全 文 ：向秋玲.铁苋菜不同溶剂提取物抑菌作用的研究 [ J] .江苏农业科学 , 2010(4):360-362.
铁苋菜不同溶剂提取物抑菌作用的研究
向秋玲
(常德职业技术学院医学系 ,湖南常德 415000)
　　摘要:对铁苋菜提取物的抗菌作用进行了研究 ,应用水 、醇(甲醇 、乙醇)和乙酸乙酯对其有效成分进行提取 , 采用
滤纸片抑菌法和二倍稀释法 ,以大肠杆菌等 7种细菌为供试菌种 , 对铁苋菜不同溶剂提取液的抑菌作用进行了研究。
发现各种提取液对大肠杆菌和白色念珠球菌均无抑菌作用 , 醇提液对枯草芽孢杆菌和普通变形杆菌也无抑菌作用;不
同的提取液对藤黄八叠球菌的抑菌效果都是最好的 , 其次是对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌;各种提取液相比 ,一般以
水提液的抑菌效果最好;在不同浓度的乙醇提取液中 ,一般以 90%乙醇提取物的抑菌效果最好;不同提取物对不同细
菌最低抑菌浓度不同 ,其中以乙酸乙酯提取液对藤黄八叠球菌的最低抑菌浓度最低(0.015 625g/mL)。
　　关键词:铁苋菜;供试菌种;提取液;抑菌作用;提取剂
　　中图分类号:Q501　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)04-0360-02
收稿日期:2009-12-02
作者简介:向秋玲(1979—),女 ,湖南怀化人 ,硕士 ,助教 ,研究方向为
天然产物的提取与分离。 E-mail:px2007l@ 163.com。
　　铁苋菜(AcalyphaaustralisL.),为大戟科铁苋菜属植物 ,
别名海蚌含珠 、人苋 、血见愁 , 夏 、秋季采割 ,除去杂质 ,晒干
备用 。铁苋菜味苦 、涩 ,性凉;主要含有黄酮、生物碱 、鞣质 、铁
苋菜素 、没食子酸 、胡萝卜素 、谷甾醇等有效成分 [ 1] ,有清热
利湿 、凉血解毒 、止血的功效 。铁苋菜浸出汁含黄酮类物质 ,
有较强的抗氧化作用 ,能清除人体内的超氧阴离子自由基 ,具
有抗衰老 、增强机体免疫力等功能 [ 2 ] 。铁苋菜体外抗菌试验
发现 ,其对金黄色葡萄球菌 、伤寒杆菌 、甲型副伤寒杆菌 、绿脓
杆菌等均有较高抗菌作用 ,特别是对溶血性金黄色葡萄球菌
有更明显的作用 [ 3] 。本试验对铁苋菜提取物的抑菌作用进
行研究 ,首先利用水 、醇(甲醇 , 50%、70%和 90%的乙醇 )和
乙酸乙酯并辅助以超声波提取铁苋菜中的有效成分 ,然后用
滤纸片法进行抑菌试验 ,对具有较好抑菌作用的提取物采用
二倍稀释法进行最低抑菌浓度的测定 ,从而为开发利用铁苋
菜提供科学依据 。
1　材料与方法
1.1　材料 、仪器与试剂
1.1.1　试验材料　铁苋菜 (AcalyphaaustralisL.)采集于湖
南省双牌县 ,经鉴定为大戟科铁苋菜属植物。
1.1.2　试验仪器及试剂　立式压力蒸汽灭菌器 (YXQ-LS
-50S1型 ,上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、摇床(ZH-
WY200B型 ,上海智城分析仪器制造有限公司)、电热恒温培
养箱(DHP-2000型 ,天津市华北试验有限公司)、水平层流
净化工作台(江苏苏州洁净技术研究所制造 )、SHZ-Ⅲ型循
环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)、旋转蒸发器(RE-52AA
型 ,上海亚荣生化仪器厂)、电冰箱、培养皿 、涂布棒等 。化学
试剂均为国产分析纯 。
1.1.3　供试菌种　大肠埃希氏菌 (Escherichiacoli)、普通变
