全 文 ：收稿日期:2005-10-18;　修订日期:2006-01-22
基金项目:西部地区高等学校高级访问学者计划资助项目
　　　　 吉林省中医药管理局项目(No. 2004-111)
　　　　 吉林省教育厅基金项目(No. 2004 - 004)
作者简介:陈丽艳(1974-),女(汉族),吉林汪清人 ,现任延边大学医学院
讲师 ,硕士学位 ,主要从事肿瘤生物化学研究工作.
珍珠梅提取物对 S180小鼠血管内皮生长因子及血管生成素蛋白 - 1表达的影响
陈丽艳1 , 柳明洙 1 , 张　琚 2 , 张学武1
(1.延边大学医学院 ,吉林 延吉　133000;　2.南开大学医学分子生物学研究所 ,天津　300073)
摘要:目的 研究珍珠梅水提物对 S180荷瘤小鼠体内血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素蛋白 - 1(Ang-1)蛋白表达的
影响。方法 取 60只小鼠复制 S180荷瘤模型 ,随机分成 5组:珍珠梅水提取物大 、中 、小剂量组 , 对照组 ,环磷酰胺组。观
察珍珠梅水提取物对 S180荷瘤小鼠的抑制率;应用免疫杂交方法检测肿瘤组织中 VEGF、Ang-1蛋白的表达。结果 珍珠
梅水提取物对 S180荷瘤小鼠有明显的抑制作用(P <0. 05),免疫杂交结果显示 , 珍珠梅水提取物可以明显降低 VEGF蛋白
在肿瘤组织中的表达(P <0. 05);Ang - 1的表达在各组中无显著性差异。结论 珍珠梅水提物可以抑制 S180荷瘤小鼠的
肿瘤生长 , 下调 VEGF蛋白在肿瘤组织中的表达 ,抑制肿瘤血管生成。
关键词:珍珠梅;　S180荷瘤;　血管内皮生长因子;　血管生成素蛋白 - 1
中图分类号:R285. 5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2006)05-0688-02
E ffect of Sorbaria sorbifolia Aqueous Extract on VEGF and Ang-1 Express ions in
S180 M ice
CHEN L i-yan1 , L IU M ing-zhu1 , ZHANG Ju2 , ZHANG Xue-wu1
(1. College ofMed icine, YanbianUniversity, Yanji, J ilin 133000 ,Ch ina;2. Institu te ofMed ica lMolecular B iol-
ogy ,NankaiUniversity, Tian jin , 300073, China)
Abstract:Objective To study the e ffects of Sorbaria sorbifolia aqueou s ex tract in S180 m ice and the probab le mechanism. Meth-
ods The S180 sarcom as was transplan ted in 60 m ice, then they w ere div ided random ly into 5 g roups to rece ive d iffe rent trea tm ent(h igh, m ed ium and low do se g roups of Sorbaria sorbifolia aqueous ex tract, cyc lophospham ide g roup, contro l g roup). The inhib i-
tion rates o f the tumo rwe igh tw ere ca lcula ted ou t, and the expression leve ls of VEGF and Ang-1 w ere assayed w ithW este rn B lo.t
R esu lts The aqueous extrac t o f Sorbaria sorbifolia cou ld increa se the levels o f the inhibition ra te s of the tum or we igh t in m ice. It
could m arkedly downregu la te the expre ssion of VEGF pro te in, compared w ith con tro l g roup (P <0. 05). Y et the expression o f
Ang-1 pro tein has no rem arkable diffe rence s in each g roup. C onc lusion It suggests that the aqueous ex tract of Sorbaria sorbifolia
has a m arked inhibito ry effect S180 m ice . Them echanism s m ay be re la ted to inhibiting the expression of VEGF.
