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齐墩果酸和绿原酸对 HepG2 细胞及 P450 酶的影响
汤 浩1，2* ， 刘晓莉2， 王 锐2， 高庆剑2， 陆 铖2， 孙志博3
(1. 甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000;2. 宁夏医科大学药学院药理系，宁夏 银川 750000;3. 兰
州大学基础医学院遗传所，甘肃 兰州 730000)
收稿日期:2013-05-12
基金项目:甘肃省技术研究与开发专项计划 (1105TCYA024) ，兰州市科技计划项目 (2010-1-72)。
作者简介:汤 浩，女，副主任药师，硕士生导师，从事医院药学和中药新药开发研究。Tel:(0931)8281682，E-mail:gsgg-th@ sina. cn
摘要:目的 观察齐墩果酸和绿原酸对 HepG2 细胞增殖、周期变化及 CYP相关基因表达的影响。方法 以利福平为
对照，采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法、流式细胞术、实时定量 PCＲ 技术检测，测定不同质量浓度齐墩果酸、
绿原酸的作用。结果 齐墩果酸、绿原酸对 HepG2 细胞增殖有明显抑制作用，阻滞 HepG2 细胞停留于 S 期。齐墩果
酸和利福平均能诱导 CYP1A1 和 CYP3A4 表达。绿原酸抑制 CYP1A1 和 CYP3A4 表达。结论 齐墩果酸、绿原酸均能
影响细胞周期来抑制 HepG2 细胞生长，并显示不同质量浓度对 CYP1A1、CYP3A4 mＲNA的表达影响不一致。
关键词:齐墩果酸;绿原酸;HepG2 细胞系;细胞增殖;细胞周期;细胞色素 P450 酶
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2013)12-2576-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2013. 12. 005
Effects of oleanolic acid and chlorogenic acid on HepG2 cells and P450
enzyme expression
TANG Hao1，2* ， LIU Xiao-li2， WANG Ｒui2， GAO Qing-jian2， LU Cheng2， SUN Zhi-bo3
(1. Department of Pharmacy，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，China;2. Pharmacy College，Ningxia Medical University，Yinchuan 750000，
China;3. Genetic Institute，School of Basic Medicine，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)
ABSTＲACT:AIM To investigate the effects of oleanolic acid and chlorogenic acid on proliferation and cell cycle
of HepG2 cells and its relative CYP450 genes expression． METHODS Ｒifampicin as the control drug，the MTT
method，Flow cytometry，and Ｒeal time quantitative PCＲ technique were used in this study． ＲESULTS Chloro-
genic acid and oleanolic acid could inhibit cell proliferation of HepG2 cells，and arrest cell cycle at S stage． Olean-
olic acid induced CYP1A1，CYP3A4 mＲNA ，but chlorogenic acid inhibited CYP1A1． CONCLUSION Olean-
olic acid and chlorogenic acid can inhibit the proliferation of HepG2 cells，but show inconsistent effects on drug
metabolic enzyme CYP1A1，CYP3A4 mＲNA expression．
KEY WOＲDS:oleanolic acid;chlorogenic acid;HepG2 cells;proliferation;cell cycle;cytochromae P450