形杆菌 (Proteusvulgaris)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、藤黄八叠球菌 (Sar-
cinalutea)、枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)、白色念珠球菌
(Moniliaalbican),均由怀化学院微生物学实验室提供 。
1.1.4　培养基 　LB(Luria-Bertani)液体培养基:蛋白胨
10 g, NaCl10g,酵母粉 5g,用 1mol/LNaOH调 pH值为 7.0 ,
重蒸馏水定容至 1 000mL。于 121 ℃灭菌 20min。
LB固体培养基:LB液体培养基中加 1.6%琼脂粉 ,煮沸
熔化后定容 。于 121 ℃灭菌 20 min。
1.2　铁苋菜提取液的制备
1.2.1　水提液采用煎煮法　取铁苋菜粉 ,于 60℃恒温干燥
16 ～ 18h后 ,用蒸馏水煎煮 2次 ,每次 30 min。合并滤液 ,于
4 000r/min离心 10min,取滤液浓缩至含生药 1 g/mL。灭菌
后放入冰箱中保存备用 。
1.2.2　甲醇提取法　取铁苋菜粉 ,于 60 ℃恒温干燥 16 ～
18 h后 ,称取一定量的铁苋菜粉 ,用适量的甲醇浸泡 2 h,再用
超声波提取 45min,然后于 4 000 r/min离心 5 min,再用旋转
蒸发仪浓缩至含生药 1g/mL。灭菌后放入冰箱中保存备用 。
1.2.3　乙酸乙酯提取法　取铁苋菜粉 , 于 60 ℃恒温干燥
16 ～ 18 h后 ,称取一定量的铁苋菜粉 ,用适量的乙酸乙酯浸
泡 2h,再用超声波提取 45 min,然后于 4 000 r/min离心
5 min,用旋转蒸发仪浓缩至含生药 1g/mL。灭菌后放入冰箱
中保存备用 。
1.2.4　不同浓度(50%、70%、90%)乙醇提取法 　取铁苋菜
粉 ,于 60℃恒温干燥 16 ～ 18 h后 ,称取一定量的铁苋菜粉 ,
用不同浓度的乙醇浸泡 2 h,用超声波提取 45 min,然后于
4 000 r/min离心 5 min,用旋转蒸发仪浓缩至含生药 1g/mL。
灭菌后放入冰箱中保存备用 。
1.3　菌液的制备
将所有供试菌活化 2代后 ,分别接入试管斜面培养基上 ,
各菌株接多支斜面 ,在 37 ℃恒温培养 18 ～ 24h。每次试验每
种菌取 1支斜面供试 ,其余于 4 ℃冰箱保存备用 。试验时分
别取 7种供试菌种的斜面培养物适量 , 接种于 LB液体培养
基内 ,于 37℃、160 r/min下培养 16 ～ 18 h。然后采用 10倍
稀释法 ,用生理盐水稀释至 10 000倍备用 。
1.4　滤纸片法测定抑菌效果
取直径为 5mm的圆形滤纸片 121℃下湿热灭菌备用 ,将
—360— 江苏农业科学　2010年第 4期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.04.120
其中的 126片分成 7组 ,分别放入浓度为 0.5g/mL的铁苋菜
各种不同提取液中浸泡 3min,将 7种供试菌液各取 0.1mL涂
布在固体培养基上 ,制成含菌平板 ,然后取含浸出汁的滤纸片
贴在平板上 ,每皿贴 6片 ,每菌做 3份平行 ,另外每个菌种用未
浸泡的滤纸片做 1份空白对照 。 10 min后倒置于 37℃下培养
24 h,测定滤纸片的抑菌圈大小 ,比较抑菌效果 。
1.5　最低抑菌浓度(MIC)的测定
在无菌条件下将灭菌试管分成 3大组 ,每组 56支 , 56支
试管再分成 7小组 ,每组 8支 。第 1支试管中加入 1 mL2倍
