax/
Bcl-2比值明显增高(P<0.05);旋覆花素和苦碟子 6 h及 24 h 组大鼠与同期力竭组比较, Bax 的表达减弱(P<0.05), Bcl-2
的表达增高(P<0.05), Bax/ Bcl-2 比值降低(P<0.05)。结论:旋覆花素和苦碟子均可通过调节 Bax、Bcl-2 及 Bax/ Bcl-2
比值而起到抗过度训练大鼠肾组织细胞凋亡的作用。
〔关键词〕　过度训练　肾脏　细胞凋亡　Bcl-2　Bax　旋覆花素　苦碟子
Effects of Inula Britannica and Lxeris Sonchifolia Hance on Regulatory Genes of
Renal Cell Apoptosis in Overtraining Rat by Exhaustive Swimming
WU Guangli , HUANG Xudong , RONG Junfang , et al
Department of Nepherology ,Bethune Internat ional Peace Hospital , Shi jiazhuang (050082)
　　ABSTRACT　Objective:To understand the effects of Inula Britannica and Lxeris Sonchifolia Hance on the changes of expres-
sion of apoptosis regulato ry genes Bcl-2 and Bax in kidney tissue in exhausted rats.Methods:The animal model of acute kidney in-
jury induced by overtraining were developed by exhaustive swimming.56 male wistar rats w ere randomly divided into sedentary con-
trol group , exhaustive swimming g roup(at 6 hour , 24 hour after exhaustive ra t), I nula Britannica g roup(at 6 hour , 24 hour after ex-
haustiv e rat)and Lxeris Sonchifolia Hance(at 6 hour , 24 hour after exhaustiv e rat).The expression of Bax and Bcl-2 were tested
by immunohistochemical staining and CMIAS image analysis sy stem.Results:The expression of Bax was stronger , the expression of
Bcl-2 w as weaker , the Bax/ Bcl-2 ratio increased remarkably at 6 hour and 24 hour after exhaustive swimming.After treatment of
Inula Britannica and Lxeris Sonchifolia Hance , compared with that of control rats , The expression of Bax decreased remarkably , the
expression of Bcl-2 increased significantly , the Bax/Bcl-2 ratio decreased remarkably.Conclusion:Inula Britannica and Lxeris