人体内主要药物代谢酶是细胞色素 P450 家族，
其中 CYP1A1、CYP3A4 是主要的诱导酶，前者能
催化许多前致癌物转化为致癌物［1］，后者代谢
60%临床常用药物［2］，它们是药物代谢 /毒理学的
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重要指标。齐墩果酸临床上主要用于治疗急性黄疸
型和慢性中毒性肝炎，并作为抗癌辅助药物。经研
究齐墩果酸具有保肝作用［3-4］，并且能够诱导肝癌
细胞 HepG2 细胞的凋亡［5］。绿原酸具有广泛的药
理和生理活性，主要存在于杜仲，金银花等植物
中。有文献报道，绿原酸具有抗肝纤维化和肝损伤
的作用［6］，绿原酸对小鼠急性肝损伤的保护作
用［7］，利福平是肝脏 CYP450 酶某些同工酶的诱导
剂和抑制剂，影响其他药物代谢［8］。因此本实验
选取齐墩果酸和绿原酸为研究对象，探讨它们对
HepG2 细 胞 增 殖、细 胞 周 期、 CYP1A1mＲNA、
CYP3A4 mＲNA的影响。
1 材料和方法
1. 1 材料 齐墩果酸和绿原酸均购自中国药品生
物制品检定所，供定量测定用。利福平 (上海化
学试剂有限公司)。采用二甲基亚砜 (DMSO)助
溶，DMSO 在细胞液中的终浓度不超过 0. 1%。
TaKaＲa ＲNAiso Plus购自宝生物工程 (大连)有限
公司;Ｒever Ace qPCＲ ＲT Master Mix 购自 TOYO-
BO公司;实验所用引物用 Primer Premier 5. 0 软件
设计，委托上海生工合成;新生牛血清购自 PAA
公司;噻唑蓝 (MTT，美国 Sigma 公司)。一次性
细胞瓶 (5 × 5 cm2) ，细胞培养皿 (100 mm) ，96
孔细胞培养板全部购自 NUNC公司。
1. 2 仪器 超净台，细胞培养箱，ABI7500 实时
荧光 PCＲ，梯度 PCＲ 测定仪 (购自 PCＲ 公司) ，
高速低温离心机 (SIGMA 公司) ，核酸蛋白测
定仪。
1. 3 HepG2 细胞株人肝癌细胞 HepG2 为本实验
室保存。HepG2 接种于含 10%新生牛血清、抗生
素 (100 U /mL 青霉素和 100 μg /mL 链霉素)的
DMEM高糖培养基中。HepG2 细胞培养环境:5%
CO2、37 ℃、相对湿度 90%。HepG2 细胞取对数
生长期细胞用作实验。
1. 4 MTT方法 取对数生长期细胞，调整密度为
5 × 104 个 /mL接种于 96 孔板中，100 μL /孔，16 h
后加入含不同质量浓度齐墩果酸、绿原酸和利福平
的培养基，药物终质量浓度为 200、100、50、25、
12. 5、6. 25 μg /mL，每个质量浓度设 5 个复孔，
同时设空白对照组和正常细胞生长组，药物作用
24 h 后，加入 5 mg /mL MTT，20 μL /孔，继续培
养 4 h后弃上清，加入 DMSO 150 μL /孔溶解，震
荡混匀 10 min，在酶联免疫检测分析仪上测定
A490 nm值。按以下公式计算药物细胞生长抑制率，
实验以 3 次平行实验数据为最终结果。
细胞生长抑制率 = (1 － A实验 /A对照)× 100%
1. 5 细胞周期测定 取对数生长期的细胞，按
1 × 106个 /瓶接种于一次性细胞培养瓶，培养 16 h
后，用 PBS 清洗两遍，加入含不同质量浓度药物
齐墩果酸和绿原酸的培养基，药物质量浓度分别为
100、50、25 μg /mL，阳性对照利福平 10 μg /mL，
继续培养 24 h 后，胰蛋白酶消化成单细胞液，收
集细胞，用 PBS 洗涤细胞后，加入 300 μL PBS，
再加入 － 20 ℃ 预冷的无水乙醇 700 μL，混匀，
－ 20 ℃冰箱固定 24 h 以上，离心洗涤细胞后，加
入终质量浓度 20 μg /mL 的 ＲNA 酶，置于 37 ℃水
浴 30 min，接着加入 50 μg /mL PI 300 μL避光染色
30 min，300 目筛网过滤，2 h内流式细胞仪分析细
胞周期。
1. 6 齐墩果酸和绿原酸对 HepG2 细胞中 CYP1A1、
CYP3A4 mＲNA表达的影响
1. 6. 1 分组 实验组，齐墩果酸和绿原酸质量浓
度为 100、50、25 μg /mL;阴性对照组，正常细胞
生长组，阳性对照利福平 10 μg /mL。
1. 6. 2 ＲNA的提取和 cDNA 的合成 细胞接种于
一次性细胞培养瓶，16 h 后吸取旧的培养基，用
PBS清洗两遍，加入含不同质量浓度两种药物的培
养基，药物作用时间为 24 h。用 ＲNAiso Plus 试剂
盒提取 ＲNA 之后，用核酸蛋白测定仪检测 A260 /
A280比值，鉴定 ＲNA 的纯度。ＲNA 溶解于 15 μL
ＲNse-free H2O 中，5 μL 用于测定 ＲNA 的纯度，