浓度的 LB液体培养基 ,第 2 ～ 7支试管中各加入 1 mL的 LB
液体培养基 ,向第 1支试管中加入 1 mL药液后按二倍稀释
法 ,使各管药液浓度分别为 0.5、 0.25、 0.125、 0.062 5、
0.031 25、0.015 625、0.007 812 5 g/mL,第 8支试管为 LB液
体培养基对照管 ,然后向各管中加入 0.1 mL的稀释 10 000
倍供试菌液 ,于 37℃培养 18 ～ 20 h。不同溶剂提取液对每个
菌种的抑制作用均做 3份平行 ,将上述培养物分别取 0.1 mL
涂布于固体培养基上 , 10 min后倒置于 37℃下培养 18 ～ 20h
后观察 。以完全无菌生长的平板所对应的提取液浓度作为最
低抑菌浓度(MIC)。
2　结果与分析
2.1　铁苋菜不同溶剂提取液对供试菌种的抑制效果
滤纸片法测定抑菌作用的试验中 ,取每菌 3次平行试验
的结果 ,所得平均值见表 1。
表 1　铁苋菜不同溶剂提取液对供试菌种的抑制效果
供试菌种
抑菌圈直径(mm)
水提取液 乙酸乙酯提取液 甲醇提取液 50%乙醇提取液 70%乙醇提取液 90%乙醇提取液
大肠杆菌 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
普通变形杆菌 5.8 5.1 5.0 5.0 5.0 5.0
金黄色葡萄球菌 9.7 9.3 8.4 8.0 8.1 8.5
藤黄八叠球菌 14.2 11.0 13.5 14.1 13.2 11.7
枯草芽孢杆菌 6.8 5.5 5.0 5.0 5.0 5.0
粪肠球菌 9.0 8.1 8.6 7.3 8.0 9.3
白色念珠球菌 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
　　从表 1可以得出:各种提取液对大肠杆菌和白色念珠球
菌完全没有抑菌作用 ,此外 ,甲醇提取液和不同浓度的乙醇提
取液对枯草芽孢杆菌和普通变形杆菌也没有抑菌作用 。不同
的提取液对藤黄八叠球菌的抑菌效果都是最好的 ,其次是对
金黄色葡萄球菌和粪肠球菌 ,各种提取液相比 ,一般大多数为
水提液的抑菌效果最好 。在不同浓度的乙醇提取液中 ,基本
上是 90%乙醇的抑菌效果最好。总之 ,不同的提取液对同一
种供试菌有不同的抑菌效果 ,同一种提取液对不同供试菌的
抑菌效果也是不相同的 。
2.2　铁苋菜各提取液的最低抑菌浓度(MIC)
铁苋菜不同溶剂不同浓度的提取液对 7种供试菌最低抑
菌浓度的测定结果如表 2。
表 2　铁苋菜各提取液对 7种供试菌的最低抑菌浓度
供试菌种 最低抑菌浓度(MIC)(g/mL)
水提取液 乙酸乙酯提取液 甲醇提取液 50%乙醇提取液 70%乙醇提取液 90%乙醇提取液
大肠杆菌 无抑制 无抑制 无抑制 无抑制 无抑制 无抑制
普通变形杆菌 0.062 5 0.25 无抑制 无抑制 无抑制 无抑制
金黄色葡萄球菌 0.031 25 0.125 0.031 25 0.031 25 0.031 25 0.031 25
藤黄八叠球菌 0.015 625 0.015 625 0.015 625 0.031 25 0.015 625 0.015 625
枯草芽孢杆菌 0.062 5 0.25 无抑制 无抑制 无抑制 无抑制
粪肠球菌 0.062 5 0.5 0.125 0.25 0.25 0.062 5
白色念珠球菌 无抑制 无抑制 无抑制 无抑制 无抑制 无抑制
　　从表 2得知:各种不同的提取液对大肠杆菌和白色念珠
球菌均无抑制作用 ,甲醇提取液和不同浓度的乙醇提取液对
普通变形杆菌和枯草芽孢杆菌也没有抑制作用 。
3　讨论
试验结果表明:铁苋菜提取液对藤黄八叠球菌的抑菌效