Sonchifolia Hance could have the obvious anti- apoptosis effect of renal cell by regula ting the expression of Bax , Bcl-2 and the Bax/
Bcl-2 ratio.
KEY　WORDS　Overtraining　Kidney　Apoptosis　Bax　Bcl-2　Inula britannica lxeris　Sonchifoli a hance
　　本课题组最近的研究显示 ,肾组织细胞凋亡既是
过度训练引起急性肾损伤(overt raining -induced
acute kidney injury , OTIAKI)的特征和细胞学基础 ,
也是其发生的原因和药物作用靶点[ 1 ～ 3] 。细胞凋亡
的发生和发展可分为三个阶段:(1)起始期 ,细胞通过
不同途径接收到多种与凋亡有关的信号;(2)整合期 ,
多种起始信号在此整合 ,细胞做出生存或死亡的决
定;(3)执行期 ,一旦做出死亡的决定 ,即将进入一个
不可逆的生理过程 ,导致细胞凋亡 。Bcl-2家族的成
员是高等动物中在其整合期决定细胞生存和死亡信
号至关重要的调控基因和整合因子。研究表明 ,Bcl-2
家族成员 Bax 与 Bcl-2的相互作用是 Bcl-2基因家
族对细胞凋亡调控的中心环节 , Bax 与 Bcl-2比值的
大小决定细胞凋亡发生的走向[ 4] 。最近 ,文献报道 ,
旋覆花素及苦碟子可抑制过度训练诱发的肾组织细
胞凋亡[ 1 ～ 3] 。然而 ,有关旋覆花素和苦碟子抗过度训
练致肾组织细胞凋亡的机制尚未阐明。本文观察了
旋覆花素 、苦碟子对过度训练大鼠肾组织 Bcl-2家族
抗凋亡蛋白 Bcl-2 、促凋亡蛋白 Bax 的表达以及 Bax/
Bcl-2比值变化的影响 ,探讨上述二种药物抗肾组织
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细胞凋亡的分子机制 。
材料与方法
1　材料
1.1　实验动物　雄性 Wistar 大鼠 56 只 ,体重
200 ～ 220 g ,常规分笼喂养 。由河北医科大学实验动
物中心提供。
1.2　试剂与药品　旋覆花素由河北医科大学药
学院药理研究室提供;苦碟子注射液由沈阳双鼎制药
有限公司生产(批号:20025449);Bax 兔单抗 IgG购于
美国 Santa Cruz公司;Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体购于
美国 Santa Cruz公司;PV 免疫组化染色试剂盒由北
京中杉金桥生物技术有限公司提供 。
2　实验方法
2.1　实验分组　将 56只雄性Wistar 大鼠随机
分为安静对照组(control ,CN , n=8)、力竭运动组(ex-
haustive swimming ,ES , n=16)、旋覆花素干预组(inu-
la britannica , IB , n =16)、苦碟子干预组(ixeris sonchi-
folia , IS , n=16)。ES 组又根据力竭后恢复时间分为
力竭后 6 h(ES 6 h)和力竭后 24 h(ES 24 h);IB组于
力竭运动前 24 h分 3次口腔灌入旋覆花素 25 ml/kg
(含ABL 65 mg/kg)后进行力竭运动 ,分为 IB 6 h和
IB 24 h 组;IS 组于力竭运动前20 min腹腔注射苦碟子
注射液 20 g/kg(含总黄酮8 mg/kg和腺苷0.05mg/kg)
后进行力竭运动 ,分为 IS 6 h 和 IS 24 h组 。每个时
间点 8只大鼠。
2.2　过度训练动物模型的建立　按文献[ 1 ～ 3]报
道的方法自制 150 cm×60 cm×80 cm 玻璃钢游泳池 。
采用大鼠游泳至力竭建立过度训练模型[单次力竭不
加负重 , 水深 70 cm , 水温(30±2)℃] 。力竭标准:
(1)沉入水底超过 10 s;(2)游泳动作明显不协调;
(3)捞出后没有逃避反应 ,且放在平面上无法完成翻
正反射。所有 ES组大鼠均达力竭标准 ,成模 。
2.3　取材及标本收集　将各组大鼠使用乙醚麻
