全 文 ：土槿皮总萜抗肿瘤生长与转移作用的实验研究
代　勇1 ,赵　因2 ,徐世军1 ,沈映君1
(1.成都中医药大学 , 四川 成都　610075;2.成都益因科技发展有限公司 ,四川 成都　610041)
　　[摘要] 目的:探讨土槿皮总萜对实验性动物实体瘤生长和转移的作用;方法:采用 U14 移植性小鼠宫
颈癌模型 ,土槿皮总萜按原生药 3.2 , 1.6 , 0.8 g/(kg ·d)3个剂量组用于 U14荷瘤小鼠模型试验;分别
计算造模 7 d 、14 d肿瘤抑制生长率和14 d肝 、肺转移结节形成数目;用 ELISA法检测各组动物 7 d 、14
d血清 VEGF 含量变化 。结果:土槿皮总萜各实验剂量组均能显著抑制模型动物肿瘤生长 ,其中中剂
量组肿瘤抑制生长率达到 53.72%,与环磷酰胺组相当;同时能显著减少肿瘤肝肺转移结节形成数量;
并显著降低受试动物血清 V EGF 的含量 。结论:土槿皮总萜具有明显的抗肿瘤生长和转移作用 。
[关键词] 宫颈肿瘤;血管;内皮生长因子;酶联免疫吸附测定;松科;小鼠
[中图分类号] R73-3　[文献标识码] A　[文章编号] 1007-1237(2007)05-0414-04
Experimental research of total terpenes of cortex pseudolaricis on tumor growth and metas-
tasis
Dai　Yong , Zhao 　Yin , Shen　Ying-jun
(Chengd uUniversity of TCM , S ichuan Cheng du　610075 , P.R.o f China)
[ ABSTRACT] Object ive:To investig ate the ef fects of to tal terpenes of Cor tex Pseudolaricis on the
grow th and metastases of tumo r in tumo r-bearing mice.Methods:U14 carcinoma model w as used to study
the inhibitory ef fects of total terpenes of Co rtex Pseudolaricis on the g row th and me tastasis.The dosages
of total terpenes at 3.2 、1.6 、0.8 g raw material/(kg/bw/d)Were applied fo r U14 carcinoma model.The
inhibitory rate of tumo r g row th on day 7 ,14 and the metastatic tumo r number w ere counted respectively.
ELISA was used to detect the blood level of VEGF on day7 , 14.Results:The to tal te rpenes of Co rtex
Pseudo laricis significant ly inhibi ted g row th and metastasis of the tumor.The inhibitory rate w as 53.72%
at the medium dosage of the total terpenes.In the mean time it could obviously decreased the number of
metasta tic number in liver and lung and the blood levels of VEGF .Conclusions:The total terpenes o f Co r-
tex Pseudolaricis can significantly inhibi t the g row th and me tastasis of tumo r in U14 carcinoma bearing
mice.
[ KEY WORDS] U terine cervix tumor;Blood vessel;VEGF;ELISA;Pine fami ly;Mouse
　　现代研究证明 ,血管生成对实体瘤的生长和转
移至关重要 ,因此 ,可以通过控制肿瘤组织的新生血
管形成这一药理学机制达到治疗恶性肿瘤的目的 。
土槿 皮 是 松 科 植 物 金 钱 松 Pseudolarix