果最强 ,对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的抑菌效果次之 ,对普
通变形杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果较差 ,对大肠杆菌和
白色念珠球菌均无抑制作用 ,说明铁苋菜提取液对革兰氏阴
性菌无抑制作用 ,对革兰氏阳性菌有不同程度的抑制作用 。
铁苋菜水提液和乙酸乙酯提取液抑菌范围较其他提取液要
宽;但是有些关于铁苋菜的报道说铁苋菜提取液对大肠杆菌
和白色念珠球菌有明显的抑菌效果 ,这与本试验的研究结果
刚好相反 ,这种不同可能与菌种的种类与变异 、菌种保存的环
境 、提取溶剂种类 、提取液的提取方法和其中的有效成分等因
素有关 。除此之外 ,本试验采用了超声波辅助提取铁苋菜的
有效成分 ,这种方法相对一般常规的提取分离方法而言 ,有提
取彻底 、简便 、快速的优点。
试验所用的抑菌物质是煎煮的中草药制剂和超声波提取
的中草药制剂 ,颜色较深 ,因此测最低抑菌浓度的时候采用涂
平板的方法 ,与其他方法相比 ,此方法比较直观 、稳定 。
(下转第 362页)
—361—向秋玲:铁苋菜不同溶剂提取物抑菌作用的研究
周艳红 ,丁衬衬 ,史建荣.转基因作物对土壤微生物多样性影响研究技术的进展[ J] .江苏农业科学 , 2010(4):362-365.
转基因作物对土壤微生物多样性影响研究技术的进展
周艳红 , 丁衬衬 , 史建荣
(江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所 /农业部食品质量安全监控重点开放实验室 /
江苏省食品质量安全重点实验室 ,江苏南京 210014)
　　摘要:土壤微生物的多样性是保持农业生态系统稳定的基础 , 而作物的改变对土壤微生物的多样性结构具有显
著的影响。转基因作物被引入到农田后所带来的微生物群落变化及对农业生态系统所带来的不确定因素 ,已成为研
究热点。本文着重介绍了当前土壤微生物多样性研究中常用的 3种基于 16SrDNA的技术:变性梯度凝胶电泳
(DGGE)、扩增性核糖体 DNA限制酶切片段分析(ARDRA)和末端限制性酶切片段长度多态性(T-RFLP)技术 , 分析
比较了各种技术的原理 、优点及其应用局限性 ,并简短综述了这些技术近年来的应用 。
　　关键词:土壤;生物;微生物多样性;16SrDNA;DGGE;ARDRA;T-RFLP
　　中图分类号:S154.3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)04-0362-04
(上接第 361页)
　　本试验同时用了药敏纸片法和涂平板法 ,先用前一种方
法测定它的抑菌效果 ,然后再测定它的最低抑菌浓度 ,虽然比
较麻烦 ,但是可以同时掌握多种试验方法 ,还可以比较 2种方
法的优点与缺点 。前一种方法可以很快知道它的抑菌效果 ,
观察起来比较直观;但是在测量的时候 ,标准不太好把握 ,除
此之外 ,药敏纸片法纸片上的中药容易浸到平板上 ,从而影响
试验效果 。而涂平板法很容易观察出它的最低抑菌浓度 ,在
观察不同浓度的铁苋菜提取液对同一种菌的抑菌效果时还是
比较直观;但是对于低浓度而言 ,观察比较困难 ,特别是在比
较不同溶剂提取液时 ,生长细菌的多少没有明确的界定 ,不太
好比较 。
参考文献:
[ 1] AmakuraY, MiyakeM, ItoH, etal.AcalyphidinsM1, M2, andD1, el-
lagitanninsfromAcalyphahispida[ J] .Phytochemistry, 1999, 50(4):
667-675.