8 μL用于反转录。反转录体系为 5 × ＲT Master Mix
2 μL，ＲNA 溶解液 8 μL，反转录总体积 10 μL。
反转录的条件为 37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃
5 min，反转录产物 4 ℃保存。
1. 6. 3 实时荧光 PCＲ 反应 将反转录产物 10 倍
稀释后作为 PCＲ 反应模板，PCＲ 的反应体系为:
1 μL稀释液，上下游引物 10 μmol /L (表 1)各
1 μL，2 × SYBＲ Green I 12. 5 μL，添加高压灭菌的
三蒸水至终体积 25 μL，混匀。反应条件:起始
95 ℃ 5 min，扩增时 95 ℃ 15 s，60 ℃15 s，72 ℃
45 s 循环 40 次，溶解曲线分析。以 GADPH 为内
参，进行 PCＲ扩增产物的实时定量分析。
实时定量 PCＲ 数据采用比较阈值法进行相对
定量分析。计算方法:目的基因诱导或抑制倍数 =
2 － ΔΔCt，Ct值是热循环仪中荧光达到阈值循环数，
ΔΔCt =实验组 ΔCt (目的基因 Ct －内参基因 Ct)
－对照组 ΔCt (目的基因 Ct －内参基因 Ct)。计算
每一个标本目的基因的拷贝数。
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表 1 实时荧光 PCＲ引物
Tab. 1 Sequence of primer used in real-time PCＲ
基因 正向引物 反相引物
GADPH GAGTCAACGGATTTGGTC GACAAGCTTCCCGTTCTC
CYP1A1
GGCGTTGTGTCTTTGTAAAC-
CA
AGGTAGGAACTCAGATGG-
GAC
CYP3A4 CTGTGTGTTTCCAAGAGAAGT
TGCATCAATAATTTCCTC-
CTG
1. 7 数据统计学分析 所有试验数据用 SPSS 17. 0
统计学软件进行统计学分析，数据均用“x ± s”表
示，采用单因素方差分析。
2 结果
2. 1 齐墩果酸和绿原酸对 HepG2 细胞增殖的影响
MTT实验结果表明，随着齐墩果酸和绿原酸质
量浓度的增大，对 HepG2 细胞抑制率明显升高，
并且具有明显的剂量依赖关系。质量浓度低于 50
μg /mL时，绿原酸对 HepG2 细胞的抑制作用比齐
墩果酸强，但质量浓度高于 50 μg /mL，齐墩果酸
对HepG2的抑制作用明显高于绿原酸。在50 μg /mL
时，两种药物的抑制率相同。利福平 6. 25 ～ 200
μg /mL对 HepG2细胞的抑制作用都在 40%左右，抑
制作用较强。在下述细胞周期和实时荧光定量 PCＲ
实验中选择药物处理质量浓度为 100、50 和 25
μg /mL，阳性对照利福平 10 μg /mL。观察齐墩果
酸、绿原酸和利福平对 HepG2 细胞周期和 CYP1A1
mＲNA、CYP3A4 mＲNA表达的影响。见图 1。
注:与对照组相比，* P ＜ 0. 01，＊＊P ＜ 0. 05
图 1 齐墩果酸、绿原酸和利福平对 HepG2 细胞增殖
的影响
Fig. 1 Effect of oleanolic acid，chlorogenic acid and
rifampicin on proliferation of HepG2 cells
2. 2 流式细胞术测定 3 种质量浓度齐墩果酸和绿
原酸对 HepG2 细胞周期的影响 经 3 种药物不同
质量浓度药物处理后，HepG2 细胞各时期细胞数
占细胞总数的百分比与正常对照组相比较，有些细
胞周期分布发生了明显变化。齐墩果酸 25 μg /mL
和绿原酸 50、25 μg /mL、阳性对照利福平 10
μg /mL均对细胞周期没有明显影响。齐墩果酸的
100、50 μg /mL和绿原酸的 100 μg /mL均对 HepG2
细胞周期 S期发生了明显阻滞。见图 2。
图 2 不同质量浓度齐墩果酸、绿原酸对 HepG2 细胞周期的影响
Fig. 2 Different concentrations of oleanlic acid and chlorogenic on the cell
cycle of HepG2 cells
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2. 3 实时荧光 PCＲ检测两种药物不同质量浓度对
HepG2 细胞中 CYP1A1 mＲNA表达的影响 实验结
果显示，齐墩果酸在 3 个质量浓度均可明显诱导
HepG2 细胞中 CYP1A1 mＲNA表达，给药质量浓度
从大到小诱导倍数依次为 2. 48、1. 45、2. 34。绿
原酸 3 个质量浓度均可明显抑制 HepG2 细胞中
CYP1A1 mＲNA表达，给药质量浓度从大到小抑制
倍数依次为 1. 91、0. 61、2. 82，阳性对照利福平