kaemp feri Gord .的根皮 ,含有土槿皮二帖类 、三帖
类 、三萜内旨以及甾醇类等有效成分 ,其中代表成分
为土槿皮甲酸 、乙酸(P seudolaric acid AB)。现代
研究表明 ,土槿皮有抗真菌 、抗生育 、抗肿瘤作用[ 2] 。
我们在前期研究中发现 , 土槿皮总萜在鸡胚卵
黄尿囊膜试验中具有显著的抑制新生血管形成作
[收稿日期] 2007-08-25
[作者简介] 代勇(1964-),男 ,四川乐山人 ,副教授 ,博士。
414
海南医学院学报　2007 ,13(5)　
Journal o f Ha inan Med ica l College
DOI :10.13210/j .cnk i.jhmu.2007.05.003
用 ,在 U14荷瘤小鼠试验中土槿皮总萜能够明显降
低肿瘤组织中的微血管密度(MVD),由此 ,我们进
行了土槿皮总萜对肿瘤生长和转移的影响的进一步
研究 ,现将研究结果报道如下 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　药物与试剂　土槿皮总萜 ,批号:050518 ,由
成都益因科技发展有限公司提供 ,每克药粉相当于
原生药材 330 g ,使用时用生理盐水配制成原生药
3.2 g/mL 、1.6 g/mL 、0.8 g/mL , 4 ℃冰箱保存备
用。环磷酰胺粉针(环磷酰胺),批号:050622 ,由江
苏恒瑞医药股份有限公司提供。无菌生理盐水 ,批
号 B050603-08 ,四川科伦大药厂有限责任公司 。
台盼蓝 ,Sigma公司产品。
1.1.2　主要仪器　BX41 Olympus显微镜;数字摄
像仪(TK -C1381 , 日本 Victo r 公司);Multiskan
MK3型酶标仪 , Thermo 公司;LRH -150S 型恒温
恒湿培养箱 ,广东省医疗器械厂;Wellw ash 4MK2
型洗板机 , Thermo 公司;Biofuge st ratus 台式高速
冷冻离心机 ,德国 Heraeus公司;WD-9450B 型水
平摇床 ,北京市六一仪器厂。
1.1.3　试验动物　昆明种小鼠 ,体重 20 ～ 24 g ,全
雌 ,一级 ,由成都中医药大学实验动物中心提供 ,动
物合格证:SCXK(川)2004-11 。
1.1.4　肿瘤株　小鼠宫颈癌 U14株 ,由成都中医
药大学基础医学院病理教研室提供 。
1.2　实验方法
1.2.1　动物分组　昆明种小鼠 180只 ,按体重分层
随机分为 6组 ,即空白组 、模型组 、环磷酰胺组 、土槿
皮总萜高 、中 、低剂量组每组 30只 ,每 10只分笼饲
养。
1.2.2　瘤株复苏及传代　取液氮冷冻保存 U14 肿
瘤株 ,水浴快速复苏后用无菌生理盐水制成细胞悬
液 ,台盼蓝排斥法计数活细胞 ,按 1 ～ 2×106 细胞小
鼠腹腔接种传代 ,7 d 后小鼠腹腔出现显著腹水 ,同
法连续传代至第 3代用于实验。取腹水显著小鼠 ,
腹部消毒 ,无菌抽取腹水 , 1 000 rmp 5 min ,弃上清
液 ,生理盐水洗涤 2次 ,台盼蓝排斥法计数活细胞数
目 ,用无菌生理盐水配制成 1×107 细胞/mL 的细
胞悬液 ,备用[ 3] 。
1.2.3　实验方法　①测定抑瘤率与转移结节的实验
方法:细胞悬液制备完成后 ,小鼠右腋下消毒后每只
0.2 mL皮下接种造模 ,瘤株接种后第 2天开始给药 ,
除环磷酰胺组腹腔注射给药外 ,其余各组均为灌胃给
药;实验第7天给药后 3 h每组随机取 15只小鼠 ,摘
取右眼球取血 ,分离血清备用;脱颈处死动物 ,分离肿
瘤组织 ,称重 ,计算抑瘤率;实验第 14天同法取血并
分离血清 ,处死所剩动物 ,分离肿瘤组织 ,称重 ,计算
抑瘤率。同时摘取肺脏 、肝脏 ,称重 ,中性福尔马林固
定 ,常规制片后计算转移结节。②血清中VEGF 含量
的 ELISA测定:建立标准曲线:设标准孔 8孔 ,每孔
中各加入样品稀释液 100 μL ,第 1 孔加标准品 100
μL ,混匀后用加样器吸出 100 μL ,移至第 2孔。如此
反复作对倍稀释至第 7孔 ,最后从第 7孔中吸出 100
μL弃去 ,使之体积均为 100 μL。第 8孔为空白对照。
待测样品孔中每孔各加入待测样品 100 μL ,将
反应板置 37 ℃120 min;用洗涤液将反应板充分洗
涤 4 ～ 6次 ,滤纸印干;每孔中加入第一抗体工作液
50 μL 。将反应板充分混匀后置 37 ℃60 min;用洗
涤液将反应板充分洗涤 4 ～ 6次 ,滤纸印干 。每孔加
酶标抗体工作液 100μL ,将反应板置 37 ℃60 min。