[ 2]杨养贤 ,王晋源.中药铁苋菜的药理研究概况 [ J] .现代中医 ,
1997, 10(2):109-111.
[ 3]熊文愈.中国木本药用植物 [ M] .上海:上海科学技术出版社 ,
1993:444-448.
　　土壤微生物的多样性是保持农业生态系统稳定的基础 。
微生物在土壤中普遍存在 ,对环境条件的变化反应敏捷 ,它能
较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程 ,被认为是最有
潜力的敏感性生物指标之一 [ 1 ] 。据估计 ,每克土壤中有上千
种不同的微生物 ,大约 100亿个微生物;但由于培养基和培养
条件的限制 ,目前通过实验室人工培养方法分离 、描述的微生
物种类和数量仅占估计数量的 1% ～ 5%,而其余 95% ～ 99%
微生物种群仍然未被分离 [ 2 ] 。研究表明 ,转基因作物的外源
基因和基因表达产物可通过根系分泌物或残茬进入土壤生态
系统 ,进而对土壤微生物多样性造成影响 。近年来 ,把分子生
物学技术运用于土壤微生物生态学 ,可以避开传统的分离培
养过程 ,通过 DNA水平上的研究 ,直接探讨土壤微生物的种
群结构及其与环境的关系 [ 3] 。随后 16SrDNA序列分析作为
微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同 ,随着微生物
收稿日期:2010-04-19
基金项目:国家转基因专项(编号:2008ZX0801003, 2008ZX08011-
015B);江苏省博士后科研资助计划项目(编号:0901067C);农产
品安全检测实验室开放课题(编号:BM2006611)。
作者简介:周艳红(1978—),女 ,河南许昌人 ,博士 ,从事真菌毒素免
疫学研究。 Tel:(025)84392001;E-mail:yhzhou0710@ 163.com。
通信作者:史建荣 ,博士 ,研究员, 从事毒素检测技术与降解 、作物与
病菌互作的分子基础研究。 Tel:(025)84392001;E-mail:shiji@
jaas.ac.cn。
核糖体数据库的日益完善 ,该技术成为细菌分类和鉴定的一
个有力工具 。
16SrDNA在原核微生物中普遍存在 ,并且含有相对保守
区域和可变区域 ,大小也适合电泳技术分析 。目前主要应用
16SrDNA序列分析来研究原核微生物群落多样性 ,通过与已
建立的微生物 16SrDNA序列数据库比较 ,可以确定特定微
生物的系统发育关系。这些技术克服了传统培养技术的限
制 ,提供了一种分析整个微生物群落的方法 ,更为精确地揭示
土壤中微生物种群结构及其动态变化 。因此 ,基于 16SrDNA
基因的指纹图谱分析技术近年来被国内多学者广泛应用于土
壤微生物多样性的研究中 。其总的技术路线为:分离微生物
基因组 DNA,用特异性引物扩增 16SrDNA基因片段 ,再将该
PCR扩增产物进行更深一步分析 ,从而可在种 、属的水平上
研究不同生境中的微生物种群结构及其动态变化 [ 4] 。
变性梯度凝胶电泳 (denaturinggradientgelelectrophore-
sis, DGGE)[ 5 -6] 、扩增性核糖体 DNA限制酶切片段分析(am-
plifiedribosomalDNArestrictionanalysis, ARDRA)[ 7 -8 ]和末端
限制性酶切片段长度多态性 (terminalrestrictionfragment
lengthpolymorphism, T-RFLP)[ 9 -10] ,是目前常见的用于土壤
微生物多样性和生态学研究的技术 。这些技术和方法的采
用 ,使得在土壤微生物多样性 、微生物种群的结构和功能 、土
壤微生物的系统发生和分类 、土壤微生物与污染土壤的相互
作用及影响等多领域的研究上得以突破 ,发挥了传统方法所
—362— 江苏农业科学　2010年第 4期