全 文 ：电堆集富集非水毛细管电泳同时测定水杨酸 、
肉桂酸 、阿魏酸和香草酸
李利军* 1　冯 军2　程昊 1　陈其锋 2　钟招亨 2　孔红星1　吴健玲2
1(广西工学院生物与化学工程系 , 柳州 545006)　　2(广西大学化学与化学工程学院 , 南宁 530005 )
摘　要　建立了同时分离测定水杨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香草酸的电堆集富集-非水毛细管电泳(NACE)的新
方法。运行缓冲溶液为 40 mm o l /L乙酸钠-2. 5 mmo l /L氢氧化钠甲醇溶液 ,电压 - 25 kV, 在 225 nm波长下紫
外检测。对电压 、乙酸钠浓度 、氢氧化钠浓度 、进样时间 、样品溶液等因素对电堆集及分离的影响做了系统的
研究。水杨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香草酸分别在 1. 4 ～ 28 mg /L、 0. 40 ～ 8. 0 m g /L、 0. 7 ～ 18 mg /L和 0. 7 ～
30 mg /L范围内线性关系良好(r=0. 9999、 r=0. 9997、 r=0. 9994、 r=0. 9997);回收率分别为 95. 8 ～ 99. 6%、
96. 2 ～ 98. 2%、 95. 7 ～ 105%和 98. 9～ 103%, 基于 3倍信噪比(S /N =3), 4种有机酸的检出限分别为 0. 069、
0. 051、0. 107和 0. 089 mg /L。
关键词　非水毛细管电泳 ,电堆集 , 水杨酸 ,肉桂酸 , 阿魏酸 ,香草酸
　 2006-07-19收稿;2006-11-13接受
* E-m ail:lili jun0562@ sina. com
1　引　言
水杨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香草酸在多种中草药中作为主要活性成分存在 ,具有抗菌 、消炎 、抗血小
板聚集等重要的药理作用 。在一些中草药中 ,这 4种有机酸的一种或几种含量的高低常被作为质量评
价指标 。因此 ,对中草药中水杨酸 、肉桂酸 、阿魏酸及香草酸含量测定具有重要意义 。同时分离测定其
中某一种或几种酸的方法主要有高效液相色谱法 (HPLC)[ 1, 2] 、毛细管电泳法 (CE)[ 3 ～ 5]等 ,但尚未见毛
细管电泳法同时分离测定这 4种有机酸中的报道。
CE具有分离效率高 、消耗样品少等诸多优点。应用于中药分析具有广阔的前景。但由于毛细管柱
检测光程短 ,其检出限比 HPLC低 1 ～ 2个数量级 [ 6] 。本实验采用毛细管电泳在线样品浓缩技术 ———电
堆集富集技术 ,极大提高了 CE的检测灵敏度 。由于这 4种有机酸在水中的溶解度低 ,而且为了获得更
好的堆集效果 ,本实验采用非水相毛细管电泳技术进行分离测定。与水相毛细管电泳相比 ,非水毛细管
电泳中被分析物可以有更宽范围的酸 /碱性 ,可承受更高的操作电压和更高离子强度 , 因而分离效率更
高和样品堆集效应更好 , 提高了灵敏度 ,并已广泛应用于中草药的分离分析[ 7 ～ 9] 。
本研究参考了文献 [ 3] ,以甲醇为非水介质 ,以 40 mmol /L乙酸钠 、2. 5 mmo l /L N aOH为背景电解
质 ,以 225 nm为检测波长 ,建立了同时分离测定水杨酸 、肉桂酸 、香草酸及阿魏酸的电堆集非水毛细管
电泳的方法 。本方法具有简便 、快速 、重现性好 、检出限低等特点 ,已应用于胡黄连 、川芎中这 4种有机
酸测定 。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
ACS2000型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司);电源:电压 0 ～ - 30 kV可调;未涂
层熔融石英毛细管柱 63 cm ×75 μm .i d,有效长度 45 cm(河北永年)。