10 μg /mL的诱导倍数为 2. 3 相对较弱。见图 3。
注:与对照组相比，* P ＜ 0. 01，＊＊P ＜ 0. 05
图 3 齐墩果酸、绿原酸和利福平对 HepG2 细胞
CYP1A1 mＲNA表达的影响
Fig. 3 Effect of oleanolic acid，chlorogenic acid
and rifampicin on the expression of in
CYP1A1 mＲNA HepG2 cells
2. 4 实时荧光 PCＲ检测两种药物不同质量浓度对
HepG2 细胞中 CYP3A4 mＲNA表达的影响 实验结
果显示，齐墩果酸在 3 个质量浓度均可明显诱导
HepG2 细胞中 CYP3A4 mＲNA表达，给药质量浓度
从大到小诱导倍数依次为 1. 17、2. 42、8. 40。绿
原酸 100、50 μg /mL 均可抑制 HepG2 细胞中
CYP3A4 mＲNA 表达，抑制倍数依次为 0. 65、
1. 00，绿原酸 25 μg /mL HepG2 细胞中 CYP3A4
mＲNA表达可明显诱导 HepG2 细胞中 CYP3A4 mＲ-
NA表达，诱导倍数为 0. 59，诱导相对较弱，阳性
对照利福平 10 μg /mL 能显著诱导 HepG2 细胞中
CYP3A4 mＲNA表达，诱导能力较强。见图 4。
3 讨论
药物代谢酶在药物的代谢解毒和代谢活化中起
着重要的作用［9］。研究中药成分对 CYP 的影响，
为预测有关中西药之间相互作用，提高中药有效成
分的有效性和安全性具有重要意义。
齐墩果酸和绿原酸是一种天然药物，国内对其
提取分离及药理作用研究较多，但很多作用机制尚
处于研究探索阶段［10］。因此，进一步研究两种药
注:与对照组相比，* P ＜ 0. 01，＊＊P ＜ 0. 05
图 4 齐墩果酸、绿原酸和利福平对 HepG2 细胞
CYP3A4 mＲNA表达的影响
Fig. 4 Effect of oleanolic acid and chlorogenic acid
and rifampicin on the expression of in
CYP3A4 mＲNA cells HepG2
物抗肿瘤机理及其药物的体外代谢，显得很有意
义。HepG2 细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性
特征，最大的优点是保留了一系列生物转化过程中
的Ⅰ相和Ⅱ相酶，是研究和评价防治肝癌药物的较
理想细胞模型。
MTT实验结果表明，200 ～ 6. 25 μg /mL齐墩果
酸和绿原酸均可抑制肝癌细胞 HepG2 生长，50
μg /mL时，两种药物的抑制率相同，说明齐墩果
酸和绿原酸是潜在防治肝癌的中药制剂，利福平在
一定范围能显著抑制肝癌细胞生长。细胞周期在肿
瘤的生长调控中具有重要的作用，通过改变细胞周
期来阻止肿瘤细胞的无限增殖已受到人们的关
注［11］。细胞周期的调节主要发生在 2 个重要阶段:
G1-S期和 G2-M期。齐墩果酸和绿原酸的有效质量
浓度处理 HepG2 细胞，使 S 期细胞显著降低，两
种药物有可能通过影响细胞周期而抑制细胞生长。
近年来认为 CYP1A1 活化苯并芘等多种多环芳
烃化合物使其致癌［12］，并且 CYP1A1 的诱导能力
是作为评价致癌性的重要指标。本研究发现，齐墩
果酸和绿原酸的三个有效质量浓度均能诱导的
CYP1A1 mＲNA 表达，由于齐墩果酸和绿原酸对
CYP1A1 的诱导是否可能增加机体对毒性物质代谢
发生变化，对机体造成一定的损害，长期服用含齐
墩果酸和绿原酸的药物是否对机体有潜在的毒副作
用，对药物代谢性相互作用的影响，有待于进一步
实验研究。
CYP3A4 可同时氧化代谢多种药物，导致药效
的增强 (降低)或毒副作用的增加［13］。由于其代
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谢的广泛性，进一步影响了药物的药效学和毒理
学。本实验结果显示，齐墩果酸高、中、低 3 个质
量浓度是 CYP3A4 的诱导剂，而绿原酸的低质量浓
度是 CYP3A4 的抑制剂，两种药物与其他药物合用
时，能够影响其他药物的血药浓度和生物利用度，
对药物相互性作用的影响有待于进一步研究，利福
平是肝癌细胞的强诱导剂。有相关文献报道［4-15］，
齐墩果酸能抑制肝癌细胞 SMC-7721、Hep3B 的增
殖和诱导其凋亡。
综上所述，本实验分析了齐墩果酸和绿原酸对
HepG2 细胞周期和两种 CYP450 酶的诱导作用。本
实验结果初步证明齐墩果酸和绿原酸对 CYP450 酶
系的诱导作用，实验结果为中西药代谢相关性提供
了体外实验的数据支持。两种药物体内是否也存在
CYP450 酶的诱导或者抑制作用，有待于进一步的
实验研究。
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