Key words:Sorbaria sorbifolia;　S180;　Vascular endo the lia l g row th facto r;　Angiopo ietin -1
　　长白山珍珠梅 Sorbaria sorbifolia 属蔷薇科植物 , 又称 “山高
粱” “八木条”, 在我国分布广泛 , 民间有活血化瘀 , 消肿止痛 , 治
骨折 、跌打损伤的作用。 近年研究表明 ,珍珠梅提取物对亚硝酸
钠和四氯化碳所致大鼠急性肝损伤及大鼠癌前病变具有一定的
保护作用 , 并具有抗炎 、镇痛 、耐缺氧及抗疲劳作用 [ 1 ～ 3] 。
肿瘤的血管生成是肿瘤生长 、侵袭和转移的基本条件。肿瘤
组织可分泌多种促血管形因子 ,其中血管内皮生长因子(VEGF)
目前被认为是最重要的因子之一 ,在生理及病理条件下 , 具有很
强的促血管形成作用 , 能调节血管内皮细胞的多种生物学功能。
本次实验拟从肿瘤血管生成角度初步探讨珍珠梅水提物对 S180
荷瘤小鼠的作用机制 。
1　材料与方法
1. 1　实验动物与瘤株 昆明种小鼠 , 雄性 , 体重 18 ～ 22g, 由延边
大学医学院动物科提供;S180瘤株由延边大学肿瘤研究中心提供。
1. 2　主要试剂与仪器 珍珠梅茎 、叶 、花 , 采集于吉林省延吉市市
郊 , 经延边大学药学院刘永镇教授鉴定为正品。 VEGF兔抗鼠一
抗 , Ang-1兔抗鼠一抗购自晶美生物公司;辣根过氧化物酶标记
的羊抗鼠 IgG购自美国 B IO - RAD公司;化学发光底物 (Supe r-
S ignal RW est P ico Chem ilm inescent Substa te )为 PIERCE 公司产
品;其它试剂均为国产分析纯。
1. 3　S180荷瘤小鼠模型的建立 无菌条件下取传代第 5天的 S180
小鼠腹水 ,用 0. 9%生理盐水以 1∶3稀释至含瘤细胞 2×106个 /
m l, 分别取 0. 2 m l接种于小鼠左前肢外侧皮下 ,制成荷瘤小鼠模
型。将 60只小鼠随机分为 A, B, C , D, E 5组 , 每组 12只。 A、B、
C为珍珠梅大 、中 、小剂量组 , D组为阴性对照组 , E组为环磷酰
胺组。
1. 4　给药方法 接种后于第 2天给药 , A, B, C组每天按珍珠梅水
提物 0. 5, 0. 25, 0. 125 g /kg灌胃 , D组:每天灌胃生理盐水 0. 2
m l /只 , E组:按 0. 02 g /kg剂量隔天腹腔注射环磷酰胺 ,各组小鼠
连续给药 10 d。停药后第 2天称量小鼠体重 , 取小鼠肿瘤组织 ,
并分别称重。标本置于低温冰箱中保存 ,待行指标测定。
1. 5　肿瘤生长抑制率测定 采用下列公式计算:
抑瘤率 =(对照组瘤重 -实验组瘤重) /对照组瘤重 ×100%
1. 6　肿瘤组织中 VEGF, Ang-1蛋白表达的测定
1. 6. 1　组织总蛋白的提取 肿瘤组织置于冰块上 , 加入 0. 5 ～
1. 0 m l细胞裂解液 RIPA。用眼科剪剪成匀浆样 , 4℃下放置
30 m in, 中间轻轻振荡 , 在 4℃下以 15 000r /m in离心 20～ 30 m in,
将上清液转至另一新管中 , B radford法测蛋白浓度。并贮存于
-80℃。
1. 6. 2　电泳及转膜 配制 4%浓缩胶及 10%分离胶 , 将凝固好的
胶置于电泳槽内 , 蛋白样品上样量约为 10mg, 开始用 30 ～ 40 V
电压进行电泳。当样品由浓缩胶进入分离胶后 ,改变电压 , 调至
100 V左右。电泳结束后 , 将组装好的滤纸 /膜 /凝胶三明治放入
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时珍国医国药 2006年第 17卷第 5期 LISH IZHEN MED IC INE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2006 VOL. 17 NO. 5　
转膜电泳槽中 , 以转膜缓冲液浸没三明治 , 稳流 120 mA , 1 h。
1. 6. 3　封闭及显色 转膜完毕后 , 将凝胶用考马斯亮兰染色 、脱
色均同常规蛋白检测 , 以检验转膜效率。将膜浸入封闭液内 ,室
温封闭 1-2 h。一抗 4℃过夜(兔抗鼠 VEGF稀释倍数为 1∶200,
兔抗鼠 Ang-1稀释倍数为 1∶1 000), 室温 1×TBST洗涤 6次 ,
10 m in /次。二抗(羊抗兔 ,用抗体稀释液 1∶10 000稀释)。室温
孵育 1 h,室温 1×TBST洗涤 6次 , 10 m in /次。将膜浸入化学发
光底物工作液中 , 显色 5 m in,控干液体 , 包在保鲜膜里 ,在暗室中
夹入 X光片 ,自显影 1 m in。
1. 7　统计处理 数据均以 –x±s表示 ,应用 SPSS l1. 0统计软件进
行方差分析。
2　结果
2. 1　珍珠梅水提取物对小鼠 S
180
肉瘤的抑制率 表 1为各组 S
180
荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率。从表中可以看出珍珠梅大 、中剂量组及