阿魏酸 、香草酸对照品 (中国药品生物制品检定所);水杨酸(汕头市西陇化工厂 );肉桂酸(上海化
学试剂公司 );胡黄连 、川芎(柳州市中医院 );乙酸钠 、NaOH和甲醇等试剂均为分析纯 。水为二次重
蒸馏水 。
第 35卷
2007年 3月　　　　　　　　　　　　
分析化学 (FENXI HUAXUE)　研究简报
Ch inese Journa l o f Ana ly tica l Chem istry
　　　　　　　　　　　　 第 3期
401 ～ 405
2. 2　实验方法
准确称取水杨酸 0. 0069 g、肉桂酸 0. 0101 g、阿魏酸 0. 0072 g、香草酸 0. 0148 g, 用甲醇溶解 ,分别
定容至 10、25、10、50 mL,配制成浓度分别为 690、404、720、296 mg /L的对照品贮备液 。取胡黄连 、川芎
10 g干燥至恒重 ,研磨成粉 ,过筛后准确称取胡黄连 、川芎粉末各 0. 5000 g,分别加入 35、40 mL甲醇溶
液 ,超声提取 60m in后冷浸 12 h过滤 ,将滤渣用 10 mL甲醇超声提取 30m in后过滤 ,合并两次滤液 ,用
0. 45μm滤纸过滤后定容至 50 mL。胡黄连滤液稀释 5倍进行测定 。
毛细管实验前依次用 1 mol /L N aOH、水 、甲醇分别冲冼 15 m in,进样前用缓冲液冲洗 30 m in ,实验
3 h后更换缓冲液 。因本实验采用非水相 ,所用溶剂为易挥发的甲醇溶液 ,所以 ,每隔 3 h更换缓冲液是
保证实验重现性的关键。实验所用的溶液进样前均用 0. 45μm的滤膜过滤 ,并经超声波脱气 30m in。
分离电压 - 25 kV , 重力进样 , 进样高度 11 cm , 进样时间 200 s, UV检测波长 225 nm;温度 25℃,
40 mmo l /L乙酸钠 , 2. 5 mmo l /L N aOH甲醇溶液。
3　结果与讨论
3. 1　支持电解质浓度和其它条件的选择
固定其它条件 ,考察支持电解质乙酸钠 30 ～ 70 mmol /L的影响 ,得到在乙酸钠浓度逐渐升高时 ,
4种酸分离度未见明显改变。乙酸钠浓度为 30mmo l /L时 ,胡黄连样品中阿魏酸峰处有未知物峰干扰 ,
且阿魏酸与香草酸分离度差;乙酸钠浓度 >50 mmo l /L时 ,噪音随之增大 、基线漂移严重 、灵敏度下降。
综合考虑选择乙酸钠浓度为 40mmol /L。对有机溶剂的种类 、电压( -15 ～ - 25 kV)进行了考察 ,发现
选用甲醇为非水介质 ,电压为 - 25 kV时基线平稳 ,柱效较高 ,各组分达基线分离。
3. 2　NaOH浓度的影响
非水介质中无法准确测定溶液的 pH值 ,本实验在缓冲体系中通过改变 N aOH浓度调节缓冲体系
的 pH值。表 1表明:实验以加入 NaOH浓度为 2. 5mmol /L时 ,分离度较好 ,柱效较高 ,分析时间较短 。
表 1　4种酸迁移时间及分离度随 NaOH浓度变化趋势
Table 1　Effect of the concentra tion o f sodium hydrox ide on m igration tim e and reso lu tion
N aOH浓度
Concen tration(mmo l /L)
水杨酸 S alicylic acid
t /m in R
肉桂酸 C innam ic acid
t /m in R
阿魏酸 Feru lic acid
t /m in R
香草酸 Van il lic acid
t /m in
1. 0 12. 86 26. 9 20. 95 17. 2 32. 66 4. 2 29. 31
2. 0 12. 76 28. 4 20. 33 8. 3 23. 37 3. 1 24. 63
2. 5 12. 95 28. 2 20. 99 7. 6 24. 06 3. 9 26. 06
3. 0 8. 95 14. 5 11. 32 3. 1 12. 05 1. 7 12. 59