同前洗板 。每孔加入底物工作液 100 μL ,置 37 ℃
暗处反应 5 ～ 10 m in。每孔加入 50 μL 终止液混
匀。在 492 nm 处测吸光值。根据标准曲线回归方
程计算每个样品的浓度 。
1.3　数据处理
数据采用均数±标准差(x+s)表示 ,多组之间
比较采用单因素方差分析 ,组间两两比较采用独立
样本 t检验 ,统计数据采用 SPSS 10.0处理。
2　实验结果
造模给药7 d和 14 d的瘤重及抑瘤率结果见表
1 ,2 。
表 1　造模给药 7 d土槿皮总萜对小鼠宫颈癌 U14模型肿瘤瘤重 、抑瘤率的影响(x±s)
组别 小鼠(只) 剂量(g/ kg) 瘤重(g)　　　 抑瘤率(%)
模型组 15 — 2.15±1.07 —
环磷酰胺组 15 0.02 0.83±0.36＊＊＊ 61.40
高剂量组 15 3.20 1.22±0.41＊■ 43.30
中剂量组 15 1.60 1.01±0.37＊＊ 53.72
低剂量组 15 0.80 1.04±0.49＊＊ 51.75
　　　　　　　　　　　注:与模型组比较 , ＊＊ P<0.01 , ＊＊＊P<0.001;与环磷酰胺组比较:■P<0.05。
415代勇等.土槿皮总萜抗肿瘤生长与转移作用的实验研究
表 2　造模给药 14 d土槿皮总萜对小鼠宫颈癌 U14模型肿瘤瘤重 、抑瘤率的影响(x±s)
组别 小鼠(只) 剂量(g/ kg) 瘤重(g)　　　 抑瘤率(%)
模型组 11 — 5.32±2.17 —
环磷酰胺组 8 0.02 3.51±1.24＊＊ 34.11
高剂量组 12 3.20 3.52±1.03＊ 33.77
中剂量组 13 1.60 3.03±1.48＊ 42.98
低剂量组 11 0.80 3.16±1.61＊ 40.63
　　　　　　　　　　　注:与模型组比较 , ＊P<0.01 , ＊＊ P<0.001。
　　由表 1可以看出 ,肿瘤接种第 7天 ,各组肿瘤瘤
重与模型组相比均显著降低 ,有显著的统计学意义
(P<0.01),土槿皮总萜中剂量组分别与高剂量组和
低剂量组之间比较具有显著统计学意义(P<0.05),
高、低剂量组间比较无统计学意义(P>0.05),提示土
槿皮总萜高 、中 、低剂量组对 U 14 瘤重均有显著的
抑制作用 ,抑瘤率在 43.30%与 53.72%之间 ,其中
中剂量组与环磷酰胺抑瘤率相当 。肿瘤接种第 14
天后各组均有不同程度的动物死亡 ,其中环磷酰胺
组最为严重 ,但各组肿瘤瘤重与模型组相比均显著
降低 ,具有极显著性统计学意义(P <0.01 或 P <
0.001),土槿皮总萜中剂量组与高剂量组 、低剂量组
之间比较均具有显著统计学意义(P<0.05),高 、低
剂量组间比较无统计学意义(P>0.05);抑瘤率在
33.77%～ 42.98%之间 , 中 、低剂量组明显优于环
磷酰胺组的抑瘤率 34.11%,提示土槿皮总萜各组
均对 U 14瘤重均有显著的抑制作用 ,以中剂量组
抑制作用最强 。
造模给药 14 d的肺 、肝肿瘤转移结节结果见表
3。
表 3　造模给药 14 d土槿皮总萜对小鼠宫颈癌 U 14模型肿瘤转移结节的影响(x±s)
组别 小鼠(只) 剂量(g/ kg) 肿瘤转移结节(个)
空白组 15 —
模型组 11 — 66.05±9.57
环磷酰胺组 8 0.02 60.33±10.31
高剂量组 12 3.2 47.67±9.18＊＊＊
中剂量组 13 1.6 37.83±5.49＊＊＊■
低剂量组 11 0.8 39.33±3.27＊＊＊■
　　　　　　　　　　　　注:与模型组比较 , ＊＊＊P<0.001;与高剂量组比较 , ■P<0.05。
　　由表 3可以看出 ,造模第 14天 ,模型组肺 、肝组
织转移结节较多 ,环磷酰胺组与模型组相比无统计
学意义(P>0.05);土槿皮总萜各剂量组与模型组
比较有极显著的统计学意义(P<0.001),提示土槿
皮总萜各剂量具有抑制 U 14 肿瘤肝肺转移的作
用;土槿皮总萜中 、低剂量组与高剂量组之间有统计
学意义(P<0.05),中 、低剂量组之间比较无统计学
意义(P>0.05),提示土槿皮总萜中 、低剂量转移肿
瘤抑制能力优于高剂量 。
土槿皮总萜对小鼠宫颈癌 U14 模型血清
VEGF 的影响结果见表 4。
表 4　土槿皮总萜对小鼠宫颈癌 U14模型血清 VEGF的影响(x ±s)(pg/mL)
组别 剂量(g/ kg)
小鼠
(只)
VEGF　　　
(7 d)　　　
小鼠
(只)
VEGF　　　
(14 d)　　　