环磷酰胺组与对照组的小鼠瘤重相比较 , 均有显著性差异
(P <0. 05)。抑瘤率分别为 52. 3%, 51. 0%, 46. 0%。
表 1　珍珠梅水提取物对小鼠 S180肉瘤的影响(–x±s)
组别 n 瘤重 m /g 抑瘤率(%)
高剂量 10 1. 69±0. 43* 52. 3
中剂量 14 1. 73±0. 68* 51. 0
低剂量 14 2. 11±0. 59 40. 3
对照 11 3. 54±0. 60
环磷酰胺 11 1. 90±0. 61* 46. 0
　　与对照组比较 , *P <0. 05
2. 2　VEGF及 ANG-1蛋白在肿瘤组织中的表达 图 1为 VEGF
在各组小鼠 S180肿瘤组织中表达的 w estern blo t结果。图 2是对
图 1中各条带进行密度扫描分析 , 所得 VEGF相对表达率的直方
图。 (a)为 VEGF(38KD) (b)为 Tub lin(55KD),泳道 1-5分别为
珍珠梅大 、中 、小剂量组 , 阴性对照组 , CTX组。由图可知 , VEGF
在珍珠梅大 、中剂量组小鼠瘤组织中的表达与对照组比较 , 有显
著性差异(P <0. 05)。
图 1　肿瘤组织中 VEGF的 W es tern blot检测
图 2　珍珠梅水提物对肿瘤组织中 VEGF表达的影响
图 3为 Ang - 1在各组小鼠 S180肿瘤组织中表达的 weste rn
b lo t结果。图 4是对图 3中各条带进行密度扫描分析 , 所得Ang-1
相对表达率的直方图。 (a)为 Ang-1 (55KD), (b)为 GAPDH
(35KD),泳道 1-5分别为珍珠梅大 、中 、小剂量组 , 阴性对照组 ,
CTX组。 Ang-1在各组小鼠 S
180
肿瘤组织中表达没有显著性
差异。
图 3　肿瘤组织中 Ang -1的 Western b lot检测
图 4　珍珠梅水提物对肿瘤组织中 Ang - 1表达的影响
3　讨论
本研究结果显示 ,珍珠梅各给药组 S
180
肉瘤的生长均受到抑
制 , 大 、中 、小剂量组的肿瘤抑制率分别为 52%, 51%和 40%, 肿
瘤重量与对照组比较 P <0. 05,并且随着珍珠梅水提物浓度的增
加 , 抑制作用有增强的趋势。
VEGF在正常成人和动物的很多组织中表达 , 但一般水平很
低。在病理条件下 , 尤其是恶性肿瘤组织中 , VEGF往往是过量
表达。目前研究认为 VEGF作用于血管形成早期 , 促进原始血管
网形成;而 Ang-1则作用于随后的血管改建 、塑形 , 促进形成成
熟 、有空间结构的血管网 [ 4] 。有研究表明:正常肺组织中 , Ang-1
表达高 ,而 VEGF, Ang-2水平低;而在非小细胞肺癌中 , Ang-1表
达明显降低 , 其中 Ang-2在肿瘤血管中表达显著增高 , VEGF则
在瘤细胞中表达增高。 H ayes等 [ 5]研究也表明 Ang-1能抑制异
种种植肿瘤(xenog raft)的生长 , 说明 Ang-1对肿瘤发展有负面效
应。本实验免疫印迹结果表明珍珠梅水提取物能够显著降低小
鼠肿瘤组织 VEGF蛋白含量 , 但对 Ang-1的表达无明显的影响作
用。珍珠梅水提取物对 Ang-2的影响及作用机理将有待于进一
步研究 。
参考文献:
[ 1 ] 　金海玲 ,张学武 ,赵　红 ,等.珍珠梅对四氯化碳所致大鼠急性肝损
伤的保护作用 [ J] .世界华人消化杂志 , 2002, 10(7):783.
[ 2 ] 　张学武 ,金园哲 ,刘　超.珍珠梅提取物抗炎 、镇痛 、耐缺氧及抗疲
劳作用的研究 [ J] .陕西中医 , 2004, 25(11):1043.
[ 3 ] 　张学武 ,张学斌.珍珠梅提取物对 DEN所致大鼠肝癌前病变抑制
作用的研究 [ J] .中国实验方剂学杂志 , 2004, 10(4):33.
[ 4 ] 　H olash J, W iegand SJ, Y ancopou losGD. New m odel of tum or ang io-
genes is:dynam ic balance betw een vessel regression and grow th m ed ia-
ted by angiopoietins and VEGF. [ J ] . Oncogene, 1999, 18
(38):5356.
[ 5 ] 　H ayes AJ, HuangWQ , M allah J, et a.l Angiopoietin - 1 and its recep-
tor T ie - participate in th e regu lation of cap illary - like tubu le format ion
and su rvival of endoth elial ce lls. [ J] . M icrovasc Res, 1999, 58
(3):224.
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