3. 5 12. 23 26. 5 18. 97 3. 3 20. 01 5. 0 21. 68
4. 0 12. 64 28. 5 19. 69 1. 8 20. 26 4. 8 21. 65
5. 0 12. 78 26. 8 20. 33 1. 9 20. 99 5. 5 23. 03
注(note):t(m in):迁移时间(m ig ration tim e);R:与后一物质的分离度(resolu tion)。
3. 3　分析物溶剂对分离和样品堆集的影响
在电堆集富集中 ,减小样品溶液的离子强度同时增大背景电解质的浓度可获得较高的富集率。本
实验考察了进样时间为 200 s时 ,用电泳缓冲液 、稀释 1倍电泳缓冲液和甲醇溶液稀释对照品储备液对
峰形的影响 。结果表明 ,随着缓冲介质浓度的降低 ,峰形逐渐变尖锐。考察了用甲醇 、乙腈 、水稀释 4种
酸储备液对响应信号的影响。结果表明 ,用溶剂稀释 4种酸储备液得到的峰形要比稀释电泳缓冲溶液
好 ,其峰高响应值以甲醇最大 ,故本实验选用甲醇稀释储备液 。
3. 4　进样时间对富集倍数及分离的影响
实验表明 ,在其它条件不变时 ,富集倍数随进样时间的延长而增加 。本实验考察了进样时间对 4种
酸测定的影响。结果表明 ,在 20 ～ 240 s内 , 4种酸的响应信号与进样时间显较好的线性。但随着进样
时间的延长 ,由于层流现象 ,峰变宽严重 ,分离度下降 。综合考虑 ,选用进样时间为 200 s。电堆集富集
因子用公式 SE峰高 =H堆集 H/ 或 SE峰面积 =A堆集 /A计算为 14。未经富集的 4种标准混合液电泳图与经过
402　　 分 析 化 学 第 35卷
　图 1　4种有机酸标准混合液(A)与在电堆集
下电泳谱图(B)
F ig. 1　 E lec tropherog ram s o f fou r o rganic acid
standards m ix tu re under norm a l condition(A) and
stacking condition(B)
A. 重力进样 30 s (gravi ty-in jected for 30 s);B. 重力
进样 200 s (gravity-in jected for 200 s)。峰 (peak)
1. 水杨酸(salicylic acid);2.肉桂酸(cinnam ic acid);
3.阿魏酸( feru lic acid);4.香草酸(van illic acid)。
富集后的4种标准混合液电泳图见图 1。
3. 5　线性关系的考察
配制水杨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香草酸系列标准溶液 ,
在最佳条件下 , 4种有机酸峰形良好且无杂峰干扰 (见
图 2A)。对 4种有机酸平均峰面积与浓度(mg /L)计算线性
回归方程及相关系数 ,结果见表 2。实验结果表明 ,在一定的
范围内校准曲线呈良好线性关系 , r值均 >0. 9994。基于
3倍信噪比 (S N/ =3),各有机酸的检出限均 <0. 107mg /L。
3. 6　重现性和稳定性实验
取同一规格 、品种胡黄连样品 5份 ,按上述方法制备供
试品溶液 ,测得肉桂酸含量平均值为 0. 24 mg /g、阿魏酸
0.67mg /g、香草酸 2. 95 mg /g。未测及水杨酸。肉桂酸 、阿
魏酸和香草酸含量 RSD分别为 2. 6%、1. 8%和 3. 5%。取
上述对照品溶液 ,每隔 2 h进样 ,连续 10 h,结果 10 h内水
杨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香草酸的峰面积积分值基本稳定 ,
峰面积的 RSD分别为 4. 4%、4. 6%、3. 8%和 3. 6%。 10 h
后阿魏酸逐渐开始分解 ,在电泳图上出现 2个吸收峰。
表 2　4种有机酸的线性回归方程 、相关系数及检出限