醉 ,腹正中切开 ,摘取双肾 ,纵形剖开 ,一半置入 4 ℃
4%多聚甲醛中固定 ,另一半置于 -80 ℃冻存待用 。
标本于 4%多聚甲醛中固定 2 h后 ,常规梯度浓度酒
精脱水 ,二甲苯透明 ,常规石蜡包埋。连续切片 6 ～
8张 ,厚度 4 μm ,用涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片 ,
52 ℃烘烤 48 h ,备用。
2.4　检测肾组织 Bax 、Bcl-2蛋白的表达　采用
免疫组织化学方法(PV法)检测大鼠肾组织 Bax 、Bcl-2
蛋白的表达 。切片厚 4 μm ,常规脱蜡水化 ,一抗为兔
抗鼠 Bax 和 Bcl-2多克隆抗体 ,滴加辣根过氧化物酶
标记的二抗 ,以 PBS代替一抗作为阴性对照 , DAB显
色 ,光镜观察阳性信号。
2.5　图像分析　采用 CM IAS 病理图像分析仪
测量 Bax 、Bcl-2蛋白表达的平均光密度 。光镜下低
倍视野(×100)先观察反应情况 ,每组分析 6 个标本 ,
每个切片随机选取 5个高倍视野(×400)进行分析 。
平均光密度值(MOD)是单位面积的光密度值即积分
光密度值(IOD)除以所测量的面积 , IOD是指光密度
值和所测面积内的阳性面积的积。一般认为 MOD能
较准确的反映阳性产物颜色深浅的平均状况 。
3　统计学方法 　实验数据用( x ±s)表示 ,用
SPSS 12.0软件包进行统计学分析 ,组间差异用单因
素方差分析(one w ay ANOVA), 有统计学差异者用
Newman-Kuels q检验进行两两比较 ,以 P<0.05为
有统计学意义。
结　　果
1　各组大鼠肾组织 Bax 表达的变化　免疫组化
显示 ,对照组中 ,肾组织可见少量 Bax 阳性染色颗粒 ,
主要存在于皮质和髓质的肾小管上皮细胞胞浆内 ,肾
小球中未见明显阳性表达。力竭组大鼠肾小管上皮
细胞胞浆内 Bax 的表达增多 、增强 ,呈不均匀颗粒状 。
旋覆花素 、苦碟子组大鼠肾小管上皮细胞胞浆内 Bax
的表达比同期力竭组减少 、减弱 ,但仍比对照组表达
增多。见图 1 。
2　各组大鼠肾组织 Bcl-2表达的变化　免疫组
化显示 ,对照组大鼠肾小管上皮细胞胞浆内普遍有丰
富的 Bcl-2阳性表达 ,肾小球中也有少量阳性表达 ,
呈不均匀颗粒状 。力竭组大鼠肾小管上皮细胞胞浆
内 Bcl-2的表达减少 、减弱 。旋覆花素 、苦碟子组大
鼠肾小管上皮细胞胞浆内 Bcl-2的表达比同期力竭组
增多 、增强 ,肾小球中也可见阳性染色颗粒 。见图 2。
3　原位半定量检测肾组织 Bax 、Bcl-2蛋白的表
达及 Bax/Bcl-2比值的变化　图像分析结果显示 ,力
竭后 6 h及 24 h组大鼠肾组织 Bax 的表达增强(P<
0.05),Bcl-2的表达减弱(P <0.05), Bax/Bcl-2比
值增高明显(P<0.05);旋覆花素 、苦碟子 6 h及 24 h
组大鼠与同期力竭组比较 , Bax 的表达减弱(P <
0.05),Bcl-2表达增高(P <0.05), Bax/Bcl-2 比值
降低(P <0.05)。见表 1。
讨　　论
急性肾损伤时 ,细胞坏死一旦启动一般很难逆
转 ,而凋亡是一种程序性细胞死亡 ,抑制该过程的某
一环节就有可能抑制凋亡的继续发展 ,从而抑制或逆
转急性肾损伤的进展[ 5] 。研究表明 ,肾组织细胞凋亡
是 OTIAK I的重要发病机制 ,抑制肾组织细胞凋亡可
减轻 OTIAKI ,提示对引起肾组织细胞凋亡的各个环
节进行及时干预 ,无疑对 OTIAKI 的防治具有重大意
义[ 1 ～ 3] 。最近的研究证明 ,旋覆花素和苦碟子均能通
过抑制力竭大鼠肾组织细胞凋亡 ,进而对 OTIAKI 起
到明显的肾脏保护作用[ 3] ,但其确切的分子作用靶点尚
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表 1　各组大鼠肾组织 Bax、Bcl-2 及 Bax/ Bcl-2 比值的变化　(n =8 , x±s)