空白组 15 12.00±2.61＊＊＊ 15 11.50±3.27＊＊＊
模型组 - 15 75.67±7.55 11 73.33±14.90
环磷酰胺组 0.02 15 69.00±10.02 8 72.33±10.01
高剂量组 3.20 15 39.67±7.92＊＊ 12 41.17±4.79＊＊
中剂量组 1.60 15 33.00±12.60＊＊＊ 13 39.33±9.33＊＊＊
低剂量组 0.80 15 35.67±5.35＊＊＊ 11 41.17±10.50＊＊
　　注:与模型组比较 , ＊＊ P<0.01 , ＊＊＊P<0.001。
416 海南医学院学报 Vol.13 No.5 Oct.2007
　　由表 4 可以看出 ,正常大鼠血清含有微量的
VEGF ,接种 U 14肿瘤 7 d 、14 d 后 ,模型组血清中
VEGF 含量显著增高 ,与空白组相比有极显著统计
学意义(P<0.001);环磷酰胺组与模型组相比无统
计学意义(P >0.05),提示环磷酰胺对 V EGF 无显
著影响;土槿皮总萜各剂量组与模型组比较血清中
VEGF 量显著降低 ,有显著统计学意义(P <0.05),
土槿皮总萜各剂量组之间比较无统计学意义(P >
0.05),提示土槿皮总萜各剂量均可以降低肿瘤小鼠
血清中异常增高的 VEGF 的量 。
3　讨论
研究结果发现 ,土槿皮总萜能抑制 U 14小鼠
宫颈癌瘤体的生长 ,造模给药 7 d和 14 d均能够产
生肿瘤抑制生长作用 ,特别是造模给药 7 d 中剂量
组和造模给药 14 d低剂量组 ,肿瘤抑制生长率分别
达到了 53.72%和 40.63%, 接近和高于传统化疗
药物环磷酰胺;同时土槿皮总萜能显著抑制 U14 小
鼠宫颈癌肝 、肺转移;各给药组其肝 、肺转移结节数
显著低于模型组和环磷酰胺组 。土槿皮总萜对肿瘤
的抑制生长率和对转移结节的抑制能力在研究中没
有发现明显的量效关系 ,总体的表现是中剂量组强
于低剂量组 ,高剂量组的作用相对最低。这种现象
被称为双相剂量—反应曲线(Biphasic Dose-re-
sponse Curve)[ 4] 。它是 Folkman 进行的关于血管
内皮细胞生长因子单克隆抗体抗肿瘤生长转移的实
验研究以及相应的临床研究中发现的 ,在这种现象
中 ,药物的高剂量并不一定意味着高药理活性 。这
意味着最佳的药物使用剂量在这类药物的研究中的
作用是至关重要的。
研究结果显示 ,环磷酰胺和土槿皮总萜无论是
在造摸给药7 d还是14 d都具有明显的肿瘤抑制生
长的作用 ,但对肝 、肺转移结节形成数目的影响表现
出很大的差异。环磷酰胺有很好的肿瘤抑制生长作
用 ,但对转移结节的抑制能力明显低于土槿皮总萜 ,
同时由于具有明显的细胞毒作用 ,长期使用对实验
动物的一般状况和生存率影响很大。这些均提示两
者抗肿瘤作用的机制是有较大的差别 。
ELISA 结果显示荷瘤动物血清中血管内皮细
胞因子(VEGF)的含量在模型组和环磷酰胺组都维
持在一个较高的水平 ,而在各土槿皮总萜给药组含
量明显降低 。VEGF 是体内主要的促进新生血管
形成的因素 ,其浓度的高低和血管生成直接相关[ 6] 。
VEGF 同时具备增加小血管通透性的能力 ,大量蛋
白质等结构物质在间质堆积 ,形成所谓的肿瘤性血
管床基膜 ,血液的逐渐流入 ,形成了与肿瘤有关的新
生毛细血管网 。新的血管的形成 ,为原发灶肿瘤组
织的进一步膨大提供了代谢上的可能 ,同时也为恶
性肿瘤的浸润性生长和远隔部位转移创造了条
件[ 1] 。
研究结果提示 ,土槿皮总萜可能通过一定的机
制调节器官 、组织或细胞产生 VEGF 的能力 ,通过
减少 VEGF 的浓度 ,从而达到抑制新生血管生成的
目的 。我们认为这可能是土槿皮总萜能够显著抑制
肿瘤组织生长和转移的重要机制 。
参考文献
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(责任编辑　崔蓉)
关于数字的用法
在各种出版物上数字的用法总的原则是:凡是可以使用阿拉伯数字 ,而且又很得体的地方均应使用阿拉
伯数字。以下两种情况必须使用阿拉伯数字:
1公历世纪 、年代 、年 、月 、日和时刻　例如:公元前 5世前 、20世纪 90年代 、1995年 6月 8日 14时30分。
表示年份要写全称 , 1995年不能写成 95年或95′年;1953—1958年不能写成 1953 —58年 。年月日可以
写成 1995-06-08。时刻用“ .”分隔的形式。如:13时 45分 8秒可以写成 13∶45∶08。
(本刊编辑部)
417代勇等.土槿皮总萜抗肿瘤生长与转移作用的实验研究