Table 2　Resu lts o f reg re ssion ana ly sis on w orking cu rves and the de tection lim its
化合物
Com pound
回归方程
Regress ion equation
相关系数
Correlat ion coeffieient
线性范围
Linearity range(m g /L)
检出限
Detection lim it(m g /L)
水杨酸 Salicylic acid Y =2036. 7X - 179. 49 r=0. 9999 1. 4～ 28 0. 069
肉桂酸 C innam ic acid Y =6845. 5X - 339. 05 r=0. 9997 0. 4～ 8. 0 0. 051
阿魏酸 Feru lic acid Y =5594. 4X - 750. 88 r=0. 9994 0. 7～ 18 0. 107
香草酸 Van il lic acid Y =6728. 7X +381. 97 r=0. 9997 0. 7～ 30 0. 089
　
3. 7　样品的测定及加样回收实验
用本方法对样品进行测定 ,将胡黄连 、川芎提取液 ,在上述实验条件下平行测定 3次 ,样品电泳谱图
见图 2B和图 2C。经计算 ,在胡黄连 、川芎提取液中肉桂酸 、阿魏酸和香草酸的含量见表 3。按照以上
实验方法进行回收率实验 ,结果见表 4。由表 4可知 ,本方法具有较好的重现性和理想的准确度。
图 2　4种有机酸对照品电泳图及胡黄连 、川芎样品电泳图
F ig. 2　E lectrophe rogram s o f four o rganic acid standards, rhizom a picrorh izae sam ples and L igusticum
chuanx iong H o rt sam ples
A. 4种有机酸对照品(organ ic acid s tandards);B. 胡黄连(Rh izom a p icrorh izae);C. 川芎(Ligu sticum chuanxiong
Hort)。 1. 水杨酸 (salicy lic acid);2. 肉桂酸 (cinnam ic acid);3. 阿魏酸( feru lic acid);4. 香草酸( van illic
acid)。 40 mm ol /L NaA c+2. 5mm ol /L N aOH +CH3OH; -25 kV , 检测波长(detect ion w aveleng th):225 nm。
403第 3期 李利军等:电堆集富集非水毛细管电泳同时测定水杨酸 、肉桂酸 、阿魏酸和香草酸 　　
表 3　样品含量的测定结果(n=3)
Table 3　Resu lts o f samp le s′de te rm ina tion(n=3)
样品
S amp le
水杨酸
S alicy lic
acid(m g /g)
肉桂酸
C inn am ic
acid(m g /g)
阿魏酸
Feru lic
acid(mg /g)
香草酸
Van illic
acid(m g /g)
样品
S amp le
水杨酸
Salicy lic
acid(m g /g)
肉桂酸
C innam ic
acid(mg /g)
阿魏酸
Feru lic
acid(m g /g)
香草酸
V an illic
acid(m g /g)
胡黄连
R h izoma
picrorh iza e
- 0. 24 0. 67 2. 95
川芎
Ligu sticum
chuanxiong Hort
- - 1. 22 0. 13
表 4　回收率实验结果(n=5)
Table 4　Resu lts o f recove ry test(n =5)
加标量
A dded(mg /L)
测出量
Found(m g /L)
RSD(%)
回收率
Recovery(%)
加标量
Added(m g /L)
测出量
Found(m g /L)
RSD(%)
回收率
Recovery(%)