组别 Bax Bcl-2 Bax/ Bcl-2
CN 组
ES组
IB组
IS组
力竭前 0.094±0.012 0.151±0.012 0.620±0.021
力竭后 6 h 0.186±0.011＊ 0.125±0.009＊ 1.500±0.063＊
力竭后 24 h 0.221±0.013＊ 0.136±0.011＊ 1.628±0.051＊
力竭后 6 h 0.146±0.011＊■ 0.156±0.011■ 0.940±0.032＊■
力竭后 24 h 0.148±0.012＊■ 0.162±0.012＊■ 0.912±0.031＊■
力竭后 6 h 0.161±0.013＊■ 0.140±0.013■ 1.158±0.053＊■
力竭后 24 h 0.180±0.010＊■ 0.151±0.011＊■ 1.256±0.032＊■
　注:与 CN 组比较 , ＊P<0.05;与 ES组比较 , ■P <0.05
不清楚。
研究表明 ,旋覆花属植物中主要的化学成分为萜
类化合物 、黄酮类化合物及有机酸类化合物等 ,具有
活血化瘀的作用。旋覆花的活性成分二氢棉菊素可
直接抑制 NF -κB的活性 ,阻断 I-κB的降解 ,进而抑
制NF-κB 的核易位 ,这些变化使 iNOS 和 COX-2
基因表达受到抑制 ,而 iNOS 和 COX-2 基因的表达
在炎症信号转导通路中发挥重要的作用 ,说明其具有
明显的抗炎作用[ 6] 。苦碟子(抱茎苦荬菜)全草是菊
科 2年生草本植物 ,苦碟子注射液是提取苦碟子全草
有效成分精制而成的中药注射剂 ,其主要成分为腺苷和
黄酮类物质 ,具有活血化瘀及清除自由基抗氧化作用。
Bcl-2 家族成员 Bax 与 Bcl -2 的相互作用是
Bcl-2基因家族对细胞凋亡调控的中心环节 ,当 Bax
同源二聚体形成 ,便诱导细胞凋亡 ,而 Bcl-2过量时 ,
形成 Bcl-2同源二聚体和 Bcl -2/Bax 异源二聚体 ,
减少 Bax 同源二聚体的形成并抑制其促凋亡作用[ 4] 。
研究表明 ,应用 Phosphoinosi tol 3抑制剂能增加Bcl-2
蛋白进而抑制肾上皮细胞凋亡[ 7] ;Adenovovirus vector
明显提高 Bcl-2/Bax 比值 ,抑制近曲小管和远曲小管
上皮细胞凋亡 ,改善肾功能 ,减轻了因缺血再灌注引
起的氧化损伤[ 8] ;应用 Bcl-2合成多肽微注射入 LLC
-PK1细胞可抑制细胞凋亡 ,而应用 Bax 合成多肽可
促进细胞的凋亡[ 9] 。说明 Bax/Bcl-2比值的大小决
定细胞凋亡发生的走向。本研究结果显示 ,力竭后6 h
和24 h组大鼠肾组织Bax 的表达增强 ,Bcl-2的表达
减弱 ,Bax/Bcl-2比值增高 ,说明Bax 与Bcl-2共同调
控过度训练致肾组织细胞凋亡的发生。本研究结果
还表明 ,过度训练大鼠应用旋覆花素 、苦碟子后 ,肾组
织Bax 的表达减弱 , Bcl -2的表达增高 , Bax/Bcl-2
比值降低。Bcl-2的表达增高可抑制 Bid 的裂解 ,进
而抑制了细胞的凋亡 ,还可抑制 Fasl/Fas介导的细胞
毒性[ 10] ;在肾小管上皮细胞的氧化损伤中 ,Bcl-2可
通过影响 Caspase-3和 Caspase-9 的激活而抑制细
胞的凋亡[ 11] 。
本研究结果说明旋覆花素和苦碟子可通过调节
Bax 、Bcl-2及 Bax/Bcl-2 比值对过度训练大鼠起到
抗肾组织细胞凋亡的作用 ,这可能是旋覆花素及苦碟
子抑制过度训练诱发肾组织细胞凋亡的重要分子机
制 ,但关于过度训练致肾组织细胞凋亡发生的细胞内
信号转导机制及二种药物的影响还有待进一步研究。
(本文图见插页 1-2)
参　考　文　献
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(收稿:2007-11-10　修回:2008-03-18)
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