水杨酸
salicy lic acid
2. 07
20. 7
2. 06
19. 8
3. 6
2. 6
99. 6
95. 8
肉桂酸
C innam ic acid
0. 61
6. 06
0. 60
5. 83
3. 6
3. 0
98. 1
96. 2
阿魏酸
Feru lic acid
0. 90
9. 00
0. 94
8. 96
2. 7
3. 3
104. 4
99. 6
香草酸
Van illic acid
4. 44
17. 8
4. 55
17. 6
3. 3
2. 6
102. 5
98. 9
References
1　Rodrigue z-De lgadoM A, M alovana S, Pe rez J P, Borge s T, M onte longo G F J. J. Chromatogr. A , 2001, 912:249 ～ 257
2　Kong L iang(孔　亮), Yu Zhiyuan(于志远), Zou H anfa(邹汉法), Sun Na ichang(孙乃昌 ), Wu Lihua(吴丽华 ), Ni Jia-
ny i(倪坚毅). Ch inese J. Ana l. Chem. (分析化学), 2004, 32(11):1501 ～ 1504
3　L i L ijun(李利军), H uang W eny i(黄文艺), Kong H ongxing(孔红星), Cheng Hao (程　昊),W u Jianling(吴健玲 ).
Journa l of Guangxi University of Technology(广西工学院学报), 2004, 15(4):1 ～ 4
4　Polasek M , Pe triska I, PospisilovaM , Jahodar L. Ta lan ta, 2006, (69):192 ～ 198
5　H ierm ann A, Rad l B. J. Chromatogr. A , 1998, 803:311 ～ 314
6　H e Q ix ia(何绮霞). Ch inese Journal of VeterinaryD rug(中国兽药杂志 ), 2003, 37(10):44 ～ 46
7　H ansen S H , Sheribah Z A. Journal of Pharmaceutica l and B iom edical Ana lysis, 2005, 39:322 ～ 327
8　L i C H , Chen A J, Chen X F, Chen X G , Hua Z D. Journal of Pharmaceutical and B iom ed ical Ana lysis, 2005, 39:125～ 131
9　B jo rnsdo ttir I, H ansen S H. Journal of Pharm aceutica l and B iom edica l Ana ly sis, 1995, 13:1473 ～ 1481
Separation and Determ ination of Sa licylic Acid, Cinnam ic Acid,
Ferulic Acid and Van illic Ac id w ith Samp le
Stacking-Non-aqueous E lectrophoresis
L i L i-Jun *1 , Feng Jun2 , Cheng Hao1 , Chen Q i-Feng2 , Zhong Zhao-Heng2 , KongH ong-X ing1 , W u Jian-L ing2
1(D epartm ent of B iolog ical and Chem ica l Engineering , Guangxi University of Technology, Liuzhou 545006)
2(College of Chem istry and Chem ical Eng ineering, Guangx iUn iversity, Nanning 530005)
Abstract　A new method for the simu ltaneous determ ina tion o f sa licy lic acid, cinnam ic acid, feru lic acid and
vanillic acid by stacking-non-aquous-capilla ry electropho resis has been propo sed. The opera ting buffer w as
composed o f 40mmo l /L sodium acetate - 2. 5mmol /L sodium hydrox ide inme thano .l The app lied voltagew as
- 25 kV and the UV de tection w ave leng th w as 225 nm. The linear ranges o f the method w ere 1. 4 -28mg /L
(r=0. 9999) for sa licy lic acid, 0. 40 - 8. 0 mg /L (r=0. 9997) for cinnam ic acid , 0. 7 - 18 mg /L (r=
0.9994) for feru lic acid and 0. 7 - 30 mg /L (r=0. 9997) fo r vanillic acid, the recove ries w e re 95. 8% -
99. 6%, 96. 2% - 98. 2%, 95. 7% - 105%, 98. 9% - 103% and de tec tion lim its (S N/ =3) o f 0. 069,
0.051, 0. 107 and 0. 089 mg /L fo r 4 o rgan ic acids respective ly.
Keywords　N on-aqueous capillary electropho resis, sample-stacking, sa licy lic acid, cinnam ic acid, fe ru lic
acid, vanillic acid
(Received 19 Ju ly 2006;accep ted 13N ovember 2006)
404　　 分 析 化 学 第 35卷